内皮细胞

“世界心脏日今天9月29日是世界心脏日(World Heart Day)，是由世界心脏联盟确定，旨在世界范围内宣传有关心脏健康的知识，并让公众认识到生命需要健康的心脏。在全世界范围内，心血管疾病是威胁人类健康的高危病种，其危害无年龄、身份、地域之分。在中国，每年大约有260万人死于心脑血管疾病，死亡人数位列世界第二。《中国心血管健康与疾病报告2021》指出，每5例死亡中就有2例死于心血管病。急性心肌梗死(MI)是一种常见的由突发冠状动脉血栓形成和闭塞引起的心脏急症。急性心肌梗死期间持续的缺血组织损伤导致疤痕形成，进而可能心力衰竭。心肌梗死后形成的新血管可减轻疤痕和心功能恶化。然而心肌梗塞后形成血管生成和功能适应的细胞间的相互作用仍不完全清楚。下面跟随小编来看一下德国汉诺威医学院的研究人员今年发表在《Science》上的“心脏知识”。德国汉诺威医学院Kai C. Wollert研究团队发表题为Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase的研究。通过对急性心肌梗死的小鼠进行生物信息学分泌组分析，发现细胞因子METRNL(Meteorin-like) 在梗死边界区内皮细胞高度表达，促进心肌梗死后的血管生成、组织修复和功能适应。使用化学交联质谱法发现，KIT（受体酪氨酸激酶）是内皮细胞中METRNL细胞表面受体。为了评估METRNL是否与KIT的细胞外结构域结合，通过微量热泳动（MST）技术，检测到KIT-ECD-Fc可结合METRNL和SCF（KIT已知配体），并且亲和力很高（Kd分别是87nM和175nM）,而不与血管内皮生长因子A(VEGFA)结合。Pull Down实验获得相同的结果。图注：MST技术和Pull Down检测KIT的胞外结构域与METRNL，SCF和VEGFA结合随后，作者检测时发现METRNL的治疗会增强心肌梗死区域边缘的毛细血管化，限制瘢痕的形成并对心脏功能具有持续有益的影响。研究结果: 作者定义了一种基于METRNL的髓系细胞和内皮细胞之间的交叉信号，METRNL通过KIT依赖的信号通路介导内皮细胞的血管生成作用促进心肌梗死后组织修复，为急性心肌梗死的治疗提供了新的药物靶点。心脏是人体最重要的器官之一，无论工作或者科研再忙碌，一定要注意休息。马上就要国庆节了，让我们一起为劳苦功高的心脏放个假吧！文献参考：Reboll, Marc R., et al. "Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase." Science 376.6599 (2022): 1343-1347.*文内部分图片来源自百度，侵则删。

1月3日，国际学术期刊PNAS发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌组和复旦大学附属中山医院王立新教授合作的研究成果“Genetic dissection of intercellular interactions in vivo by membrane-permeable protein”。该研究利用表达膜透过性荧光蛋白的遗传工具小鼠，建立了体内邻近细胞标记技术，并利用该技术揭示了肝脏不同区域中内皮细胞的异质性。细胞之间的相互作用对于多细胞生物体生长发育、稳态维持以及损伤修复等过程至关重要，但是监测体内细胞互作的遗传学技术鲜有报道。当前的遗传学手段基本上是针对特定细胞自身进行操作，无法深入研究细胞之间的互作。因此，建立新型邻近细胞标记技术对了解生物体内细胞间互作及其功能具有重要意义。sLP-mCh是脂溶性标签连接mCherry的融合荧光蛋白(Ombrato et al., Nature 2019)。sLP-mCh在供体细胞中表达后，会从供体细胞中释放出去，并进入邻近细胞，将邻近细胞标记为mCherry+。基于sLP-mCh蛋白的特性，为了实现体内邻近细胞标记，研究人员构建了基因敲入小鼠：R26-sLP-mCh-GFP和R26-sLP-mCh。首先以小鼠肝细胞作为供体细胞，表达sLP-mCh和GFP，检测肝细胞周围的其他类型细胞标记情况。研究人员在R26-sLP-mCh-GFP小鼠体内注射特异靶向肝细胞的病毒AAV2/8-TBG-Cre，当病毒进入肝细胞后，Cre重组酶表达并发生Cre-LoxP重组，移除R26-sLP-mCh-GFP位点中间的终止序列，肝细胞启动表达sLP-mCh和GFP荧光蛋白，成为sLP-mCh的供体细胞。研究人员发现肝细胞为GFP+mCherry+，同时也能检测到GFP–mCherry+的非实质细胞，其中肝脏中80%内皮细胞、76%免疫细胞以及54%成纤维细胞被标记。研究人员将这种由Cre诱导的细胞间蛋白标记技术称作CILP。肝脏的基本单位是肝小叶，肝小叶可以分为三个区域(zone)，各区域的肝细胞具有不同特性以及分子标记。一区的肝细胞围绕着肝脏门静脉，高表达钙粘蛋白E（E-Cad）；三区的肝细胞围绕着肝脏中央静脉，高表达谷氨酰氨合成酶（GS）；肝小叶二区位于一区和三区之间，由E-Cad–GS–的肝细胞构成。肝脏中的毛细血管是一类特化的血管网络，称作肝血窦内皮细胞，肝血窦内皮细胞和肝细胞发生着紧密的相互作用，肝脏不同区域的肝细胞可能会受到内皮细胞不同程度的影响。研究人员然后以Mfsd2a+肝细胞为例阐明肝细胞及其邻近内皮细胞之间的互作。当用他莫昔芬诱导双基因型成体小鼠Mfsd2a-CreER R26-sLP-mCh后，Mfsd2a+肝细胞启动sLP-mCh的表达，成为供体细胞。研究人员发现在门静脉周围出现聚集的mCherry信号，且存在mCherry+CDH5+细胞，表明Mfsd2a+肝细胞作为供体细胞表达sLP-mCh后，周围的内皮细胞也被标记为mCherry+。研究人员发现这部分内皮细胞主要分布在门静脉周围，在肝小叶一区中超过90%的内皮细胞为mCherry+，在二区中大约30%的内皮细胞为mCherry+，在三区中几乎检测不到mCherry+的内皮细胞。从以上可知，研究人员通过CILP技术，并结合Mfsd2a-CreER小鼠，实现了肝小叶内皮细胞的区域性标记，高效地标记了肝门静脉周围内皮细胞。为了进一步分析肝脏中不同区域内皮细胞的差异，研究人员利用FACS将mCherry阳性和阴性内皮细胞分选并进行转录组测序。通过主成分分析显示，这两群内皮细胞分别成群，互相具有较大差异。门静脉周内皮细胞的特征基因Dll4、Lama4、Msr1和Ltbp47在mCherry+内皮细胞中显著上调，中央静脉周内皮细胞特征基因Rspo3、Wnt9b、Cdh13和Thbd7在mCherry–内皮细胞中显著上调。对差异基因进行热图分析显示，与血管新生、调节细胞黏附和生长因子应激相关基因的表达在mCherry+内皮细胞中显著上调，而与胞外基质组成、化学趋化和组织形态发生相关基因的表达在mCherry+内皮细胞中显著下调。综上，研究人员开发了一种体内邻近细胞标记新技术CILP。CILP利用了一种细胞膜透过性的荧光蛋白，当这种荧光蛋白在供体细胞中表达后，可以释放到细胞外，并进入邻近细胞，从而实现对邻近细胞的标记。研究人员利用CILP技术成功标记了小鼠肝脏中肝细胞的邻近细胞，并利用Mfsd2a+肝细胞作为供体细胞，标记并分析了肝脏门静脉周内皮细胞的特征。分子细胞卓越中心博士后张少华为该论文的第一作者，分子细胞卓越中心周斌研究员和复旦大学附属中山医院王立新教授为该论文共同通讯作者。该工作得到了香港中文大学吕爱兰教授和西湖大学何灵娟研究员的大力支持。感谢分子细胞卓越中心动物平台和细胞分析技术平台对本研究的大力支持，感谢中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部门的经费支持。图：（A）sLP-mCh荧光蛋白从供体细胞进入受体细胞。（B和C）遗传工具小鼠构建以及实验策略。（D–F）以肝细胞作为供体细胞表达sLP-mCh，肝脏中非实质细胞被标记为mCherry+。（G和H）sLP-mCh被用于在胰腺和心脏中标记邻近细胞。

[报告简介]单细胞粘附力作为生物机械学分支的重要组成部分，是细胞与外周相互作用的直观体现，能够有效的反映出细胞与基质或细胞之间相互作用能力。细胞与基质之间的作用力十分微小，一般都在nN别，过去通常使用原子力显微镜才能够进行测量。但是原子力显微镜方案往往具有通量低，操作繁琐等问题，使得单细胞力谱的研究非常繁琐。基于此，Cytosurge推出的全新多功能单细胞显微操作FluidFM技术给细胞力谱测量带来了新的希望。该技术结合了的原子力显微镜探测技术与微流体控制系统，能够直接通过使用中空的原子力探针将细胞通过负压抓取在探针表面，并不需要激活细胞的任何通路信号，为粘附力的测量带来了大的优势。一方面，这种方法能够提供远比蛋白结合牢固的多的粘附力，能够将细胞牢固的固定在探针上并且无需包被探针。另一方面，由于没有生物化学处理，这种方法不会改变任何细胞表面的通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。该系统具备高度自动化，能够快速，全自动的完成力学的测定，让单细胞力谱研究变得十分容易。本报告将介绍FluidFM单细胞显微操作技术的原理和发展，并结合多篇发表在期刊Nature、Cell、Bioactive Materials等上的近科研成果，深入阐述这种技术在单细胞力谱测量方面的新进展。[直播入口]请扫描下方二维码进入FluidFM单细胞显微操作技术群，届时会在微信群中实时更新直播入口，无需注册！扫码进群，即刻获取直播链接，无需注册！[报告时间]05月25日 下午15:00-16:00 [主讲人介绍]Tamás Gerecsei 亚太区席应用科学家，高FluidFM解决方案工程师，Cytosurge AGTamás是一位生物物理学家，毕业于Etvs Loránd（ELTE罗兰大学）。 在与FluidFM在学术环境中合作多年后，他加入了Cytosurge公司，成为了一名训练有素的微纳米系统工程师。在Cytosurge AG，Tamás不断推动并拓展FluidFM技术的应用边界，并使FluidFM技术应用于各地研究人员的课题中。您可以经常发现他在各种专业的学术会议上传播关于Cytosurge和FluidFM技术的信息。 郭亚茹 北京大学口腔医院，口腔医学中心，获中国博士后科学基金，并入选北京大学医学部 2021年博雅博士后项目，在Advanced functional materials、Bioactive Materials、Journal of dental research等杂志上以作者或共同作者的身份发表5篇。 2021年，在Bioactive Materials发表了题为：Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis的研究文章，报道了基质硬度通过p-PXN-Rac1-YAP信号轴调节细胞形成，这项工作不仅有助于在组织工程和再生医学中寻找佳材料，也为肿瘤治疗和病理性血管再生提供了新的治疗策略。在生物材料设计和治疗一些病理情况方面具有特殊意义。本实验研究人员采用了多功能单细胞显微操作系统——FluidFM技术，实现了单个细胞的分离，单个细胞粘附力的测量。 [原理&应用简介]FluidFM技术如何测定细胞粘附力？众所周知，细胞在基质上进行单层培养时，吸附在基质表面时主要会产生两种不同类型的力，一种是细胞与基质之间的粘附力，另一种是细胞与细胞之间的粘附力。因此对于细胞粘附力来说，单个细胞的粘附力就是细胞与基质之间的作用力。而单层细胞的细胞粘附力则是细胞之间相互作用力和细胞基质与细胞之间作用力之和。如下图所示：因此只要同时测定单个细胞粘附力即可得到细胞与基质之间的相互作用力，而细胞间的相互作用力则可以通过同时测量单层细胞的细胞粘附力和单个细胞的粘附力做差得到，如下公式所示：Force cell-cell ≌ Force Monolayer – Force Indiv.cellFluidFM测量力学步骤与一般的原子力显微镜十分类似，但是操作却远比原子力显微镜简单，这得益于FluidFM有的中空探针。这种探针无需像普通原子力探针一样对探针进行修饰或者将细胞提前粘连在探针上，可以直接在液体中原位抓取细胞，完成粘附力测定，并且在测量后探针仍然可以继续进行测试，并且无需对探针进行更换或再修饰。FluidFM技术测量单细胞力谱的基本流程。仅需操作鼠标系统即可自动完成对细胞的抓取和粘附力的测量。此外FluidFM系统会自动记录探针运动轨迹和力学曲线，如上图中所示当探针开始靠近细胞后，探针表面开始出现压力变化，当系统达到设定力学值后系统会自动停止下降并开始施加负压抓住细胞。随着探针开始上升，细胞给予探针的拉力随之增高，并逐渐达到临界，随后细胞脱离基质，探针受力趋近于零，而这一过程中探针受力的大值即为细胞粘附力。FluidFM技术测量HeLa细胞核CHO细胞的粘附力。能够高通量测量单细胞粘附力谱FluidFM测量粘附力十分智能化，仅需5分钟即可完成单个细胞的粘附力测定，一天可完成上百个细胞的测量，能够大幅度提升单细胞力谱测量的通量，让单细胞力谱研究变得简单、快速、高通量。 应用举例一：FluidFM技术测定衰老内皮细胞的力谱内皮细胞衰老导致细胞表型的改变与心血管疾病有着密切关系。随着细胞的衰老，细胞的粘附力等机械属性会有很大改变，因此对于细胞粘附力的研究将有助于理解细胞衰老的变化。Nafsika Chala等人利用FluidFM技术对血管内皮细胞与基底之间的粘附力进行研究发现，衰老的细胞与正常细胞存在着nN别粘附力差异。如下图所示：FluidFM技术用于衰老与正常细胞的单细胞粘附力测定。对比衰老小、大和正常细胞的细胞尺寸（a）、细胞粘附力（b）和细胞周长（c）及单细胞粘附力/面积（e）和单细胞粘附力/周长（f）的变化。研究者认为，衰老内皮细胞的粘附力增加是与细胞的粘着斑增加有关，表明衰老细胞能够加强与基质的相互作用从而防止内皮剥脱，但是受制于血流的影响这种能力受到了很大限制。 应用举例二：FluidFM揭示应力依赖性酵母交配中的分子相互作用性凝集素是芽殖酵母酿酒酵母介导细胞聚集交配的关键蛋白。交配细胞表达的互补凝集素类“a”型和“α”型的结合是促进细胞的凝集和融合的关键。Marion Mathelié-Guinlet等通过测量“a”型和“α”型结合的单个特定键的强度（~100 pN），发现延长细胞间的接触能够大地增加了交配细胞间的粘附力，而这种增强可能是由于凝集素的表达。FluidFM技术用于酵母属间交配过程单细胞力谱测量。MATa与MATα相互作用的示意图（a）和Fluid测量细胞间相互作用示意图（b）及测量结果（c）；用DTT和DEPC药物刺激研究二硫键和His273对粘附的影响（d）、其示机制意图（e）和无粘附、DTT和DEPC粘附发生的概率（f）；以及物理应力增强MATa和MATα细胞之间的粘合力（g）、发生频率（h）及破裂长度（i）。此外，研究组发现凝集素二硫键在粘附过程中起到了关键作用，而这一作用主要来自于α-凝集素的组氨酸残基His273。更为有趣的是，作者发现机械张力增强了相互作用的强度，这可能是由于激诱导凝集素构象从弱结合折叠状态转换成强绑定伸展状态导致。这项研究很好地展现了一种理解控制酵母性别的复杂机制的可能方法。 总结 细胞粘附力测定在细胞生命科学研究中起着至关重要的作用，然而传统手段中有着各种各样的局限性，主要原因是缺乏一种能够有效抓取细胞并进行力学测定的手段。现如今FluidFM技术在细胞粘附力测定中的使用，使得研究者们有了一种能够有效、低损的方式抓取细胞，配合原子力显微镜的测量的特性，真正意义上做到、无损、快速的测量单细胞粘附力，帮助研究者寻找细胞粘附力与细胞生命发展、肿瘤细胞转移之间的关系。

