内皮细胞

“世界心脏日今天9月29日是世界心脏日(World Heart Day)，是由世界心脏联盟确定，旨在世界范围内宣传有关心脏健康的知识，并让公众认识到生命需要健康的心脏。在全世界范围内，心血管疾病是威胁人类健康的高危病种，其危害无年龄、身份、地域之分。在中国，每年大约有260万人死于心脑血管疾病，死亡人数位列世界第二。《中国心血管健康与疾病报告2021》指出，每5例死亡中就有2例死于心血管病。急性心肌梗死(MI)是一种常见的由突发冠状动脉血栓形成和闭塞引起的心脏急症。急性心肌梗死期间持续的缺血组织损伤导致疤痕形成，进而可能心力衰竭。心肌梗死后形成的新血管可减轻疤痕和心功能恶化。然而心肌梗塞后形成血管生成和功能适应的细胞间的相互作用仍不完全清楚。下面跟随小编来看一下德国汉诺威医学院的研究人员今年发表在《Science》上的“心脏知识”。德国汉诺威医学院Kai C. Wollert研究团队发表题为Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase的研究。通过对急性心肌梗死的小鼠进行生物信息学分泌组分析，发现细胞因子METRNL(Meteorin-like) 在梗死边界区内皮细胞高度表达，促进心肌梗死后的血管生成、组织修复和功能适应。使用化学交联质谱法发现，KIT（受体酪氨酸激酶）是内皮细胞中METRNL细胞表面受体。为了评估METRNL是否与KIT的细胞外结构域结合，通过微量热泳动（MST）技术，检测到KIT-ECD-Fc可结合METRNL和SCF（KIT已知配体），并且亲和力很高（Kd分别是87nM和175nM）,而不与血管内皮生长因子A(VEGFA)结合。Pull Down实验获得相同的结果。图注：MST技术和Pull Down检测KIT的胞外结构域与METRNL，SCF和VEGFA结合随后，作者检测时发现METRNL的治疗会增强心肌梗死区域边缘的毛细血管化，限制瘢痕的形成并对心脏功能具有持续有益的影响。研究结果: 作者定义了一种基于METRNL的髓系细胞和内皮细胞之间的交叉信号，METRNL通过KIT依赖的信号通路介导内皮细胞的血管生成作用促进心肌梗死后组织修复，为急性心肌梗死的治疗提供了新的药物靶点。心脏是人体最重要的器官之一，无论工作或者科研再忙碌，一定要注意休息。马上就要国庆节了，让我们一起为劳苦功高的心脏放个假吧！文献参考：Reboll, Marc R., et al. "Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase." Science 376.6599 (2022): 1343-1347.*文内部分图片来源自百度，侵则删。

1月3日，国际学术期刊PNAS发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌组和复旦大学附属中山医院王立新教授合作的研究成果“Genetic dissection of intercellular interactions in vivo by membrane-permeable protein”。该研究利用表达膜透过性荧光蛋白的遗传工具小鼠，建立了体内邻近细胞标记技术，并利用该技术揭示了肝脏不同区域中内皮细胞的异质性。细胞之间的相互作用对于多细胞生物体生长发育、稳态维持以及损伤修复等过程至关重要，但是监测体内细胞互作的遗传学技术鲜有报道。当前的遗传学手段基本上是针对特定细胞自身进行操作，无法深入研究细胞之间的互作。因此，建立新型邻近细胞标记技术对了解生物体内细胞间互作及其功能具有重要意义。sLP-mCh是脂溶性标签连接mCherry的融合荧光蛋白(Ombrato et al., Nature 2019)。sLP-mCh在供体细胞中表达后，会从供体细胞中释放出去，并进入邻近细胞，将邻近细胞标记为mCherry+。