精细质控分析

治疗性单克隆抗体结构相对小分子更加复杂。不仅仅是序列影响蛋白活性，同时蛋白的翻译化修饰也会影响。常见的修饰包括脱酰胺、二硫键、末端赖氨酸丢失和糖基化修饰，糖基化修饰是相对复杂的特殊翻译后修饰，包括N糖修饰和O糖修饰，N糖基化修饰主要发生在蛋白质一级结构中的特征性序列NXT(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)，修饰存在一定规律，O糖修饰可以与任何含有羟基基团的氨基酸连接，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)是最常见的修饰位点，因此更加复杂。糖型结构会显著影响治疗效果，是单抗药物质量监测的重要关键质量属性。 抗体生物类似药在面临生产和临床过程中，需要保证质量的一致性，糖基化分析是重要的关键分析流程。糖修饰异质性会间接影响药效，因此需要在多批次生产过程中，保证工艺和质量的稳定性。N糖根据不同的连接方式使得N-糖基化的五糖核心结构分为高甘露糖型、杂合型和复杂型3 种类型，FDA，EMA 等生物类似药指导原则都鼓励研发单位采用最新的分析技术手段，对生物类似药和原研药的糖基化修饰位点、程度以及寡糖的组成进行深入比较分析，例如可以利用岛津液相以及质谱等设备可进行由浅入深的糖型修饰分析，进而对产品生产过程中严格监测。岛津在糖基化分析方面有三大护法守护。下面一一道来。 岛津抗体糖型分析质控解决方案 第一护法-高分辨质谱LCMS-9030 LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪使高速度、高灵敏度的四极杆质谱与TOF技术的紧密结合。融合岛津先进工程技艺的DNA，打造出速度与出色性能兼备的全新一代高分辨质谱仪，以优异表现轻松胜任定性和定量分析挑战。对完整蛋白以及亚基水平的糖型进行初步分析。 第二护法-MALDI-MSMALDImini-1 MALDImini-1数字离子阱（DIT）体积极小，功能强大，可实现质谱多级的检测。针对糖肽分析、抗体化学修饰位点、未知生物分子结构分析，蛋白质、多肽、翻译后修饰肽等都有专向解决方法。 第三护法-高效液相色谱系统Nexera Bio 从完整蛋白或者亚基水平分析，利用质谱可快速的分析带有糖基化修饰蛋白分子量。可以分析简单的糖型结构，速度比较快，重现性较好，但是精细的糖型结构也不能很好的监测清楚，所以可以搭配糖肽水平和游离寡糖水平一同研究。 首先，第一步从完整蛋白水平，利用岛津LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪从完整分子量水平分析抗体的糖修饰情况如下表所示，鉴定并分析相关糖型的分布。 不同糖型抗体形式分子量测定结果与理论对比 第二步可以从糖肽水平分析，通常抗体通过使用蛋白酶酶切后，产生分子量大约为0. 5 ～ 5 kDa 的小肽，采用色谱或电泳分离后再进行MALDI-MS 或ESI-MS 分析。利用质谱分析糖肽序列、寡糖组成，岛津MALDI-TOF和MALDI-数字离子阱质谱可以分析相关糖肽组成分析。 例如针对血清糖蛋白，使用MALDI-离子阱质谱分析得到的衍生N-聚糖谱图，如下图所示：血清糖蛋白N-聚糖质谱解析谱图 第三步可以从游离寡糖层面分析，药典相关要求，针对游离寡糖的分析通常有三种方法: （第一法）亲水相互作用色谱法、（第二法）毛细管电泳法、（第三法）高效阴离子色谱法，通过N-糖苷酶F对单抗N糖进行酶切后，使用2-氨基苯甲酰胺( 2-AB) 或2-氨基苯甲酸( 2-AA) 对寡糖进行标记即可进行糖型分析。针对唾液酸分析，岛津超高效液相色谱结合荧光检测器建立了抗体中唾液酸Neu5Ac 和Neu5Gc 含量测定，结果如下图所示： 唾液酸液相分析定量标准曲线 单抗糖基化是作为重要的翻译化修饰，宿主细胞培养工艺过程会影响不同的修饰构成，岛津不仅可以提供糖基化质量分析质控方案，同时针对培养工艺优化以及工艺残留物监测，提供特色的培养监测在线和离线分析解决方案，为了更好地把握产品质量，力图让产品质量更加稳定和安全。虽然生物类似药与原研药批次糖基化修饰结构差异依然存在，但在生物类似药相似性评价和适应症外推的征途上还有许多路要走，岛津依旧陪伴左右。