前言人类严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒(SARS-CoV-2) 感染会导致多种临床表现，从无症状疾病到急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 和多器官衰竭。除了病毒对呼吸系统和其他器官的直接损伤外，越来越多的证据表明，由 SARS-CoV-2 感染引起的免疫反应有助于冠状病毒病 (COVID-19) 的病理生理学，尤其是在严重的疾病过程中。CD4+ T 辅助细胞和 CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 都有助于控制呼吸道病毒感染。T 细胞免疫反应与 COVID-19 期间疾病结果之间存在复杂的关系。微环境中存在的其他因素可能会影响 T 细胞反应的质量，从而影响病理学。因此，重要的是确定哪些 T 细胞亚群具有致病作用？2022年02月，德国柏林夏里特医学院研究团队在 Cell期刊（IF：66.850）发表了题为 &ldquo Complement activation induces excessive T cell cytotoxicity in severe COVID-19&rdquo 的研究成果，采用单细胞蛋白质组学(CyTOF)和单细胞转录组学研究方法，评估COVID-19重度过程中致病T细胞的功能和诱导信号，发现了患者体内的补体激活可使其T细胞过度毒性。表明T细胞毒性加剧和补体激活使得COVID-19患者患重度疾病或死亡的风险增大。研究背景本篇作者将单细胞蛋白质组学和转录组学与机制研究相结合，揭示 T 细胞区室的改变及它们的上游信号和功能相关性，解释了在严重 COVID-19 中观察到的重要免疫病理学特征。大规模细胞术（飞行时间细胞术 [CyTOF]）和单细胞 RNA-seq (scRNA-seq) 结合基于 VDJ 测序 (VDJ-seq) 的 T 细胞克隆型鉴定用于确定 COVID-19 和严重程度-T细胞区室的特异性改变。作者描述了 C3a 驱动对COVID-19 重症患者的活化 CD16 表达细胞的诱导。这些 T 细胞表现出增加的免疫复合物介导的、不依赖于 TCR 的细胞毒性，导致肺内皮细胞激活和释放趋化因子。这种机制可能导致 COVID-19 患者出现严重的肺损伤和内皮炎。研究思路研究结果1.严重的 COVID-19 中表达CD4 +、CD8 + TCRab +和 TCRgd + T 细胞作者对急性和恢复期的轻度和重度 COVID-19 患者、患有其他急性呼吸道感染（流感样疾病）的患者以及慢性感染人类免疫缺陷病毒 (HIV) 或乙型肝炎 (HBV) 和对照组（图1A）。为了进一步探究 T 细胞空间，将获得的 T 细胞（CD45 + CD3 +CD19 - CD15 -）预先门控到 CD4+T 辅助细胞（CD3 +，CD8 - TCRgd -），CD8 +CTLs（CD3 +，CD8 + TCRgd - ) 和 TCRgd + (CD3 - , CD8 - TCRgd + ) 细胞使用 29 种表面抗原标记。对来自对照、FLI、HIV、HBV 和急性 COVID-19 的样本进行无监督聚类分析，对预先门控的 T 辅助细胞、CTL 和 TCRgd 进行分区T 细胞分别分为 19、15 和 14 个单独的细胞簇（图 1 B-1D）。来自轻度或重度 COVID-19 患者的大部分细胞在统一流形逼近和降维投影 (UMAP) 空间中与其他患者组或对照组的细胞明显分离（图 1B）。与其他组相比，轻度和重度 COVID-19 患者的簇 25 T 细胞（CD8 + CD38 hi HLA-DR +Ki67 +）的比例增加（图1D 和 1E）。重症 COVID-19 的进一步特征是簇 26 T 细胞（CD8 +，高度活化的 NKT 样细胞）的丰度增加，也表达高水平的 CCR6 和 CD16。图1 | HLA-DR hi CD38 hi高度活化但也表达 CD16 的 CD4 +和 CD8 + T 细胞在重症 COVID-19 中的积累2.单细胞转录组学揭示重症 COVID-19 中 T 细胞向高细胞毒性和脱粒潜力转变为了获得有关 COVID-19 和严重程度特异性 T 细胞簇的功能信息，作者对来自急性感染和恢复期轻度和重度 COVID 的外周血单核细胞 (PBMC) 样本以及纯化的表达 CD38 的 T 细胞进行了单细胞转录组scRNA-seq 分析，并对齐 CyTOF 和 scRNA-seq T 细胞簇，得到了 17 个簇（图 2A和2B)。与 FLI 或 HBV 患者以及对照组相比，COVID-19 患者中属于第 7、8 和 10 组的 T 细胞比例更高（图 2D 和 2E)。作者观察到其他具有FCGR3A表达的 T 细胞簇（簇 9、11、12 和 13）。接下来，作者对集群 7、8、9 和 10 进行了基因本体论 (GO) 富集分析，比较了轻度和重度 COVID-19 T 细胞（图 2F）。作者观察到重症 COVID-19 T 细胞脱粒相关基因的特定富集，接着对选择性富集通过基因集富集分析进行基因验证。最后，对来自队列的样本进行的单细胞转录组学scRNA-seq 分析支持了作者在重症 COVID-19 的主要 T 细胞区室中发现了一部分活化的 CD16+T 细胞，并确定了与细胞毒性相关的转录程序的增加。图2 | 急性轻度和重度 COVID-19 期间 T 细胞的单细胞转录组学来自对照组 (n = 6)、FLI (n = 8)、HBV (n = 4)、轻度 COVID-19 (n = 9) 和重度 COVID-19 (n = 10) 的 T 细胞簇的 UMAP患者。3.CD16 介导的 CD8+T 细胞脱粒导致内皮细胞释放趋化因子CyTOF 和 scRNA-seq 分析确定了两个主要的 T 细胞活化特征：(1) 形成高度活化、增殖的 TFH 样 CD4 +细胞和表达 CXCR3 的 CTL，与疾病严重程度无关；(2) 活化的 CD16 + T 细胞特异性。作者测试了 SARS-CoV-2 特异性抗体反应在这些患者中是否更明显？SARS-CoV-2 特异性 IgA 的血清浓度，结果显示，特定 IgG 水平在重症 COVID-19 中更高（图 3A）。接下来，作者研究了与 CD16+CD4+和 CD8+簇相关的功能特性。如 scRNA-seq 所示，与对照组相比，来自重症 COVID-19 患者的样本含有明显更多的表达粒酶 B 的 CD8+T 细胞（图 3C）。CD16 参与重症 COVID-19 最可能的影响之一是在与内皮细胞相互作用期间 T 细胞脱粒增强。事实上，根据对重症 COVID-19 的尸检结果，已经观察到 T 细胞浸润和内皮细胞损伤，即淋巴细胞性内皮炎。可以想象，免疫复合物介导的 CD16+T 细胞脱粒会导致内皮损伤。为了验证这一假设，作者在抗 CD16 抗体存在的情况下，将原代肺微血管内皮细胞与从轻度/重度 COVID-19 患者/对照中分离的富集的非初始 CD8 + T 细胞共同培养。随后，作者分析了炎症介质的释放（图3G）。抗 CD16 触发的严重 COVID-19 T 细胞通过共培养的内皮细胞引起增强的 CXCL8 (IL-8) 和 CCL2 (MCP-1) 释放。与对照 T 细胞相比，来自 COVID-19 患者的 T 细胞放大了伴刀豆球蛋白 A 诱导的跨内皮电阻损失，表明内皮屏障破坏，但这种效应仅对来自重症 COVID-19 患者的 T 细胞显著（图 3 H ）。为了补充作者在外周血中的发现，作者研究了COVID-19 患者肺部CD16 + T 细胞的组织定位。作者发现与来自不同对照尸检组的肺组织相比，CD3 + CD16 + T 淋巴细胞的数量增加（图 3 I 和 3J）。并在死亡的晚期时间点下降（图 3 J）。这些发现支持作者的假设，即在重症 COVID-19 患者中 CD16 +高细胞毒性 T 细胞的生成和局部积累增强，可诱导肺内皮细胞的活化和损伤。T 细胞诱导的化学引诱剂 CXCL8 和 CCL2 的释放可导致 COVID-19 肺炎中中性粒细胞和单核细胞的浸润增加。图3 | 重症 COVID-19 的 T 细胞的脱粒和细胞毒性潜力增加4. 在急性重症 COVID-19 期间诱导的表达FCGR3A的 T 细胞克隆持续存在并保持其增加的细胞毒性潜力来自重症 COVID-19 患者的 CD16 + T 细胞表现出增强的细胞毒性特性，可能导致器官损伤，作者分析了它们在清除急性感染后的持久性。症状发作后 3-8 个月恢复期（图 4A -4E），作者分析了单个 COVID-19 T 细胞簇的克隆富集是否不同。进一步揭示这些克隆的高细胞毒性潜力。随后探索富含反应性缺氧特征的区域。结果显示，重症 COVID-19 患者的 CD16 + CD8 + T 细胞在恢复期持续存在，采用更分化的 CD62L -表型，但仍保持其高细胞毒性潜力。图4 | 在急性 COVID-19 期间扩增的 T 细胞克隆的时间依赖性进化和表型5. C3a 促进表达 CD16 的高细胞毒性 T 细胞的分化因为 COVID-19 的死亡率和严重发病率会不同程度地影响老年人，作者研究了总 CD16 + T 细胞的形成是否与年龄增加有关。作者利用已发表的流式细胞术数据揭示了来自老年人的样本中检测到显著更高比例的 CD16 +细胞，这支持了作者的年龄依赖性增加的假设（图 5 A）。重症 COVID-19 的一个关键特征是补体生成和激活增加，作者分析了补体成分补体因子 D (CFD) 与年龄的相关性。接下来，作者在重组 IL-2 和来自轻度或重度 COVID-19 患者的血清或对照血清的存在下，用板结合的抗 CD3/CD28 抗体刺激来自健康未暴露对照的富集 CD3 +细胞。最后，作者测试了 C3a 是否是导致重症 COVID-19 患者血清 T 细胞分化潜能改变的原因。总之，在重症 COVID-19 中高水平产生的补体分裂产物（如 C3a）会产生炎症环境，促进 CD16+高细胞毒性 T 细胞的分化。图5 | C3a促进表达CD16的高细胞毒性T细胞分化6.活化的 CD16 + T 细胞在严重 COVID-19 期间的病理作用作者比较了死于 COVID-19 的患者和幸存者中活化 CD16 +T 细胞的比例。与幸存者（幸存者）相比，死亡的重症 COVID-19 患者（非幸存者）样本中所有 CD4 +和 CD8 + T 细胞中活化的 CD16 + TCRab +细胞的百分比显著更高（图 6 A）。接下来，作者在更大的队列中测试了 C3a 生成上游补体蛋白的血浆水平是否与患者的病程和结果相关。与轻度 COVID-19 相比，重症患者血浆样本中经典和替代途径的正调节因子水平较高（图6B ）。作者还分析了与疾病轨迹相关的补体蛋白水平，特别是随后疾病严重程度的恶化。临床恶化的患者样本中 C1R 和 CFD 升高，而随后疾病进展的患者样本中抑制经典和凝集素依赖性补体途径的补体因子 I (CFI) 的丰度较低（图 6C）。最后，C1QA、C1QB、C1QC 和 CFD 的数量不仅在重症 COVID-19 中较高，而且与致命结果相关（图 6 D）。总之，这些数据进一步支持了补体系统和活化的 CD16 + T 细胞在严重 COVID-19 期间的病理作用。图6 | 活化 CD16 + T 细胞的比例和血浆补体蛋白水平与 COVID-19 的结果相关相关讨论过度的 T 细胞活化和改变的表型可能导致感染相关的器官损伤。在重症 COVID-19 患者中，作者检测到活化的 CD16 +T 细胞的分化，这显示出免疫复合物介导的细胞毒性潜力和激活肺微血管内皮细胞的潜力。CD16 中的扩展克隆+ T 细胞区室持续存在并保持其高细胞毒性潜力。作者将 C3a 鉴定为分化改变的活化 T 细胞表型的上游信号。活化 CD16 +T 细胞的比例和血浆补体蛋白丰度水平与重症 COVID-19 患者的不良预后相关。因此，SARS-CoV-2 触发的补体激活创造了一种炎症环境，驱动具有高免疫致病潜力的 T 细胞分化。在这里，作者显示重症 COVID-19 患者中 C3a 生成的增加促进了 CD16 +、高细胞毒性 CD4 +和 CD8 + T 细胞的分化。总结全文，研究发现新冠重症患者体内出现高度活化、高细胞毒性的CD16 +T细胞亚群。新冠重症患者体内免疫复合物介导的CD16 + T细胞可以与内皮细胞相互作用促进微血管内皮细胞的损伤、释放炎性趋化因子以及中性粒细胞和单核细胞浸润肺组织。而CD16 + T细胞克隆在急性疾病后仍能保持其细胞毒性表型。补体成分C3a作为其上游信号可以促进高毒性CD16 +T细胞的分化。活化CD16 +T细胞的比例和血浆补体蛋白水平与新冠患者的死亡风险有关，表明T细胞的高毒性和补体激活使得新冠患者死亡风险增加。总之，特别严重的 COVID-19 导致活化的 CD16 + T 细胞数量增加，这些细胞通过不依赖 TCR 的细胞毒性 T 细胞功能触发补体级联反应与内皮损伤和患者存活相关。这在功能上将先天和适应性免疫系统与内皮损伤联系起来，这可能构成一个重要的分子轴，解释了在 COVID-19 中观察到的广泛的器官损伤。