基于sLP-mCh蛋白的特性，为了实现体内邻近细胞标记，研究人员构建了基因敲入小鼠：R26-sLP-mCh-GFP和R26-sLP-mCh。首先以小鼠肝细胞作为供体细胞，表达sLP-mCh和GFP，检测肝细胞周围的其他类型细胞标记情况。研究人员在R26-sLP-mCh-GFP小鼠体内注射特异靶向肝细胞的病毒AAV2/8-TBG-Cre，当病毒进入肝细胞后，Cre重组酶表达并发生Cre-LoxP重组，移除R26-sLP-mCh-GFP位点中间的终止序列，肝细胞启动表达sLP-mCh和GFP荧光蛋白，成为sLP-mCh的供体细胞。研究人员发现肝细胞为GFP+mCherry+，同时也能检测到GFP–mCherry+的非实质细胞，其中肝脏中80%内皮细胞、76%免疫细胞以及54%成纤维细胞被标记。研究人员将这种由Cre诱导的细胞间蛋白标记技术称作CILP。肝脏的基本单位是肝小叶，肝小叶可以分为三个区域(zone)，各区域的肝细胞具有不同特性以及分子标记。一区的肝细胞围绕着肝脏门静脉，高表达钙粘蛋白E（E-Cad）；三区的肝细胞围绕着肝脏中央静脉，高表达谷氨酰氨合成酶（GS）；肝小叶二区位于一区和三区之间，由E-Cad–GS–的肝细胞构成。肝脏中的毛细血管是一类特化的血管网络，称作肝血窦内皮细胞，肝血窦内皮细胞和肝细胞发生着紧密的相互作用，肝脏不同区域的肝细胞可能会受到内皮细胞不同程度的影响。研究人员然后以Mfsd2a+肝细胞为例阐明肝细胞及其邻近内皮细胞之间的互作。当用他莫昔芬诱导双基因型成体小鼠Mfsd2a-CreER R26-sLP-mCh后，Mfsd2a+肝细胞启动sLP-mCh的表达，成为供体细胞。研究人员发现在门静脉周围出现聚集的mCherry信号，且存在mCherry+CDH5+细胞，表明Mfsd2a+肝细胞作为供体细胞表达sLP-mCh后，周围的内皮细胞也被标记为mCherry+。研究人员发现这部分内皮细胞主要分布在门静脉周围，在肝小叶一区中超过90%的内皮细胞为mCherry+，在二区中大约30%的内皮细胞为mCherry+，在三区中几乎检测不到mCherry+的内皮细胞。从以上可知，研究人员通过CILP技术，并结合Mfsd2a-CreER小鼠，实现了肝小叶内皮细胞的区域性标记，高效地标记了肝门静脉周围内皮细胞。为了进一步分析肝脏中不同区域内皮细胞的差异，研究人员利用FACS将mCherry阳性和阴性内皮细胞分选并进行转录组测序。通过主成分分析显示，这两群内皮细胞分别成群，互相具有较大差异。门静脉周内皮细胞的特征基因Dll4、Lama4、Msr1和Ltbp47在mCherry+内皮细胞中显著上调，中央静脉周内皮细胞特征基因Rspo3、Wnt9b、Cdh13和Thbd7在mCherry–内皮细胞中显著上调。对差异基因进行热图分析显示，与血管新生、调节细胞黏附和生长因子应激相关基因的表达在mCherry+内皮细胞中显著上调，而与胞外基质组成、化学趋化和组织形态发生相关基因的表达在mCherry+内皮细胞中显著下调。综上，研究人员开发了一种体内邻近细胞标记新技术CILP。CILP利用了一种细胞膜透过性的荧光蛋白，当这种荧光蛋白在供体细胞中表达后，可以释放到细胞外，并进入邻近细胞，从而实现对邻近细胞的标记。研究人员利用CILP技术成功标记了小鼠肝脏中肝细胞的邻近细胞，并利用Mfsd2a+肝细胞作为供体细胞，标记并分析了肝脏门静脉周内皮细胞的特征。分子细胞卓越中心博士后张少华为该论文的第一作者，分子细胞卓越中心周斌研究员和复旦大学附属中山医院王立新教授为该论文共同通讯作者。该工作得到了香港中文大学吕爱兰教授和西湖大学何灵娟研究员的大力支持。感谢分子细胞卓越中心动物平台和细胞分析技术平台对本研究的大力支持，感谢中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部门的经费支持。图：（A）sLP-mCh荧光蛋白从供体细胞进入受体细胞。（B和C）遗传工具小鼠构建以及实验策略。（D–F）以肝细胞作为供体细胞表达sLP-mCh，肝脏中非实质细胞被标记为mCherry+。（G和H）sLP-mCh被用于在胰腺和心脏中标记邻近细胞。