在医药产品研发多样发展的今天，如何做出更健康有效的药物，推动医药产业健康发展？药物的分析与质控必须引起重视。为此，珀金埃尔默携手苏州百拓生物技术服务有限公司举办药物分析与质控研讨会，珀金埃尔默产品专家期待与各位行业专家现场交流药物研发过程中重金属分析解决方案、溶剂残留分析解决方案以及分子光谱技术在药物分析中的应用。为让优秀课堂惠及更多制药同仁，珀金埃尔默携手药视网对本次研讨会进行现场直播，敬请期待！ 2019年4月2日，B6幢2楼百拓众创空间，“药物分析与质控研讨会”，诚邀您来！会议地点：苏州生物医药产业园一期B6幢2楼百拓众创空间 会议费用：免费 扫描下方二维码即刻报名现场参会参加会议即可免费领取精美便携保温杯哦！若您无法现场参会，也可以通过线上直播的形式参与会议，直播报名方式：微信端：1.长按识别下图二维码，关注“药视网”公众号。2.点击下方“直播间”，选择直播所在的日期（本次直播为周二），进入报名页面，点击“我要报名”进行报名，成功报名的用户开播时再次进入即可观看。电脑端（强烈推荐）：复制下方链接至电脑浏览器，进入报名页面，点击“我要报名”进行报名，成功报名的用户开播时再次进入即可观看。https://www.ouryao.com/plugin.php?id=air_video&a=live&liveid=40 会议议程

伟业新品：土壤分析质控样品系列标准物质 土壤阳离子交换量是指土壤胶体所能吸附各种阳离子的总量。其数值以每千克土壤中含有各种阳离子的物质的量来表示，即mol/kg。土壤是环境中污染物迁移、转换的重要场所，土壤胶体以其巨大的比表面积和带点性，而使土壤具有吸附性。土壤的吸附性和离子交换性能又使它成为重金属类污染物的主要归属。土壤阳离子交换性能对于研究污染物的坏境行为有重大意义，它能调节土壤溶液的浓度，保证土壤溶液成分的多样性，因而保证了土壤溶液的“生理平衡”，同时还可以保持养分免于被雨水淋失。 阳离子交换是土壤比较重要的性质之一，是土壤本身的特有属性，主要原因就是土壤胶体的负电特性,其电荷分为可变电荷和固定电荷，当ph较低时（到达等电点时），整个性质就会发生变化，阳离子交换，顾名思义，负电荷的土壤胶体表面吸附有一些可交换态的阳离子如k、mg、ca等，当污染物特别是重金属类物质与土壤接触时，由于其于土壤胶体表面基团具有更强的结合能力，从而取代部分正电性基团，但是阳离子交换过程并不稳定，属于静电作用，因此自身并不稳定，如上述内容所说，易受ph影响，低ph条件下容易被淋洗。同时由于其具有很强的水溶性，因此生物有效性较高，容易被动植物吸收而贮藏在体内，是土壤化学反应较为活跃的一部分，受土壤环境影响较大。一、标准物质的制备本标准物质选择经筛查的土壤为基体，经过风干、去杂、研磨、混匀、过筛、灭菌而成。量值核验一致后在洁净干燥的实验室环境下分装。二、标准物质的检测本标准物质定值方法参照NY/T295-1995中性土壤阳离子交换量和交换性盐基的测定、LY/T 1243-1999 森林土壤阳离子交换量的测定，通过使用满足计量学特性要求的计量器具保证其量值溯源性。实验原理：用1mol/L乙酸铵溶液(pH7.0)反复处理土壤，使土壤成为NH+4饱和土。用乙醇洗去多余的乙酸铵后，用水将土壤洗入凯氏瓶中，加固体氧化镁蒸馏。蒸馏出的氨用硼酸溶液吸收，然后用盐酸标准溶液滴定。三、结论通过多次重复性实验的检测，产品的均匀性良好。经12个月长期稳定性研究结果表明有良好的稳定性，研制单位将继续跟踪监测该标准物质的稳定性，有效期内如发现量值变化，将及时通知上级主管部门与用户。四、应用领域本产品通常运用于土壤方面阳离子交换量、交换性盐基指标的检测。作为产品的质控分析样品，也可以用在环境土壤检测。五、注意事项需要注意的是，阴凉密闭及避光条件下保存。使用前应混匀，最小取样量为1.5g，并注意水分的影响。淋洗次数需合理，淋洗次数不够，不能把交换剂全部洗掉，淋洗过头会使易水解的被洗去产生误差，且不能超声提取。