近日研究发现，药理学家已经成功地绘制出心肌细胞的表观基因组。他们希望这一发现引起有关先天性心脏病和慢性心力衰竭的新见解。科学家们在《自然通讯》杂志上发表了相关内容。表观基因组是表观遗传机制的总体，表观遗传机制决定细胞中哪些基因是活跃的，哪些基因是不活跃的。内部或环境条件的变化，如营养、压力、或药物，可以留下表观遗传模式。这样的机制在癌症的发展过程中发挥重要作用，但它对心脏病的意义还不太为人所知。中文名称：人粘膜相关上皮趋化因子(MEC/CCL28)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human mucosae associated epithelia chemokine,MEC ELISAkit中文名称：人B细胞活化因子受体(BAFF-R)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human B cell activation factorr from the tumor necrosis factor family 中文名称：人血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3/Flt-4)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Vascuoar endothelial cell growth factor 中文名称：人血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1/Flt1)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Vascuoar endothelial cell growth factor 中文名称：人血管内皮细胞生长因子D(VEGF-D)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Vascular Endothelial cell Growth Factor D,VEGF-D 中文名称：人血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Vascular Endothelial cell Growth Factor C,VEGF-C 中文名称：人血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Vascular Endothelial cell Growth Factor B,VEGF-B 中文名称：人血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Vascular Endothelial cell Growth Factor,VEGF ELISAkit 中文名称：人血管内皮细胞粘附分子1(VCAM-1/CD106)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Vascuolar cell adhesion molecule 1,VCAM-1 中文名称：人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human soluble tumor necrosis factor-related apoptosis 中文名称：人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体4(TRAIL-R4)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human tumor necrosis factor-related apoptosis-中文名称：人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体3(TRAIL-R3)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human tumor necrosis factor-related apoptosis-中文名称：人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(TRAIL-R1)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human tumor necrosis factor-related apoptosis-中文名称：人肿瘤坏死因子β(TNF-β)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Tumor necrosis factor β,TNF-β ELISAkit 中文名称：人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Tumor necrosis factor α,TNF-α ELISAkit 中文名称：人肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅱ(TNFsR-Ⅱ)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Tumor necrosis factor soluble receptor Ⅱ,TNFsR-Ⅱ 中文名称：人肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅰ(TNFsR-Ⅰ)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Tumor necrosis factor soluble receptor Ⅰ,TNFsR-Ⅰ中文名称：人转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Transforming Growth factor β1,TGF-β1 ELISAkit 中文名称：人转化生长因子α(TGF-α)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human transforming growth factor α,TGF-α ELISAkit中文名称：人基质细胞衍生因子1β(SDF-1β/CXCL12)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Stromal cell derived factor 1β,SDF-1β 中文名称：人干细胞因子受体(SCFR)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Stem Cell Factor Receptor,SCFR ELISAkit 中文名称：人干细胞因子/肥大细胞生长因子(SCF/MGF)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Stem cell factor/mast cell growth 中文名称：人可溶性CD40配体(sCD40L)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Soluble Cluster of differentiation 40 ligand,sCD40L ELISAkit 中文名称：人可溶性CD30配体(sCD30L)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Soluble Cluster of differentiation 30 ligand,sCD30L ELISAkit 中文名称：人正常T细胞表达和分泌因子(RANTES/CCL5)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human regulated on activation in normal T-cell 中文名称：人P选择素(P-Selectin/CD62P/GMP140)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human P-Selectin/CD62P/GMP140 ELISAkit 中文名称：人血血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Platelet-Derived Growth Factor AB,PDGF-AB ELISAkit 中文名称：人神经营养因子4(NT-4)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Neurotrophin 4,NT-4 ELISAkit 中文名称：人的神经生长因子(NGF)ELISA试剂盒价格96t/48t英文名称：Human Nerve growth factor,NGF ELISAkit 心脏在人出生和发育后起着无可替代的作用。它是胚胎发育形成时的第一个器官，并不断用氧气和营养供应着整个身体所需。心肌细胞的细胞核承担着控制基因表达过程中的中央功能。Ralf Gilsbach博士 和Lutz Hein教授领导的研究小组现在已经开发出一种新颖的方法，他们分离心脏组织中不同类型细胞的心肌细胞的细胞核。科学家们应用下一代DNA测序的方法分离创建高分辨率的DNA甲基化图像的细胞核，该细胞核调整基因活性和所有基因的表观遗传标志一样的最重要的表观遗传机制。这使他们确定在出生过程中打开心脏基因程序的表观遗传开关会引起慢性心脏衰竭。目前研究人员想在微小的组织切片活检中进行表观遗传分析，比如在心导管检查中进行分析

1. ADAM能否用于细胞增殖实验分析？ 答：ADAM细胞活力分析与计数仪的专长在于能够进行精确的细胞计数和活力分析。对于在24孔板中进行的实验，如果计数的次数不是太多，就可以考虑使用ADAM来做；而对于那些需要用96孔板来做通量分析的实验，因为每孔细胞的数量太小，细胞计数法已不再适用，因此，还是建议使用酶标仪来做。 如，2012发表的一篇文章《Ethanol extract of Gleditsia sinensis thorn suppresses angiogenesis in vitro and in vivo》使用ADAM做了皂角刺的乙醇提取物对人脐静脉内皮细胞的增殖影响分析。 再如，2012发表的另一篇文章《Metronomic Ceramide Analogs Inhibit Angiogenesis in Pancreatic Cancer through Up-regulation of Caveolin-1 and Thrombospondin-1 and Down regulation of Cyclin D1》则使用ADAM做了四种不同类型的神经酰胺类似物抗肿瘤药物分别对两个人内皮细胞系和两个胰腺癌细胞系细胞的增殖影响分析。2．ADAM能否用于其它非哺乳类细胞的计数？ 答：ADAM细胞活力分析与计数仪通常用于哺乳类动物细胞的计数，当然您也可以尝试用在其它非哺乳类细胞上面。 如，2012年发表的一篇文章《Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales》则首次报道了使用ADAM计数斑马鱼鱼鳞细胞，为ADAM的应用范围作出了积极的拓展。（斑马鱼鱼鳞细胞的制备：取成年斑马鱼（6月龄）的体侧鱼鳞，用胶原酶消化后，收集鱼鳞细胞。）更多产品信息请浏览：http://www.biomart.cn/infosupply/10050648.htm

目前科学家对人类细胞如何互相作用以组成不同组织与器官的认识仍然十分有限。近年来，一系列单细胞测序的研究工作揭示了正常组织与疾病状态下的单细胞图谱，描绘了组织中多种细胞类型及其丰度与互作，但这些工作往往局限于单一器官。系统性地比较多种组织间的细胞类型及其转录组的异同，有助于科学家理解器官特异性的细胞状态分化。2022年5月12日，Science杂志在线发表了Tabula Sapiens Consortium、Eraslan、Domínguez Conde、Suo等研究人员报道的4篇跨组织人类单细胞图谱的研究，共涉及来自68位捐献者的30余种组织类型，超过100万单细胞，涵盖500种以上细胞类型。北京大学张泽民课题组受邀于Science同期发表Perspective观点文章，对以上研究进行了总结，并对将来单细胞测序技术在疾病研究与药物研发中的应用进行了展望。跨组织单细胞测序揭示了组织间保守的细胞特征。Eraslan等人通过比较多种器官中的巨噬细胞，发现了保守的巨噬细胞发育路径，即monocyte前体在组织中发育为高表达HLAII、行使免疫功能的巨噬细胞类群，与高表达LYVE1、行使血管支持与免疫细胞浸润抑制功能的巨噬细胞类群。跨组织单细胞测序发现了组织特异性的细胞状态。记忆T细胞是经过抗原刺激后的T细胞，Domínguez Conde等人发现了三类CD8记忆T细胞亚型，分别为分布在血液丰富组织中的TEM/EMRA细胞，分布在肠道中的TRM细胞，以及主要分布在脾脏与骨髓当中的TRM/EM细胞，这些T细胞亚型各自特异表达的细胞因子受体可能是形成组织差异性分布的机制。对组织间细胞构成的比较识别了稀有的细胞类型。Tabula Sapiens Consortium发现来自肺、心脏、子宫、肝脏、胰腺、脂肪、肌肉等组织的内皮细胞有着各自独特的转录组特征，提示了高度组织适应的功能。同时胸腺、血管、前列腺、眼球来源的内皮细胞更为相似。泛组织研究的方法发现了心脏内皮细胞的特异性marker SLC14A1，提示了心脏内皮细胞可能的适应性代谢功能。同时，Eraslan等人发现了稀有的细胞类型，包括前列腺中的神经内分泌细胞与食管中的肠系神经。跨组织单细胞图谱同时提示了疾病相关的细胞类型。Eraslan等人以肌肉疾病为例研究了单基因遗传病中的潜在致病细胞类型。研究发现在一种影响神经-肌肉细胞信号传递的疾病中，仅神经与肌肉连接处的肌肉细胞富集该类疾病的相关基因。同时，对受体-配体进行的分析发现细胞间互作失调是肌肉疾病的成因之一。例如在一种致死性的肌肉疾病中，ERBB3突变会导致肌肉细胞与施旺细胞（一种生成神经元旁髓鞘的细胞类型）的互作失调。这一系列跨组织单细胞测序数据集同时为药物副作用和安全性研究提供了重要的参考。虽然新药的分子靶向性不断提高，但全身系统性的给药仍然是最主流的方式，使得药物副反应成为重要的临床问题。对这一系列跨人类组织的单细胞数据集进行基因表达查询将大大助力于新药研发的毒性预测，将毒副作用识别在人体试验之前。本期Science发表的四项跨组织单细胞测序研究代表了构建综合性人类细胞图谱的重要里程碑。将来的研究有必要在更大队列的人群中进行探索与验证。同时，将跨组织的研究方法应用于疾病研究十分重要，例如肿瘤。理解组织保守性与组织特异性的肿瘤发生过程对开发泛癌种与癌症类型特异的肿瘤药物至关重要。例如，对肿瘤免疫的认识促进了靶向PD1抗体药物在多种癌症类型中的成功。近年来张泽民课题组报道了一系列泛癌种的髓系细胞与T细胞单细胞测序研究，这一系列研究方法适合被推广至更全面的细胞类型和患者队列，并最终使科学家在单个基因、细胞、组织与表型层面系统性地理解疾病与生物学过程。