[报告简介]单细胞粘附力作为生物机械学分支的重要组成部分，是细胞与外周相互作用的直观体现，能够有效的反映出细胞与基质或细胞之间相互作用能力。细胞与基质之间的作用力十分微小，一般都在nN别，过去通常使用原子力显微镜才能够进行测量。但是原子力显微镜方案往往具有通量低，操作繁琐等问题，使得单细胞力谱的研究非常繁琐。基于此，Cytosurge推出的全新多功能单细胞显微操作FluidFM技术给细胞力谱测量带来了新的希望。该技术结合了的原子力显微镜探测技术与微流体控制系统，能够直接通过使用中空的原子力探针将细胞通过负压抓取在探针表面，并不需要激活细胞的任何通路信号，为粘附力的测量带来了大的优势。一方面，这种方法能够提供远比蛋白结合牢固的多的粘附力，能够将细胞牢固的固定在探针上并且无需包被探针。另一方面，由于没有生物化学处理，这种方法不会改变任何细胞表面的通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。该系统具备高度自动化，能够快速，全自动的完成力学的测定，让单细胞力谱研究变得十分容易。本报告将介绍FluidFM单细胞显微操作技术的原理和发展，并结合多篇发表在期刊Nature、Cell、Bioactive Materials等上的近科研成果，深入阐述这种技术在单细胞力谱测量方面的新进展。[直播入口]请扫描下方二维码进入FluidFM单细胞显微操作技术群，届时会在微信群中实时更新直播入口，无需注册！扫码进群，即刻获取直播链接，无需注册！[报告时间]05月25日 下午15:00-16:00 [主讲人介绍]Tamás Gerecsei 亚太区席应用科学家，高FluidFM解决方案工程师，Cytosurge AGTamás是一位生物物理学家，毕业于Etvs Loránd（ELTE罗兰大学）。 在与FluidFM在学术环境中合作多年后，他加入了Cytosurge公司，成为了一名训练有素的微纳米系统工程师。在Cytosurge AG，Tamás不断推动并拓展FluidFM技术的应用边界，并使FluidFM技术应用于各地研究人员的课题中。您可以经常发现他在各种专业的学术会议上传播关于Cytosurge和FluidFM技术的信息。 郭亚茹 北京大学口腔医院，口腔医学中心，获中国博士后科学基金，并入选北京大学医学部 2021年博雅博士后项目，在Advanced functional materials、Bioactive Materials、Journal of dental research等杂志上以作者或共同作者的身份发表5篇。 2021年，在Bioactive Materials发表了题为：Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis的研究文章，报道了基质硬度通过p-PXN-Rac1-YAP信号轴调节细胞形成，这项工作不仅有助于在组织工程和再生医学中寻找佳材料，也为肿瘤治疗和病理性血管再生提供了新的治疗策略。在生物材料设计和治疗一些病理情况方面具有特殊意义。本实验研究人员采用了多功能单细胞显微操作系统——FluidFM技术，实现了单个细胞的分离，单个细胞粘附力的测量。 [原理&应用简介]FluidFM技术如何测定细胞粘附力？众所周知，细胞在基质上进行单层培养时，吸附在基质表面时主要会产生两种不同类型的力，一种是细胞与基质之间的粘附力，另一种是细胞与细胞之间的粘附力。因此对于细胞粘附力来说，单个细胞的粘附力就是细胞与基质之间的作用力。而单层细胞的细胞粘附力则是细胞之间相互作用力和细胞基质与细胞之间作用力之和。