德国ibidi的ibiPore可以实时观察流动、剪切情况下的细胞侵袭、迁移、细胞相互作用等实验。对实验结果进行观察统计时，不需要将膜取下，也不需要将另一边的细胞擦掉（经常将膜擦破，导致实验失败），可直接将μ-Slide放于显微镜下观察统计。细胞可以通过两种方式，选择贴壁于氮化硅膜的上下两侧。可以把细胞种植在膜下边，避免自由落体的说法，大大提高了实验的准确性。21世纪注定是一个生命科学的世纪，科研工作者们如果想在这个世纪去决胜，能做到一点，不仅要好的idea，领先的技术，更需要得心应手的好工具。所谓工欲善其事必先利其器，今天为大家介绍德国ibidi的μ-Slide ibipore SiN (图1), 一款具有多孔氮化硅膜的μ-Slide载玻片，可用于实时观察流动、剪切力条件下的细胞侵袭、迁移以及细胞相互作用的可视化的“ transwell ”，更多应用请参阅文中（Intended Use的相关内容）。图1. ibipore及ibipore SiN氮化硅膜培养细胞的染色结果。图片背景为在ibipore氮化硅膜上培养细胞的荧光染色结果，规则排布的白色圆点为氮化硅膜的孔隙ibipore有上下两个独立的通道（见图2），两个通道 overlap 的区域由一个孔径大小均一的氮化硅膜隔离开（见图3）。两个通道可以分别培养细胞，通过两种方式，细胞可以贴壁于氮化硅膜的上下两侧。在细胞侵袭实验中，普通的transwell只能将细胞培养在上侧，这样所得到的实验结果并不能明确的说明是由于重力作用还是侵袭能力本身造成的。而ibipore考虑到这一因素，建议实验者在氮化硅膜的下侧进行细胞培养，检测细胞向上侧通道进行迁移的能力，进而巧妙的排除了重力作用对侵袭实验的影响。配合ibidi流体剪切力系统以及加热孵育系统，可以在流动、剪切力条件下实时的观察细胞的侵袭以及迁移等实验。德国ibidi公司为满足不同实验的需求设计了不同孔径的氮化硅膜（见图4）。ibipore与传统的transwell实验最大区别有三点：①. ibipore可以在上下两个通道中培养细胞，这样可以观察细胞向上的侵袭情况，排除以往实验中重力作用的影响；②. ibipore中间的氮化硅膜具有良好的光学特性，可以实时成像观察侵袭情况，也可以进行免疫荧光染色实验；③. ibipore可以配合ibidi流体剪切力系统，观察淋巴细胞等在流动状态下的侵袭情况。ibipore产品介绍ibipore产品特点：* 透过薄而多孔的薄膜获得卓越的光学性能* 有着广泛的应用，细胞可完全粘附到顶部-基底* 对于不同细胞类型有多种孔径大小可以选择应用：1.流动状态下跨内皮细胞迁移2.2D或3D凝胶内细胞层的共培养和传输分析3.顶部-基底细胞极性分析4.顶部-基底梯度的细胞屏障模型分析5.细胞迁移分析（例如，用于研究肿瘤侵袭或转移）在μ-Slide ibiPore IV型胶原涂层3μm孔径中人类内皮细胞的免疫荧光染色，相位对比度、DAPI（蓝色）、VE钙粘蛋白（绿色）和F肌动蛋白（红色）的叠加图像。技术特点：1.SiMPore的微孔氮化硅膜2.中间具有多孔光学膜的跨通道结构3.优异的光学性能，堪比盖玻片4.孔径大小0.5μm，3μm，5μm，8μm供选择5.中间膜0.4µ m（400 nm）6.使用工作距离0.5mm的物镜7.与ibidi泵系统（流体剪切力系统）完全兼容8.下部通道中明确的剪切力和剪切速率范围µ -Slide ibiPore SiN工作原理µ -Slide ibiPore SiN由插入两个通道之间的水平多孔膜组成。上部通道是膜上方的静态储液池。下部通道是灌注通道，用于对附着在膜上的细胞施加限定的剪切应力。上部通道和下部通道仅通过隔膜彼此连通。图2. ibipore组成示意图多孔膜由氮化硅（SiN）制成，这种材料具有非常高的化学和机械稳健性。400nm厚的氮化硅膜非常适合成像和显微镜观察，没有任何自发荧光或透明度问题（如玻璃）。SiN材料可以直接用于贴壁细胞培养，也可以选择用ECM蛋白包被。应用建议：孔径 & 孔密度什么是孔密度孔密度是指膜的空隙体积分数。是孔隙的体积除以膜的总体积。下面的图形为采用相同的放大倍数。图3. 不同孔径的氮化硅膜不同应用的建议孔径：不同的细胞大小和直径不同，根据具体实验请选择不同孔径图 4. 为不同应用推荐的不同孔径的氮化硅膜Intended Use经证实的应用这些应用已由ibidi研发团队或者我们的用户进行过试验。Endothelial Barrier Assays内皮屏障分析在膜一侧培养单层细胞。细胞可以在静止或者流动剪切力条件下培养。Co-Culture and Cell Barrier Assay共培养和细胞屏障分析在膜的两侧分别培养单层细胞。通过这种方法可以进行信号传递、共培养以及迁移实验（例如，分析药物通过上皮或内皮屏障的传递）。Apical-Basal Cell Polarity Assays顶端-?基底端细胞极性分析3D凝胶基质中的化学因子可以导向在膜另一侧培养的单层细胞的极性发生。Potential Use潜在应用以下示例将讲述该产品进一步的潜在应用。ibidi仍需在内部测试这些应用，因此我们无法提供特定的实验方案。但是，从技术角度来看，这些应用应该是可行的。Trans-Membrane Migration in 2D/2D跨膜迁移在膜的一侧培养单层细胞。可以观察悬浮的白细胞在流动状态下的滚动、粘附以及侵袭情况。Cell Transport in a 3D Gel Matrix细胞在3D凝胶基质中的传递3D凝胶基质中的细胞迁移：在流动状态下，观察白细胞的滚动、粘附以及向3D凝胶基质中肿瘤细胞方向的迁移情况。Application Examples 应用实例MDCK和NIH-3T3细胞的相差显微镜观察Madin-Darby犬肾（MDCK，左）和NIH-3T3（右）细胞在μ-Slide ibiPore SiN，孔径0.5μm的玻片中，无蛋白质包被。接种后，将细胞在静态条件下在培养箱中保持20小时。相差显微镜，4倍物镜。请注意，这张图像中的中心多孔区域看起来更暗，因为0.5μm的孔隙无法用低分辨率物镜分辨。流动条件下HUVECS的相差显微观察人脐静脉上皮细胞（HUVEC）在μ-Slide ibiPore SiN中，孔径3μm的玻片中，有纤连蛋白包被。将细胞接种并在具有ibidi泵系统/流体剪切力系统的流动条件（10达因/cm2）下在培养箱中保持12小时。固定后的相位对比显微镜，10倍物镜。流动下HUVECs F肌动蛋白细胞骨架的荧光显微镜观察人脐静脉上皮细胞（HUVEC）在μ-Slide ibiPore SiN，孔径5μm玻片中的免疫荧光染色，有纤连蛋白包被。将细胞接种并在具有ibidi泵系统/流体剪切力系统的流动条件（10达因/cm2）下在培养箱中保持12小时。绿色：肌动蛋白（鬼笔肽），蓝色：细胞核（DAPI）。荧光显微镜，20倍物镜。选择指南：ibidi跨膜分析实验解决方案参考文献：Salvermoser, Melanie, et al. "Myosin 1f is specifically required for neutrophil migration in 3D environments during acute inflammation." Blood, The Journal of the American Society of Hematology 131.17 (2018): 1887-1898. 10.1182/blood-2017-10-811851Rohwedder, Ina, et al. "Src family kinase-mediated vesicle trafficking is critical for neutrophil basement membrane penetration." Haematologica (2019). 10.3324/haematol.2019.225722Non-Recommended Applications不建议的应用因技术原因，本产品不适用于以下应用，应避免使用.本产品不适用于：1.上通道灌流2.两个通道的灌流3.跨膜流动4.筛选应用订购信息

养过细胞的人都知道优质血清的重要标准之一是内毒的含量。血清由于其复杂的成分是不可代替的，但它也难以控制外界因素的影响内毒素过高会是实验室珍贵的细胞凋零。例如：干细胞体外培养实验，由于干细胞的原始性，它们对内毒素非常敏感，所以，当血清内毒素偏高时，细胞很容易死亡，需要在试用前提早参看该批次《检测报告》，以决定是否入围进行试用。又例如：基因敲除相关的细胞实验，培养的细胞要尽可能保持其原始状态，任何引导细胞衰老或凋亡的试剂，都会让后续的实验结果“失之毫厘，谬以千里”。所以，选择极低内毒素的血清，至关重要。同样，例如：原代培养，杂交瘤融合，细胞转染，难养细胞在体外的增殖（肝细胞，神经细胞，内皮细胞等）....这些细胞的培养都需要内毒素更低的血清，如果内毒素过高，对细胞造成的损害，会大大影响后续实验结果。还有一些细胞，实验室比较常用，经常复苏，培养，冻存，如此，血清会经常作用于细胞；还有的细胞需要培养的时间较长，血清会长时间作用于细胞；还有细胞典藏等项目，都需要使用更低内毒素的血清，以避免内毒素长久对细胞的毒性影响。因此，我们在挑选优质血清的时候内毒素是我们应该优先考量的条件之一。

细胞迁移，指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。移动过程中，细胞不断重复着向前方伸出突触/伪足，然后牵拉后方胞体的循环过程。细胞骨架和其结合蛋白，还有细胞间质是这个过程的物质基础，另外还有多种物质会对之进行精密调节。细胞的运动有很多种，有生理性运动，如发育过程中的细胞运动，生殖细胞、干细胞的成熟过程中的位置变化。也有病理性变化，如肿瘤的迁移和侵袭。从癌症的产生到转移，血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。癌症细胞增殖失控，短时间内可以繁殖出大量后代，这样首先会造成生长空间的局促和养分，如氧气的紧张。这样恶性肿瘤内会形成一片坏死区，正如上面在组织损伤里面提到的，机体会尝试“修复”这些损伤。坏死组织会释放出一系列促血管生成因子，如血管内皮生长因子以及各种免疫细胞，如巨噬细胞。巨噬细胞也会释放大量促血管生成细胞因子和生长因子。因此肿瘤的研究伴随着复杂的细胞运动，如肿瘤细胞沿着循环系统的运动，血管内皮细胞和免疫细胞进入肿瘤实体的运动。划痕法是经典的细胞行为学检测方法。在平铺的细胞单层上划出一条痕迹，然后清洗更换培养液后，细胞会从原有位置向划痕处迁移。统计划痕宽度和面积的变化就可以监控细胞迁移的速度和细胞迁移的能力。以前在做划痕实验的时候受到诸多限制：首先微孔板的孔不能太小，孔越小，枪头越难伸进去；其次划出的痕迹边缘歪斜，无法形成一条直线；孔与孔之间的划痕宽度也不均一。这给划痕这个时间梯度的实验带来了很大的困扰。在多次的拍照过程中，由于划痕宽度的差异性对于划痕拍照位置的复位要求甚高。然而随着细胞迁移的发生，细胞的原位的形态和分布也发生的动态变化。所以复位划痕的拍照位置成为就成为了一个力气活：既然无法准确找到，那就全部拍下；既然每个位置宽度不一，那就全部统计。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统的划痕套装。轻轻一划，解决全部困扰。借助Scratcher整齐的96针，可以在96孔微孔板底面整齐的划出宽度均一的划痕。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统可以盯住一个视野不停的拍。然后生成无抖动的视频。借助专业的划痕分析软件，对划痕宽度、面积、愈合速度进行分析，可以获取的参数包括：划痕面积划痕的覆盖度划痕的宽度划痕的愈合速度相对划痕密度对于原始细胞区域、原始划痕区域、划痕分界线、迁移后细胞的区域进行精准的划分，保证分析结果的精确。轻松的完成整个实验，再也不用熬夜拍划痕了。MuviCyte™ 已于2020年1月1日全新上线，借助它的多荧光通道和多种物镜选择，可以完成多种复杂的复杂细胞模型的拍摄和观察，在肿瘤免疫、干细胞等多个领域都有重要的应用。扫描下方二维码或点击下载链接，即可下载珀金埃尔默MuviCyte™ 活细胞成像系统相关资料。下载链接: http://hyw3rjq7ezkfsnvu.mikecrm.com/naj9QZD

遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies, IRDs）是可导致进行性视网膜退化的遗传缺陷性罕见疾病，常见的IRD相关基因缺陷超过200种。近几年，眼科领域的基因治疗临床试验项目数量激增，包括基因替换、基因编辑和基因沉默多个技术方面。2017年美国FDA首次批准了视网膜Voretigene Neparvovec基因疗法（Luxturna, Spark Therapeutics），用于治疗RPE65.1双等位基因突变引起的罕见眼科疾病，称为Leber先天性黑蒙。这个里程碑意义的决定为眼科疾病基因疗法打开了大门。目前大部分临床研究疗法目标是通过导入正常功能基因，从而恢复缺陷基因编码蛋白质的正常表达。在非临床研究和临床研究中，检测转基因目的蛋白表达是基因疗法开发的一个关键方面。 目前，有多种技术可实现目的蛋白表达定量检测包括配体结合法(Ligand binding assay，LBA)如酶联免疫吸附方法（ELISA）、液相色谱-质谱（LC-MS）、流式细胞术、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和组织染色技术。每种技术都有各自优势和局限，如目的蛋白为分泌性表达，可采用ELISA方法检测细胞培养上清液或体液系统中目标蛋白含量；如目的蛋白不能分泌表达，可采用Western Blot或质谱方法；如需要检测细胞膜蛋白，可采用流式细胞术；如要确定蛋白质在细胞和组织内分布，可采用免疫荧光检测。 在体内和体外模型中研究基因治疗产物与治疗靶点的相关作用机制和效应，选择生物相关性模型来检测目的基因表达和生物学活性非常重要。对于眼部疾病可探索选择临床前研究模型如细胞系模型、人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官疾病模型、啮齿动物和非人灵长类动物等，根据生物学相关性和测定时间可在不同阶段综合选择特异性评估模型。眼部疾病细胞模型案例1：iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）中低丰度大分子量蛋白质表达检测 从三名Stargardt病人皮肤活检样本产生多个iPS细胞系，这些患者都携带一个致病性ABCA4基因变异。采用RNA-Sep和Digital WB分析正常对照和患者细胞衍生的RPE。这个细胞模型与活检组织相比，可用于评估难以检测的非表达变异体，患者来源的细胞可能更密切地反映患者体内发生的剪接和编辑事件，可用于病人药物敏感性研究，指导临床试验。采用全自动Digital WB技术分析pABCA4蛋白质表达，制备了20 μg 总蛋白 dRPE 细胞匀浆，阳性和阴性对照分别是20 μg野生型和 ABCA4 敲除小鼠视网膜匀浆。参考下图，小鼠视网膜（Mouse ret）在野生型(WT)中pABCA4表达丰度很高，敲除（KO）小鼠没有表达。人类对照（NHDF）具有比WT小鼠视网膜更高表观分子量，同时有更高的表达丰度。与对照相比，所有患者细胞系（H、J和S）中均可检测到pABCA4 ，但这些低丰度pABCA4蛋白可能被降解，作为截短蛋白或降解产品形式存在（除S2外）。与mRNA表达谱结果一致，S2细胞系具有相对正常的pABCA4表达水平和修饰后成熟膜蛋白的分子量。本研究利用了Digital WB对低丰度和大分子量蛋白质分析检测能力。案例2：眼角膜内皮细胞信号通路中多重蛋白质表达检测 本研究采用人源和鼠源细胞，分别是敲低了SLC4A11表达水平的原代人角膜内皮细胞（primary human corneal endothelial cells, pHCEnC），即SLC4A11 (SLC4A11 KD pHCEnC)；还有Slc4a11+/+和Slc4a11-/-鼠角膜内皮细胞系（murine corneal endothelial cells, MCEnC），即 Slc4a11-/- MCEnC和Slc4a11+/+ MCEnC。比较转录组学分析揭示了SLC4A11 KD pHCEnC和Slc4a11-/- MCEnC中细胞代谢和离子转运功能抑制以及线粒体功能障碍，导致ATP生产减少。AMPK-p53/ULK1通路激活也表明线粒体功能障碍和线粒体自噬。稳态 ATP 水平降低和随后 AMPK-p53 通路激活提供了代谢功能缺陷和转录组改变之间的联系，以及 ATP 不足以维持 Na+/K+-ATPase角膜内皮泵的证据，这是 SLC4A11 相关角膜内皮营养不良特征性水肿的原因。所以SLC4A11缺陷角膜内皮中分子作用导致内皮功能障碍，是先天性遗传性角膜内皮营养不良 (congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED) 和Fuchs 角膜内皮营养不良的主要特征。 下图结果表明SLC4A11缺陷角膜内皮中AMPK-p53 通路激活，采用Digital WB检测信号通路中各蛋白质表达水平。图B说明与 scRNA pHCEnC 对照相比，SLC4A11 KD pHCEnC 中 p53 Ser15 磷酸化水平增加，表明p53转录翻译后激活。图C在Slc4a11-/- MCEnC晚期传代中观察到相似结果（p53 Ser18磷酸化增加，对应于人p53 Ser15）。图C和D结果表明在Slc4a11-/- MCEnC 早期和晚期传代中总 p53 水平增加，代表p53转录激活。进一步研究磷酸化和p53转录激活的激酶，根据报道AMPK介导 Ser15（小鼠中Ser18）磷酸化和p53转录激活，图B和C实验结果也说明AMPKα的Thr172磷酸化增加，AMPKβ1的Ser182磷酸化没有变化。图E和F，与 scRNA pHCEnC 相比，AMPK 另一种下游底物 Unc-51 样自噬激活激酶 1 (ULK1) 在SLC4A11 KD pHCEnC中磷酸化水平(Ser555)增加。综合这些结果表明，ATP水平下降导致AMPK及其下游底物p53 和 ULK1 激活，分别导致转录组改变和线粒体自噬增加。同样，鉴于 SLC4A11 在预防氧化损伤中的作用，SLC4A11 缺失导致线粒体 ROS 产生增加，随后线粒体功能障碍和线粒体自噬增加。此发病机制支持使用Slc4a11-/-小鼠作为SLC4A11相关角膜内皮营养不良的模型，评估各种治疗方法的转化潜力。 基于Digital WB技术的全自动蛋白质表达分析系统Jess可实现化学发光和荧光两种检测模式，是多重蛋白质表达分析有力工具。2022年，ProteinSimple发布了Stellar全自动双色荧光蛋白质表达检测方案，特别适合同步分析细胞信号通路磷酸化蛋白和总蛋白表达，将细胞信号通路研究工具带到一个新高度。iPSC衍生视网膜类器官模型案例1：Digital WB检测iPSC衍生的视网膜类器官中视紫红质表达含量 美国NIH研究人员利用成纤维细胞重编程获得诱导多能干细胞（iPSC），再分化产生视网膜类器官。通过转录组学分析，确定了视网膜类器官发育过程中调节信号，在体外生成了更成熟视网膜，可促进疾病建模和基因治疗研究。本研究采用Digital WB技术揭示了不同培养条件下类器官培养物种视紫红质（Rhodopsin）表达差异。下图结果表明，DHA处理的类器官在32天时视紫红质表达增加了30%，而亚油酸（LA）处理类器官视紫红质表达降低，这表明DHA处理的类器官中视紫红质表达增加不是脂肪酸添加带来的。案例2：AAV基因治疗的RetGC-GUCY2D视网膜类器官疾病模型 Leber先天性黑蒙可由多种不同突变基因导致包括RPE65、CEP29、GUCY2D和CRX等。其中Leber先天性黑蒙1型由GUCY2D基因突变导致，可导致严重视力损害或失明。GUCY2D基因正常拷贝编码了一种鸟苷酸环化酶（RetGC），其是感光器生理学中关键酶之一，视网膜中光敏杆状细胞和视锥细胞使用该酶将光转换为电化学信号。 英国MeiraGTx公司研究人员利用CRISPR/CAS9 技术生成 RetGC 敲除 (RetGC KO) 视网膜类器官，iPSC衍生视网膜类器官分化后，将RetGC KO 视网膜类器官与同一细胞系的野生型类器官进行对比研究。总共设计了四种 AAV 载体来测试RetGC 蛋白在光感受器中的恢复情况，所有载体采用AAV7递送。CMV 和视紫红质激酶 (RK) 两个启动子，并评估了WoodChuck肝炎病毒翻译后调控元件 (WPRE) 影响。采用Digital WB检测6组类器官中RetGC蛋白表达水平。实验结果揭示，与非转导样本组比，所有载体设计均以不同效率产生RetGC蛋白。加入WPRE似乎显示出效力降低趋势，通过其他量化指标验证了这个趋势。 Digital WB相比传统Western blot，只需要几十分之一样本量就可实现类器官等珍贵样本中蛋白质定量检测，而且重复性更高和速度更快，非常适合眼部疾病类器官模型的转基因目的蛋白及相关通路蛋白表达分析。“全自动Digital WB技术是眼部疾病蛋白质表达定量的重要工具 Jess全自动数字化蛋白质表达定量分析系统 (Digital WB) 是Bio-Techne集团旗下蛋白质分析品牌ProteinSimple所有。系统利用毛细管电泳免疫学分析技术，可从微量样品中自动吸取、分离、捕获蛋白质，并通过化学发光或荧光检测目的蛋白含量。针对眼部疾病基因治疗应用技术优势Digital WB技术适合眼科基因治疗体外和体内各种模型中转基因目的蛋白表达定量分析，用于视网膜细胞系、iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）和类器官、小鼠动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白质分析。适合于基因治疗研发的不同阶段对转基因目的蛋白及相关信号通路蛋白检测需求。满足类器官和视网膜微量样本蛋白质分析需求，Digital WB技术样本量需求是传统Western Blot几十分之一，只需要3 μL样本量就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合眼部疾病微量珍贵样本蛋白质分析。Digital WB精准定量检测，传统Western Blot只能满足样本半定量需求，重复性比较差。基因治疗某些目的蛋白表达与临床治疗效果相关联，可作为替代生物标志物，建立量效关系。要求目的蛋白分析检测标准需要提高，要求技术需要经过严格验证，Digital WB可满足这些需求。符合基因治疗产业对自动化标准化和效率的需求，面对行业激烈竞争，需要提升研发效率。Digital WB实现了全自动化和标准化，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求。系统3个小时完成一批次蛋白质分析，比传统Western Blot快4倍，大大提高了实验效率，同时减少人力成本。 Digital WB自动化程度高、重复性好、灵敏度高和具有较宽动态检测范围，这些特点满足眼部疾病基因治疗项目不同阶段的目的蛋白定量需求。Digital WB已被国内外知名基因治疗机构采用如Biogen, Sarepta Therapeutics, MeiraGTx，ATGC, Spark Therapeutics，Regenxbio，CRISPR Therapeutics, Editas Medicine, Bluebird bio，杭州嘉因生物、中国食品药品检定研究院等，必将在基因治疗研发阶段、非临床研究和临床研究阶段发挥更大的作用。扫描下方二维码，获取更多关于Digital WB资料参考文献： Gordon, Kathleen Del Medico, Amy Sander, Ian Kumar, Arvind Hamad, Bashar (2019). Gene therapies in ophthalmic disease. Nature Reviews Drug Discovery.MacLaren, R.E. A 2020 vision of ocular gene therapy. Gene Ther 28, 217–219 (2021).基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）Thilo M. Buck and Jan Wijnholds. Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors (rAAV)-Vector Elements in Ocular Gene Therapy Clinical Trials and Transgene Expression and Bioactivity Assays. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4197.Annemieke Aartsma-Rus, Jennifer Morgan, et at. Report of a TREAT-NMD/World Duchenne Organisation Meeting on Dystrophin Quantification Methodology. Journal of Neuromuscular Diseases. 6 (2019) 147–159Beekman C, Janson AA, Baghat A, van Deutekom JC, Datson NA (2018) Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy. PLoS ONE 13(4): e0195850.Matynia A, Wang J, Kim S, Li Y, Dimashkie A, Jiang Z, Hu J, Strom SP, Radu RA, Chen R, Gorin MB. Assessing variant causality and severity using retinal pigment epithelial cells derived from Stargardt disease patients. Transl Vis Sci Technol. 2022 11(3):33Zhang W, Frausto R, Chung DD, et al. Energy shortage in human and mouse models of SLC4A11-Associated corneal endothelial dystrophies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2020 61(8):39Brooks et al., Improved Retinal Organoid Differentiation by Modulating Signaling Pathways Revealed by Comparative Transcriptome Analyses with Development In Vivo, Stem Cell Reports (2019)Arifa Naeem, etc. RetGC-GUCY2D retinal organoid disease model for AAV gene therapy development. MeiraGTx LTd

细胞是生命的最小单位，细胞生物学是生命科学研究的重要领域。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员陈正军表示，细胞在地球上的物质形态演化过程同时也是地球生命演化的过程，“了解了细胞，我们就能了解生命”。细胞生物学与人类活动息息相关细胞生物学是研究生命活动的一个重要前沿学科方向。这一学科分支众多，主要关注细胞形态结构、细胞生命活动功能、细胞遗传调控以及细胞与其生命活动环境当中的各种关系。陈正军表示，人类需要把细胞研究清楚，通过研究细胞的生命活动过程、基因调控以及细胞与微环境的关系，可以了解细胞的健康活动和发育过程。而如果缺乏对相关研究的掌握，我们便会很难认识目前面临的各种疾病，如炎症、癌症等病理细胞的活动过程等，也很难针对这些疾病的发病机制进行有效的治疗。细胞生物学与人类生活息息相关，陈正军举了一些生活中常见的人体生理反应例子来解释细胞的生命活动。他介绍，小孩皮肤光滑、湿润，但随着年龄增长也会有皱纹出现，这一过程就是人体细胞的变化过程，保养皮肤的过程其实就在保养我们的面部细胞。“平时给予身体充沛的营养，进行自由运动，及时调整心理情绪，就是在保养人体细胞，调整人体大脑神经细胞健康活动，助力身心健康。”细胞生命活动受内外因素共同作用真核多细胞生命体由各种各样的细胞所组成，不同种类的细胞组成不同组织器官，执行相应组织器官的功能和行为，协同完成人体生命活动。人体从受精卵细胞发育成一个完整的个体，伴随了细胞的增殖、分化、迁移等各种细胞行为。陈正军的研究领域则包括了细胞极性与细胞迁移、增殖和肿瘤发生的相关性研究。他介绍，细胞在迁移过程中需要定位到特殊的位置上，形成一种特殊的细胞极性状态，占据它所在的功能部位并执行其生命活动过程。一个细胞如何在体内发挥作用？陈正军认为这是一个十分有趣且深奥的科学问题。细胞活动受到细胞自身遗传物质、蛋白质分子的调控，同时细胞内部的这些分子和功能单位，也会受到细胞外环境因素的影响。两者共同相互作用，使得单个细胞可以产生不同的生命活动。具体来讲，细胞生长需要改变自身的结构状态，这一过程伴随胞内各种信号物质、蛋白质、信号通路等发生变化。其中，细胞通路的变化则受部分外界因素的影响，例如化学因素、物理因素甚至生物因素。而在体内环境中，生长因子作为一种外环境因素，对细胞行为如细胞生长、迁移等的影响极为重要。细胞生长因子可实现不同细胞的功能需求细胞生长因子是促进细胞生命活动一类细胞因子广泛的概念，比如说，表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和内皮细胞生长因子等，都称为细胞生长因子。不同细胞生长因子就会帮助不同细胞维系其不同生命活动功能，如细胞增殖、迁移和分化等。不同细胞种类对细胞生长因子的需求也不同，不同的细胞生长因子也能协同调控一种细胞活动过程，比如说表皮细胞生长因子和血小板衍生生长因子对上皮细胞的增殖促进作用，多种不同细胞生长让细胞来执行不同的生命活动。每个细胞在特定的环境下都可以分泌产生细胞生长因子，通过细胞之间互相刺激或者刺激自身发挥作用。以口腔黏膜或者肠道的上皮细胞自我修复为例，当上皮细胞产生损伤，需要修复即重新执行自身的增殖功能时，上皮细胞会启动常规活动以外的一种机制，分泌生长因子帮助自己，甚至帮助周围细胞进行修复，完成功能需求。细胞生长因子通常呈多肽分子配体，可以直接与表皮生长因子受体结合，结合之后受体会把信号转到胞内，细胞内接着启动一系列蛋白质的相互作用和偶联酶促化学反应，这一过程为细胞的信号转导通路激活，通过瀑布效应放大生物信号，启动和激活细胞增殖、迁移、分化等生命活动。因此，细胞生长因子在细胞生命活动过程中起着非常重要的作用。