如下图所示：因此只要同时测定单个细胞粘附力即可得到细胞与基质之间的相互作用力，而细胞间的相互作用力则可以通过同时测量单层细胞的细胞粘附力和单个细胞的粘附力做差得到，如下公式所示：Force cell-cell ≌ Force Monolayer – Force Indiv.cellFluidFM测量力学步骤与一般的原子力显微镜十分类似，但是操作却远比原子力显微镜简单，这得益于FluidFM有的中空探针。这种探针无需像普通原子力探针一样对探针进行修饰或者将细胞提前粘连在探针上，可以直接在液体中原位抓取细胞，完成粘附力测定，并且在测量后探针仍然可以继续进行测试，并且无需对探针进行更换或再修饰。FluidFM技术测量单细胞力谱的基本流程。仅需操作鼠标系统即可自动完成对细胞的抓取和粘附力的测量。此外FluidFM系统会自动记录探针运动轨迹和力学曲线，如上图中所示当探针开始靠近细胞后，探针表面开始出现压力变化，当系统达到设定力学值后系统会自动停止下降并开始施加负压抓住细胞。随着探针开始上升，细胞给予探针的拉力随之增高，并逐渐达到临界，随后细胞脱离基质，探针受力趋近于零，而这一过程中探针受力的大值即为细胞粘附力。FluidFM技术测量HeLa细胞核CHO细胞的粘附力。能够高通量测量单细胞粘附力谱FluidFM测量粘附力十分智能化，仅需5分钟即可完成单个细胞的粘附力测定，一天可完成上百个细胞的测量，能够大幅度提升单细胞力谱测量的通量，让单细胞力谱研究变得简单、快速、高通量。 应用举例一：FluidFM技术测定衰老内皮细胞的力谱内皮细胞衰老导致细胞表型的改变与心血管疾病有着密切关系。随着细胞的衰老，细胞的粘附力等机械属性会有很大改变，因此对于细胞粘附力的研究将有助于理解细胞衰老的变化。Nafsika Chala等人利用FluidFM技术对血管内皮细胞与基底之间的粘附力进行研究发现，衰老的细胞与正常细胞存在着nN别粘附力差异。如下图所示：FluidFM技术用于衰老与正常细胞的单细胞粘附力测定。对比衰老小、大和正常细胞的细胞尺寸（a）、细胞粘附力（b）和细胞周长（c）及单细胞粘附力/面积（e）和单细胞粘附力/周长（f）的变化。研究者认为，衰老内皮细胞的粘附力增加是与细胞的粘着斑增加有关，表明衰老细胞能够加强与基质的相互作用从而防止内皮剥脱，但是受制于血流的影响这种能力受到了很大限制。 应用举例二：FluidFM揭示应力依赖性酵母交配中的分子相互作用性凝集素是芽殖酵母酿酒酵母介导细胞聚集交配的关键蛋白。交配细胞表达的互补凝集素类“a”型和“α”型的结合是促进细胞的凝集和融合的关键。Marion Mathelié-Guinlet等通过测量“a”型和“α”型结合的单个特定键的强度（~100 pN），发现延长细胞间的接触能够大地增加了交配细胞间的粘附力，而这种增强可能是由于凝集素的表达。FluidFM技术用于酵母属间交配过程单细胞力谱测量。MATa与MATα相互作用的示意图（a）和Fluid测量细胞间相互作用示意图（b）及测量结果（c）；用DTT和DEPC药物刺激研究二硫键和His273对粘附的影响（d）、其示机制意图（e）和无粘附、DTT和DEPC粘附发生的概率（f）；以及物理应力增强MATa和MATα细胞之间的粘合力（g）、发生频率（h）及破裂长度（i）。此外，研究组发现凝集素二硫键在粘附过程中起到了关键作用，而这一作用主要来自于α-凝集素的组氨酸残基His273。更为有趣的是，作者发现机械张力增强了相互作用的强度，这可能是由于激诱导凝集素构象从弱结合折叠状态转换成强绑定伸展状态导致。这项研究很好地展现了一种理解控制酵母性别的复杂机制的可能方法。 总结 细胞粘附力测定在细胞生命科学研究中起着至关重要的作用，然而传统手段中有着各种各样的局限性，主要原因是缺乏一种能够有效抓取细胞并进行力学测定的手段。现如今FluidFM技术在细胞粘附力测定中的使用，使得研究者们有了一种能够有效、低损的方式抓取细胞，配合原子力显微镜的测量的特性，真正意义上做到、无损、快速的测量单细胞粘附力，帮助研究者寻找细胞粘附力与细胞生命发展、肿瘤细胞转移之间的关系。