在哺乳动物的大脑中，许多不同类型细胞形成复杂的相互作用网络，从而实现广泛的功能。由于细胞的多样性和复杂的组织，人们对大脑功能的分子和细胞基础的理解受到了阻碍。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞表观基因组分析的发展使发现大脑中许多分子上不同的细胞类型成为可能[1，2]。然而，这些研究中有限的样本量可能导致对大脑细胞多样性的低估。此外，了解大脑功能背后的分子和细胞机制不仅需要对细胞及其分子特征进行全面的分类，还需要详细描述分子定义的细胞类型的空间组织和相互作用。在更精细的尺度上，细胞之间的空间关系是通过相邻分泌和旁分泌信号传递的细胞间相互作用和通信的主要决定因素。虽然突触通信可以发生在细胞体相距较远的神经元之间，但神经元和非神经元细胞之间的相互作用以及非神经元细胞之间的相互作用通常借助直接的体细胞接触或旁分泌信号，因此需要细胞之间的空间接近。而且涉及局部中间神经元的相互作用也倾向于发生在空间近端神经元之间。因此，一个高空间分辨率的全脑细胞图谱对于理解大脑的功能极其重要。来自美国哈佛大学的庄小威教授课题组使用多重误差鲁棒荧光原位杂交（MERFISH）技术对整个成年小鼠大脑中大约1000万个细胞中的1100多个基因进行了成像，并通过整合MERFISH和scRNA-seq数据，在全转录组尺度上进行了空间分辨的单细胞表达谱分析。研究人员在整个小鼠大脑中生成了5000多个转录不同的细胞簇（属于300多种主要细胞类型）的综合细胞图谱，将该图谱与小鼠大脑共同坐标框架进行定位，可以系统量化单个大脑区域的细胞类型组成和组织，并进一步确定了具有不同细胞类型组成特征的空间模块和以细胞渐变为特征的空间梯度。这种高分辨率的细胞空间图—每个细胞都具有转录组表达谱，有助于推断数百种细胞类型对之间的细胞类型特异性相互作用和预测这些细胞-细胞相互作用的分子（配体-受体）基础和功能。总之，此研究不仅为大脑的分子和细胞结构提供了丰富的见解，而且为其在健康和疾病中的神经回路和功能障碍奠定了基础。该结果于近日发表在Nature上，题为“Molecularly defined and spatially resolved cell atlas of the whole mouse brain”。研究小组通过MERFISH技术对横跨4只成年小鼠（1雌3雄）大脑整个半球的245个冠状面和矢状面切片上进行成像，根据DAPI和总RNA信号，单个RNA分子被识别并被分配到细胞，进而得到单个细胞的表达谱。总之，该研究对成年小鼠大脑中大约1000万个细胞进行成像和分割，包括11个主要的大脑区域：嗅觉区、等皮层（CTX）、海马形成、皮质底板（CS）、纹状体（ST）、苍白球、丘脑、下丘脑（HT）、中脑、后脑和小脑。基于典型相关性分析整合MERFISH数据和scRNA-seq数据，采用K最近邻(k-NearestNeighbor,KNN)分类算法对MERFISH细胞进行分类。为了对不同大脑区域的细胞类型组成和组织进行系统定量，他们将MERFISH生成的细胞图谱注册到艾伦脑科学研究所发布的小鼠脑三维图谱第三版（Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework，CCFv3）[3]，可将每个单独的MERFISH成像细胞及其细胞类型身份标签放入3D CCF空间（图1）。图1 对整个小鼠大脑的分子定义和空间分辨的细胞图谱（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）据统计，整个小鼠大脑由46%的神经元和54%的非神经元细胞组成，神经元细胞与非神经元细胞的比例在后脑中最低、在小脑中最高。神经元细胞包括315个亚类和超过5000个集群，其类型也表现出很强的区域特异性，大多数神经元亚类仅在11个主要区域中的一个区域富集。这11个主要区域包含了不同数量的细胞类型，尤其是后脑、中脑和下丘脑所包含的神经元细胞类型的数量以及局部复杂性远远高于其它大脑区域。基于神经递质转运体和参与神经递质生物合成相关基因的表达，他们将成熟的神经元分为8个部分重叠的组别。其中，谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸（GABA）能神经元分别约占神经元总数的63%和36%，谷氨酸能与GABA能神经元的比例在不同的大脑区域中差异很大，而5-羟色胺（5-HT）能、多巴胺能、类胆碱能、甘氨酸能、去甲肾上腺素能和组胺能神经元仅占神经元总数的2%（图2c）。谷氨酸能神经元和GABA能神经元广泛分布于全脑，可分为具有不同空间分布的不同细胞类型；在谷氨酸能神经元中，Slc17a7（Vglut1）、Slc17a6（Vglut2）和Slc17a8（Vglut3）在不同的脑区分布存在差异，Slc17a7主要位于嗅觉区、CTX、海马形成、CS和小脑皮层，而Slc17a6主要位于HT、中脑和后脑（图2d，e）。他们还观察到两个未成熟神经元（IMNs）亚类：一种是抑制性的，一种是兴奋性。抑制性IMNs由30个簇组成，沿脑室下区（SVZ）分布，通过前连合处延伸至嗅球；兴奋性IMNs由七个簇组成：簇516主要位于嗅觉区域，而其它簇沿海马体形成的齿状回分布（图2f），这与之前关于海马形成中成人神经发生的发现一致[4]。图2 神经元细胞的类型和空间分布（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）非神经元细胞包括23个亚类和117个簇。通过量化，研究小组发现在整个大脑中，非神经元细胞由30%少突胶质细胞、6%少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、28%血管细胞、23%星形胶质细胞、8%免疫细胞和5%其它类型细胞组成。一些非神经元细胞类型，特别是星形胶质细胞和心室系统中的细胞也表现出很强的区域特异性。星形胶质细胞包括36个细胞簇，最大的两个集群Astro 5225和Astro 5214，分别占星形胶质细胞总数的48%和33%。基本上每个Astro星团都显示出独特的空间分布，Astro 5225只位于端脑区，Astro 5214只位于非端脑区，Astro 5215位于丘脑，Astro 5216位于后脑，Astro5231-5236位于嗅球，Astro 5207位于小脑，Astro 5222位于齿状回，Astro 5208富集于靠近软脑膜表面的髓质，Astro 5228、5229和5230位于SVZ沿线，延伸至嗅球，并与抑制性IMNs广泛共定位（图3d）。少突胶质细胞在纤维束中富集，在整个脑干中十分丰富，而OPCs则均匀分布地整个大脑；在集群水平上，一些少突胶质细胞和OPCs也表现出区域特异性，如Oligo 5277在皮层中富集，而Oligo 5286在后脑中富集（图3e）。与心室系统相关的细胞也呈现区域特异性分布，在第三脑室，下丘脑室管膜—胶质细胞位于腹侧区域，而ependymal细胞占据背侧区域，Hypendymal细胞位于第三脑室背侧的下联合器，心室内的主要细胞是脉络膜丛细胞和血管软脑膜细胞（VLMCs）。除了VLMC 5301和VLMC 5302，大多数VLMC集群被限制在软脑膜（图3f）。图3 非神经元细胞的类型和空间分布（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）接下来，研究团队为每个细胞定义了一个局部细胞类型的组分矢量，并使用这些矢量聚类细胞，从而得到了包含相似邻域细胞类型组成的细胞的“空间模块”（图4a）。他们确定了16个一级空间模块和130个二级空间模块，一级空间模块将大脑分割成与CCF中定义的主要大脑区域基本相吻合的区域，一个显著的差异是中脑和后脑之间的边界（图4b，c）。许多2级空间的模块与CCF中定义的子区域一致，但观察到更多的差异（图4d）。此研究中的空间模块描述是基于单个细胞的转录组范围内的表达谱所定义的细胞类型，因此比CCF中脑区描述的信息具有更高的分子分辨率，空间梯度代表了对该区域的分子轮廓的更精确的描述。图4 空间模块：分子定义的大脑区域（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）考虑到在某些情况下，细胞的基因表达谱可能会表现出渐进或连续的变化，他们因此检查了所有的细胞亚类，结果发现细胞的空间梯度广泛分布在大脑的许多区域。例如，颅内（IT）神经元在整个CTX上形成了一个连续的梯度，在这个区域，基因表达沿皮层深度方向逐渐变化，但第2/3层IT神经元的分离更为明显（图5a）。在纹状体中，D1和D2中棘神经元均沿背外侧-腹内侧轴形成空间梯度（图5b，c）。在外侧间隔复合体（LSX）中，几个GABA能亚类沿着背腹轴形成了一个梯度（图5d）。在海马体的CA1、CA3和齿状回区域和中脑的下丘中也观察到空间梯度。他们也观察到了一些非神经元细胞之间的空间梯度，如下丘脑室管膜—胶质细胞，沿着第三脑室的背腹轴形成了一个连续的梯度（图5e）。通过基于UMAP（一致的多方面逼近和投影以进行降维）的基因表达可视化分析，他们发现一个大规模的跨越HT、中脑和后脑区域的空间梯度（图5f）。图5 分子定义的细胞类型的空间梯度（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）最后，他们分析了亚类水平上的细胞类型，并推断单个大脑区域中细胞类型特异性的细胞-细胞相互作用（包括非神经元细胞间，非神经元细胞和神经元之间以及神经元间）。几百对细胞亚类被确定，统计学结果显示有显著的相互作用。预测的大多数具有相互作用的细胞类型对包含多个配体-受体对，与同一细胞类型对中的非近端细胞对相比，近端细胞对的表达显著上调，为这些细胞间相互作用的分子基础提供了见解。在非神经元细胞之间，发现内皮细胞和周细胞均与大脑中的边缘相关巨噬细胞（BAMs）、巨噬细胞有显著的相互作用。在这两种情况下，与非近端细胞对相比，来自层粘连蛋白信号通路的配体-受体对在近端细胞对中均明显上调，一些细胞因子（内皮细胞中的Cytl1和周细胞中的Ccl19）在BAMs近端血管细胞中表达上调，这说明大脑中的血管细胞可能利用这些细胞因子来招募巨噬细胞（图6d，e）。小胶质细胞也被发现与内皮细胞、周细胞之间的显著相互作用；与内皮细胞相比，周细胞与小胶质细胞相互作用的可能性更高，而与BAMs相互作用的趋势则相反（图6f，g）。他们还观察到神经元和非神经元细胞之间的显著相互作用，例如星形胶质细胞和抑制性IMNs在嗅球中、星形胶质细胞和兴奋性IMNs在海马形成中表现出显著的相互作用。此分析也预测了一些神经元亚类之间的相互作用，例如，海马形成过程中Pvalb枝形吊灯状GABA神经元和CA3谷氨酸能神经元之间、IPN Otp Crisp1 GABA神经元和中脑的DTN-LDT-IPN Otp Pax3 GABA神经元之间的相互作用。图6 细胞间的相互作用和通信（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）文章结论与讨论，启发与展望通过MERFISH技术成像约1000万个细胞，并将MERFISH数据与全脑scRNA-seq数据集整合，该研究生成了一个具有高分子和空间分辨率的、横跨整个小鼠大脑的分子定义的细胞图谱。进一步将该图谱注册到了艾伦脑科学研究所发布的CCF中，提供了一个可被科学界广泛使用的参考细胞图谱，使科研人员能够确定每个大脑区域不同转录细胞类型的组成、空间组织和潜在的相互作用。一方面，非神经元细胞与神经元细胞或非神经元细胞之间的相互作用，以及配体-受体对、基因的相关上调，为测试不同非神经元细胞类型的功能作用提供了切入点。另一方面，将转录组成像与不同行为范式下的神经元活动成像相结合可以揭示神经元的功能角色[5]。未来的研究将结合空间分辨的转录组学分析和各种其它特性的测量（如表观基因组谱、形态学、细胞的连通性和功能、系统的基因扰动方法），将有助于大家阐述大脑的分子和细胞结构的功能和功能障碍在健康和疾病中的作用。MERFISH（Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization），一种空间分辨的单细胞转录组学方法，经过近年的发展已成为生命科学领域中最具有前景的单细胞测序技术之一。该技术独特的原理和方法,可实现对单细胞进行多重靶向探测,从而深入研究细胞的生物学特性,对于疾病诊治及药物研发等方面也有着广泛的应用价值。

白细胞介素- 1（interlenkin 1，1L-1）的间接作用，可使内毒素引起机体发热。本篇文章介绍IL-1的受体分泌及调节介绍。IL-1的受体有两种：IL-1RⅠ和IL-1R Ⅱ。三种IL-1都能与受体结合，IL-1Ra与受体结合后不引发信号转导效应，但可抑制IL-1α和IL-1β同受体结合。上述两种受体常常表达在同一细胞中，但不同的细胞仅优势表达某一种受体。IL-1RⅠ是相对分子质量为80000的糖蛋白，人的基因位于2号染色体长臂上。主要表达在内皮细胞、平滑肌细胞、T细胞，肝细胞、成纤维细胞、角质细胞和表皮树突状细胞等。IL-1RⅠ高度糖基化，阻止糖基化会降低其生物学活性。IL-1R Ⅰ的胞质内肽链较长，并参与信号转导，与Toll受体的胞质区显著同源，故称为Toll/白细胞介素同源区域（Toll /in-terleukin-1 homologous region，TIR），缺乏酪氨酸激酶的活性。人IL-1R Ⅰ mRNA约5kb，编码569个氨基酸残基，细胞外320个氨基酸残基构成3个免疫球蛋白样功能域，跨膜区有19个氨基酸残基，其余230个氨基酸残基在胞质内。IL-1受体辅助蛋白（interleukin-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）其胞外和胞质结构域与IL-1RⅠ具有同源性，IL-1与IL-1RⅠ结合亲和力较低，可使构象发生改变，并被IL-1RAcP识别，参与受体复合物的形成，能够增强其亲和力，使之发挥生物学效应。IL-1RⅡ主要表达在B细胞、单核细胞和中性粒细胞中。IL-1R Ⅱ的 mRNA约1803bp，编码386个氨基酸残基，是相对分子质量为68000的糖蛋白。该蛋白质含有5个糖基化位点，经过N-糖苷酶处理使糖链分解后，相对分子质量为55000。IL-1RⅡ细胞外的332个氨基酸残基构成3个免疫球蛋白样功能域，其胞内只有很短的29个氨基酸残基，没有信号转导功能。用抗IL-1RⅡ抗体不能阻止IL-1的信号转导，用抗IL-1RⅡ抗体能够有效地阻止IL-1的信号转导。IL-1RⅡ是一个诱骗分子，可为IL-1的自身负反馈。将IL-1RⅡ的细胞外部分与IL-1RⅠ的胞质内部分嵌合构建的嵌合受体能够与IL-1结合并能转导信、号效应。可溶性IL-1受体：健康人和某些病理组织液中可检查到IL-1R Ⅰ和 IL-1RⅡ的胞外结构部分为可溶的IL-1受体，但其具体的生物学作用不是很清楚。IL-1的信号转导途径用图9-1表示。

【研究背景】血管生成是指从现有血管中内皮细胞生长而生成新的血管，一旦血管开始生成，被称为细胞的特殊内皮细胞就会开始发芽过程。由此，血管芽内皮细胞的长出标志着血管生成的开始，这一过程在生理学和病理生理学过程中至关重要。然而，细胞外基质（ECM）的机械特性如何调节细胞的形成在一定程度上被忽视了。细胞的特性是血管生成和组织工程的关键，它可以定向迁移到无血管区域，对终形成的血管形态起决定作用。迄今为止，各种生化信号分子因素如 MST1-FOXO1等多见报道，然而功能血管的建立需要生化和生物力学信号线索的结合，后者取决于组织工程和再生医学中使用的生物材料的特性。近期，北京大学口腔医学院的郭亚茹博士以作者在Bioactive Materials发表了题为：Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis的研究文章。文章报道了基质硬度通过p-PXN-Rac1-YAP信号轴调节细胞形成，这项工作不仅有助于在组织工程和再生医学中寻找佳材料，也为肿瘤治疗和病理性血管再生提供了新的治疗策略。在生物材料设计和治疗一些病理情况方面具有特殊意义。邓旭亮教授为本文通讯作者。【研究概述】在这项研究中，作者研究了基质硬度对细胞形成的影响，并探索了基础机制。在肝癌细胞的外层发现CD31表达更高，组织硬度也更高。基质的硬度增加可以显著增加血管的生成和细胞富集基因的表达。硬度较大的基质增加了FAK和p-PXN的局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，进而导致细胞骨架组织和细胞刚度增加。随后，YAP作为下游的力效应因子被激活并易位入核，上调靶基因的表达，终促进细胞的形成。p-PXN还可以减少细胞间的连接，从而促进细胞的形成。由此表明：基质硬度可通过p-PXN-Rac1-YAP信号轴调节细胞的形成。 【研究结果】硬度的增加还可以促进血管的生成（图1D），从三维（3D）EC球体（图1E）的芽入侵距离增加可证明这一点。与GM60和GM30凝胶（图1F）相比，硬凝胶（GM90）中球体的芽数量增加了2倍。qPCR分析表明，细胞富集基因，包括CD34、VEGFR2、DLL4、CXCR4、EFNB2和IGF2，在GM90基质（图1G）中显著上升。同时，更硬的凝胶中芽的宽度更厚，矩阵中含有更多和长的纤维状体（图1H和I）。由此数据表明，基质硬度增加可以促进血管生成和细胞的形成。图1. 基质硬度增强血管生成和细胞在体外和体内的形成。 在EC球形发芽模型中，从球体中产生的外层细胞和以下细胞分别被定义为细胞和茎细胞。未爬出球体的细胞被定义为密集细胞（图2A）。通过原子力显微镜（AFM），我们检测到每个细胞的16个位置，并制作了典型的力学热图（图2B）。细胞的刚度在数量上是茎细胞的两倍，是咽细胞的四倍（图2C）。此外，免疫荧光染色表明，细胞显示长应力纤维的增强组装，而在茎和密集细胞作用捆绑是相对较短的，并限制在细胞外围（图2D）。研究人员发现细胞中的YAT显示出明显的核定位，而YAT在咽细胞（图2D和E）中成为细胞质。通过免疫荧光、多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术和原子力显微镜AFM，发现细胞扩散区域增加（图3A），粘附力（图3B和C）和细胞硬度（图3D），这表明 EC-ECM 连接增加，并通过 ECM 硬化提升细胞机械特性。另外，VP（YEP抑制剂）治疗显著降低了EC球体的延伸次数和芽入侵距离（图2F和G）。细胞富集基因也被VP（图2H）抑制。因此，可以推断基质硬度调节了ECs的细胞机械感知和机械传输，促进了YAC活化，终增强了细胞的形成。图2. 细胞、茎细胞和密集细胞的机械特性差异。图3. FluidFM粘附力检测过程示意图。 在确定了血管生成和细胞形成中EC亚型之间的机械差异后，作者探讨了ECM刚度通过PXN磷化调节细胞的形成，验证了 p-PXN 在硬 ECM 诱导细胞规范中的参与程度，进而推断，通过基质硬化强加的细胞形成需要PXN磷酸化。随后，作者验证了p-PXN-Rac1-YAP激活在ECM僵硬诱导细胞形成和血管生成体内的作用，研究人员通过在裸鼠体内皮下注射 HepG2 细胞创建肿瘤模型，并从 8 天起每天使用 VP 治疗一次（图4F）。4周后，在肿瘤胶囊（图4G）上发现发芽较少的血管，CD31、CD34和VEGF强度（图4H，图4I ）。VP治疗减少肿瘤体积（图4J）。这些数据表明p-PXN-Rac1-YAP信号轴与ECM硬化促进的细胞形成和血管生成有很大关系。图4. p-PXN-Rac1 通过激活 YAP 促进细胞的形成和血管生成。 图5. 发芽血管生成受ECM硬度影响的潜在机制的示意图。 综上，基质的硬度增加可以显著增加血管的生长、发芽和细胞富集基因的表达。硬度较大的基质增加了FAK和p-PXN在局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，进而导致细胞骨架组织和细胞刚度增加。随后，YAP作为下游的力效应因子被激活并易位入核，上调靶基因的表达，终促进细胞的形成。 【研究意义】本研究加深了我们对细胞形成和血管生成机理的理解，有助于优化组织工程和再生医学的生物材料设计，为一些病理情况提供新的治疗策略。无论是组织工程还是血管再生，都应考虑机械特性，如针对细胞形成的刚度，以设计佳功能生物材料。此外，ECM可以在许多病理状态下变硬，如癌症的发展过程，随着变硬癌周围细胞数量的增加，迫切需要靶向p-PXN、Rac1或YAP的药物来有效防止肿瘤的生长和转移。 【研究利器】——FluidFM技术在生物活性材料领域的创新应用本实验研究人员采用了多功能单细胞显微操作系统——FluidFM技术，实现了单个细胞的分离，单个细胞粘附力的测量。瑞士Cytosurge公司多功能单细胞显微操作系统——FluidFM，是集原子力系统、微流控系统、细胞培养系统为一体的单细胞操作系统。主要功能包括单细胞注射、单细胞提取、单细胞分离、单细胞粘附力的测定、生物3D打印等。实验中FluidFM探针以3 μm/s靠近细胞，设定力为100 nN。当探针连接到到达设定点的细胞时，在探针中施加-650 mbar 的力，并保持5 s，以确保细胞被探针完全抓取。然后，在保持-650 mbar的压力，以1 μm/s的速度将探针抬高至100 μm的高度，从而将细胞从基板上完全分离。FluidFM系统完全记录了每个单细胞的Z轴高度和力距离曲线，并分析其粘附强度。每个条件下至少测量并获得20个力距离曲线。所有细胞粘附测量实验过程都是在 37 °C在5% CO2细胞培养环境下进行。图6. FluidFM进行单细胞分离示意图。 图7. FluidFM进行单细胞力谱测定示意图。 【文末小视频】 本研究实际DEMO视频【联系方式】为了更好的服务客户，Quantum Design中国子公司也为大家提供样品测试、样机体验机会，还在等什么？赶快联系我们吧！ 电话：010-85120277/78 邮箱：info@qd-china.com，期待与您的合作！【参考文献】[1] Y. Guo, F. Mei, Y. Huang, S. Ma, Y. Wei, X. Zhang, M. Xu, Y. He, B.C. Heng, L. Chen & X. Deng. Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis. (2021) Bioactive Materials.

95-D 人高转移肺癌 95-D细胞 THC-8307 人高分化结肠腺癌细胞系 THC-8307细胞 HuH7-HCV 人感染HCV肝癌细胞,HuH7-HCV细胞 JRDC071 人肝转移癌 HCCLMS细胞, THLE-3 人肝永生化细胞,THLE-3细胞 LX-2 人肝星形细胞正常 LX-2细胞 LX-2 人肝星形细胞,LX-2细胞 HL-7702 人肝细胞正常 HL-7702细胞 QSG-7701 人肝细胞,QSG-7701细胞 FL62891 人肝细胞,FL62891细胞 HIBEpiC 人肝内胆管上皮细胞,HIBEpiC细胞 CASC111 人肝母细胞瘤细胞,HuH-6细胞, ED-25 人肝静脉内皮细胞,ED-25细胞 CASC204 人肝胆管癌细胞,RBE细胞, PLC/PRF/5 人肝癌亚历山大细胞,PLC/PRF/5细胞 HCCC-9810 人肝癌亚力山大细胞,HCCC-9810细胞 MHCC-97H 人肝癌细胞系（高转移）MHCC-97H细胞 LM-6 人肝癌细胞系 LM-6细胞 Human bel7402 人肝癌细胞系 Human bel7402细胞 Hep-3B 人肝癌细胞系 Hep-3B细胞 MHCC-97L 人肝癌细胞（低转移）MHCC-97L细胞 SNU-739 人肝癌细胞,SNU-739细胞 SNU-475 人肝癌细胞,SNU-475细胞 SNU-449 人肝癌细胞,SNU-449细胞 SNU-398 人肝癌细胞,SNU-398细胞 SMMC-7721 人肝癌细胞,SMMC-7721细胞 SK-HEP-1 人肝癌细胞,SK-HEP-1细胞 QGY-7703 人肝癌细胞,QGY-7703细胞 QGy-7701 人肝癌细胞,QGy-7701细胞 Li-7 人肝癌细胞,Li-7细胞 Human SMMC-7721 人肝癌细胞,Human SMMC-7721细胞 Human SK-HEP-1 人肝癌细胞,Human SK-HEP-1细胞 HUH-7 人肝癌细胞,HUH-7细胞 HHCC 人肝癌细胞,HHCC细胞 HepG-2 人肝癌细胞,HepG-2细胞 HepG2.2.1.5 人肝癌细胞,HepG2.2.1.5细胞 Hep3b 人肝癌细胞,Hep3b细胞 Hep3B2.1-7 人肝癌细胞,Hep3B2.1-7细胞 Hep G2 人肝癌细胞,Hep G2细胞 JRDC054 人肝癌细胞,hep 3B细胞, Hep 3B2.1-7 人肝癌细胞,Hep 3B2.1-7细胞 HCC-9724 人肝癌细胞,HCC-9724细胞 H7402 人肝癌细胞,H7402细胞 FL62891 人肝癌细胞,FL62891细胞 Bel-7405 人肝癌细胞,Bel-7405细胞 BEL-7402 人肝癌细胞,BEL-7402细胞

高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见的卵巢癌病理亚型，75%以上的患者首诊时已是晚期，常伴有广泛的网膜转移和腹水产生。此外，免疫检查点阻断等免疫治疗手段仅在10%左右的卵巢癌病人中起效。研究表明，卵巢癌腹水中的成纤维细胞亚群可以通过激活肿瘤细胞中的JAK/STAT通路以影响患者的预后及其对免疫治疗的响应。然而，卵巢癌腹水环境中的其它细胞类群对其肿瘤微环境的影响方式和途径仍不明确。7月24日，北大张泽民教授课题组与上交大附属新华医院汪希鹏课题组、上海免疫学研究所李子逸博士以“Single-cell analyses implicate ascites in remodeling the ecosystems of primary and metastatic tumors in ovarian cancer”为题在Nature Cancer杂志联合发表了研究论文，揭示了卵巢癌腹水对肿瘤原发和转移病灶微环境的重塑作用。研究人员对5个肿瘤相关部位，包括原发性卵巢肿瘤（Pri.OT）、网膜转移瘤（Met.Ome）、腹水、盆腔淋巴结（PLN）和外周血（PB），进行了单细胞转录组测序和T细胞受体(TCR)测序，共将223,363个高质量单细胞编入五个主要细胞谱系，并通过规范标记表达进行注释，从而描画出了 OC TME 的综合图谱。B细胞和CD4 T细胞在PLN中占主导地位；而淋巴细胞和单核细胞构成了PB样本的主要细胞成分；在Pri.OT和Met.Ome中鉴定出了五种主要细胞系，而且大多数细胞类型的富集模式在这两个部位之间没有明显差异，这表明原发性和转移性肿瘤细胞的发展都需要类似复杂的TME。腹水经常出现在晚期卵巢癌患者中，与化疗反应有关，腹水中含有大量免疫细胞和基质细胞，其中，CD8 T 细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）是腹水的主要成分，表明腹水中存在炎性微环境。5个部位的单细胞测序描画了晚期卵巢癌图谱与非恶性细胞不同，由推断拷贝数变异（inferCNV）定义的肿瘤细胞表现出很强的患者间异质性。值得注意的是，所有腹水样本中都发现了肿瘤细胞，平均比例为 2.7%（53499 个样本中的 1444 个），这与 OC 肿瘤细胞更倾向于 "播种"到腹腔而不是通过血管扩散的观点一致，凸显了腹水与 OC腹腔内扩散之间的紧密联系。此外，推断CNV分析表明，在Met.Ome中发现的肿瘤细胞亚克隆也可在Pri.OT中检测到，表明这些亚克隆是腹膜转移的致瘤群体。通过对单细胞转录组和 T 细胞受体（TCR）的系谱追踪和轨迹推断，研究人员鉴定了多个具有不同分布模式的T细胞群，并揭示了OC中T细胞从腹水到肿瘤组织的潜在动态特征。他们发现腹水富集的记忆T细胞（CD8 GZMK T++EM和 CD4 T+CM）可能是TIL的潜在重要补充库，包括CD8 T+EX和 CD4 T+H1样细胞，特别是对于Met.Ome。这些结果暗示了腹水在T细胞浸润期间塑造OC的TME的潜在作用。此外，作者描述了腹水和肿瘤组织中巨噬细胞的功能状态和本体，肿瘤富集的巨噬细胞偏向于单核细胞来源的本体，而腹水中的巨噬细胞更多来源于组织驻留巨噬细胞（RTM）。HGSOC 中肿瘤富集巨噬细胞和腹水富集巨噬细胞的两种不同功能状态此外，研究人员还鉴定了恶性腹水中的 MAIT细胞和树突状细胞，以及原发性肿瘤中的两个内皮亚群，通过比较不同化疗响应情况的患者治疗前样本中细胞亚群的分布情况，发现肿瘤原位灶中VCAM+内皮细胞占比较高的HGSOC患者对化疗敏感，而IL13RA1+内皮细胞的占比高则提示患者对化疗耐药，这可能是治疗效果的一个重要评价指标。总之，该研究提供了女性恶性腹水生态系统的全貌，为其与肿瘤组织的联系提供了有价值的见解，并为OC疗效评估和治疗耐药性的潜在标志物的开发提供了重要参考。卵巢癌（OC）是一种异质性疾病，由具有不同组织学亚型、分子生物学和微环境特征的恶性肿瘤组成，是致死率最高的妇科恶性肿瘤，占女性癌症死亡人数的 5%。在所有 OC 类型中，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是最常见的组织学亚型，占 OC 患者的 70%以上。一旦确诊，超过 75% 的 HGSOC 患者病情已到晚期，并伴有广泛转移和腹水。据报道，由于网膜的脂肪结构和腹膜循环，OC 患者通常会向网膜转移。虽然化疗加贝伐单抗的治疗可延长患者的 5 年生存期，但总体疗效仍然有限。此外，免疫检查点抑制剂等免疫疗法在临床试验中的客观反应率仅为 10%，而由于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的比例和质量不同，OC 亚型往往对免疫疗法表现出不同的反应。因此，描述 OC 的肿瘤微环境（TME）特征至关重要，因为肿瘤微环境中的多种细胞成分在疾病进展和治疗反应中发挥着重要作用。

细胞培养在各位研究生的日常实验中占据了相当多的时间，你的细胞如果有幸养的很好，真是你好我好大家好，实验事半功倍；细胞培养差的学生，说多了都是泪，自挂东南枝了，一把鼻涕一把泪。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用的技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等，那下面进入正题，分享一下细胞培养的秘籍。以动物细胞为例，动物细胞培养需要的一些特殊条件。① 加胎牛血清培养基：动物细胞离体培养常常需要血清。各种细胞合成培养基（如MEM、RPMll640、DMEM）只提供细胞生长所需的各种基础营养物质，包括碳水化合物、氨基酸、无机盐、维生素等。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。根据不同细胞的需求，一般含有10%～20%的血清培养基即可维持细胞较快的生长增殖速度。② 无菌环境：无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。使用的各种试剂和耗材要经过高压或紫外线灭菌。严格的无菌操作是养好细胞的必要前提。为防止细胞受到微生物感染，可在培养基中加入双抗。③ 温度和气体环境：一般动物细胞在体外培养的适宜温度是37℃，不适宜的环境温度会影响细胞的生长甚至死亡。二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，一般维持在5%。二氧化碳既是细胞的代谢产物，又与维持培养液的pH密切相关。如何防控污染：保持良好的操作习惯，超净台要紫外灭菌30min，以70%的乙醇擦拭无菌操作台，开启超净台风扇运转数分钟后，才开始实验。每次只处理一种细胞，以免失误混淆或细胞间污染，操作不要触碰吸管尖头部或容器口等。像对待孩子一样养细胞，它很脆弱，最好每天关注一下，以免出现培养箱缺二氧化碳，停电、温度不够等现象。避免全军覆没，好细胞要及时保存，有备用的细胞，这样即使有细胞污染还可以有备用的细胞顶上，不至于太恼火，好习惯要保持。不同细胞喜好不同，需要在培养中慢慢体会，例如平滑肌细胞比较好长，2-3天可能就会有很多细胞，应该算是比较好养活的；内皮细胞分泌物较多，需要时不时换洗才会长的好等等。培养好的细胞会被安排不同的实验，有的看趋势、有的看状态、有的看蛋白表达，有的看共定位，最终它们都会和显微镜打交道，那我们就聊聊显微镜和细胞的不解之缘。根据不同的细胞实验需求，使用的显微镜也不尽相同：Echo Rebel数字化显微镜，具备明场、相差观察方式和正倒置一体特点。可以观察培养瓶、孔板和培养皿里面的细胞形态，根据细胞状态，您可以及时调整实验条件。同时Echo Rebel数字化显微镜具有自动细胞计数和测量等功能，可以用来细胞计数和做细胞划痕实验，如果您的细胞不涉及到荧光实验，Echo Rebel数字化显微镜基本可以满足你的需求。▲ 成骨细胞▲ 细胞计数Echo Revolve Gen2荧光显微镜具有自动荧光系统可以做到开机即用，一键荧光系统切换，搭配的DHR和Z-Stack功能可以使细胞成像更清晰。即可以做到明场观察细胞形态，同时也可以做GFP蛋白转染的细胞实验。Echo Revolve Gen2荧光显微镜还可以用来检测是否转染进细胞。DHR和Z-Stack的搭配可以更清楚的研究细胞内蛋白分布表达情况等。Echo Revolution自动化显微成像系统具备Revolve的所有功能并在此基础上升级，使之专为活细胞观察而生。HyperScan高速拼接大视野成像功能，即可以快速扫描整个样品孔又能解决高倍镜下视野小的问题，可以更清晰和整体的观察细胞形态。延时摄影成像功能（TimeLapse）结合自动对焦与长时间锁焦，再搭配活细胞工作站和全自动载物台，可以实现活细胞长时间观察，从而研究细胞的生长和发育过程，对研究干细胞诱导分化成器官的整个过程具有重要意义。而孔板导航成像功能（Multi-well Point）可以对不同孔位进行自定义扫描和观察，研究不同实验条件对活细胞的影响。培养细胞需要耐心及不断的积累和摸索，了解它们，呵护它们，相信这个小小的细胞会成长的很好。小编就先介绍到这里，我们的显微镜可以申请试用哦，请拨打电话010-57256059联系我们。

基于免疫检查点抑制剂（ICIs）的免疫治疗正在成为一种革命性的肿瘤治疗方案，仅适用于一小部分癌症患者。ICIs的临床反应主要依赖于肿瘤组织中浸润的效应T淋巴细胞（CTL）识别并杀死肿瘤细胞。然而，肿瘤组织中CTL浸润较为有限，且复杂的瘤内物理屏障严重阻碍CTL的浸润，削弱了ICIs的治疗效果。因此，如何重塑肿瘤内物理屏障以增强CTL的浸润成为提高ICIs介导的免疫治疗迫切需要解决的难题。　　1月29日，中国科学院上海药物所研究员张志文、李亚平，以及沈阳药科大学教授王思玲团队合作完成的最新研究成果，以Bioinspired lipoproteins of furoxans-oxaliplatin remodels physical barriers in tumor to potentiate T-cell infiltration为题，在线发表在《先进材料》（Advanced Materials）上。该研究提出并证实利用仿生脂蛋白系统高效递送一氧化氮（NO）供体-奥沙利铂前药，通过重塑肿瘤物理屏障促进CTL瘤内浸润、增强ICIs免疫治疗的新策略。 　　对乳腺癌及结肠癌的临床样本检测发现，肿瘤部位广泛存在各种细胞外基质组分但CD8+ T浸润严重缺乏。基于此，科研团队设计合成了一种细胞内还原响应的NO供体-奥沙利铂前药（FO），构建高效靶向瘤内各种基质细胞的仿生脂蛋白系统（S-LFO）。研究显示，S-LFO能够在肿瘤部位高效蓄积、渗透进入肿瘤深部区域，并可到达瘤内肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和血管内皮细胞（ECs）等基质细胞。S-LFO处理后能够显著促进肿瘤血管正常化、灌注能力和血管密度，降低TAMs和CAFs的比例，清除Collagen、Fibronectin和chondroitin sulfate等主要细胞外基质成分，为促进CTL的瘤内浸润铺平了道路。进一步研究发现，S-LFO能够显著增加肿瘤部位CD3+CD8+ T细胞以及表达IFN-γ、Granzyme B亚型的比例，与对照组相比分别提高2.96、5.02和8.65倍，并显著促进CD8+ T细胞向瘤内4T1-GFP癌细胞区域的浸润和扩散能力，进而在胰腺癌PANC02、乳腺癌4T1和结直肠癌CT26等肿瘤模型中，与aPD-L1合用显著增强了抑制肿瘤生长和延长存活期的疗效。该策略为重塑肿瘤基质屏障提高CTL浸润增强ICIs的免疫治疗效果提供了新方法。　　　　　　　　　　研究工作得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金和复旦-SIMM联合研究基金等的资助。　　论文链接

“ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片”入围具有国际威望的2016德国工业行业奖专业研发活细胞分析产品的德国ibidi公司凭借为细胞迁移和运输研究设计发明的独特的“ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片”于2016年4月20日在德国慕尼黑再次入围2016年德国工业行业奖（生物技术领域）。德国工业行业奖是由享有盛誉的“德国工程师协会”赞助下设立的，由“胡贝尔出版社新媒体有限公司”颁发。至今已经连续11年颁发了针对特殊商业、社会、科技、生态效益等领域的工业奖项。这是ibidi公司继 2012年第二次获得这个荣誉。今年，ibidi公司从500名申请者中脱颖而出，入围生物技术领域的前三甲。科研人员可以用高分辨率显微镜直接观察“ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片”中培养的单种或多种细胞。其多孔玻璃膜独特的透光性是现今市面上常用的不透明的多聚膜插件不可比拟的。 “ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片”具有两个交叉的通道结构，透明的多孔玻璃膜就在这个交叉的位置。细胞可以培养在玻璃膜的两侧。然后用相差或者荧光显微镜就能直接观察。独特的通道设计能够对比在流动剪切力条件下培养的细胞与静置培养的细胞形态，生理状态的差别。“ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片”可以在平滑肌细胞与剪切力条件培养的内皮细胞的共培养，动态剪切应力情况下的白细胞的迁徙和癌细胞侵袭等特殊试验中应用。优点总结：（与传统transwell做细胞侵袭实验对比）（1）这个载玻片做细胞侵袭，可以实时观察细胞侵袭的情况，transwell做侵袭的话，只能中断侵袭才能观察了；（2）用这个载玻片还可以选择让细胞从下往上侵袭，平常的transwell实验，细胞都是从上往下的，有可能是重力也造成影响了；（3）这个载玻片还能配合流体环境做侵袭实验，更真实地模拟体内血管或淋巴管的细胞侵袭，transwell是做不到的；（4）还能直接在这些通道里做细胞免疫荧光实验，更方便实验观察。 ibidi公司董事长Dr.Roman Zantl形容ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片是“可以能够直接研究肿瘤细胞是如何进入血液中的。这对于研究如何防止癌症转移有着非比寻常的意义。”他还高兴的表示“ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片”入围德国工业行业奖说明了ibidi产品在医学和生物技术领域获得了广泛的认可。Ibidi公司CEO Dr.Valentin Kahl表示“ibidi细胞侵袭带膜通道载玻片”是由BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung)资助的，是KMU创新计划中“生物光电技术”研究项目的一部分。能够获得如此殊荣，是与合作伙伴密不可分的。关于ibidi公司德国ibidi公司位于德国慕尼黑附近马丁斯雷德，是一个研发专注于细胞功能检测的显微镜相关耗材产品的公司。产品包括经典细胞培养实验耗材和细胞功能性研究（例如，血管生成，趋化，和伤口愈合等）的实验耗材。主要客户是医学、生物学及生物技术、药理学等科研机构，产品销往世界各地的客户。

在新型冠状病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia, NCP）的各个诊疗方案中，我们仍然能够发现与流式细胞术相关的检测得到了不少认可与建议，那么，究竟流式细胞术在新型冠状病毒感染的诊断与治疗中，有哪些用途呢？这些基于流式的检测又是否对临床具有实际意义的帮助呢？我们从现有的已经官方发布的新型冠状病毒肺炎的诊疗方案中，寻到了建议进行流式相关检测的依据。即，对于新型冠状病毒感染，在有条件的情况下，建议进行淋巴细胞亚群和细胞因子的检测。针对已确诊的2019-nCoV病人建议留观后第3、5、7天及出院时依据病情可，若有条件可检查血细胞，肝肾功能，肌酶+肌红蛋白，凝血、CRP；第5-7天若有条件可复查PCT及TB淋巴细胞亚群11项。而进行淋巴细胞亚群和细胞因子的检测，最常用的检测方法即流式细胞术。由于对2019-nCov的机制尚在研究中，我们参考了与之相似性很高的SARS的诊治方案和研究结果，来共同探讨一下这些检测的临床意义。其他研究显示，在SARS治疗过程中，糖皮质激素的应用会使T淋巴细胞及亚群发生不同程度减低，因此，外周血T淋巴细胞亚群的动态监测，有助于SARS-Cov致病机制的研究和诊断，并对于指导治疗（尤其糖皮质激素应用的试剂、剂量等）以及提示预后具有重要价值。3还有很多研究揭示了细胞因子在冠状病毒感染中扮演的重要角色。Chen J等人在2010年发表的，利用BALB/c小鼠模式，对SARS-CoV感染的细胞免疫反应进行的研究显示，细胞因子在病毒感染后的早期（如TNF-α, IL-6, 趋化因子CXCL10, CCL2, CCL3, CCL5等）和疾病进程中（如 TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-5, IL- 6, 趋化因子CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL3和CCL5等）均有增高，这些细胞因子的增高，要么与早期炎症细胞的募集相关，要么与病毒清除，肺部损伤肺部炎症产生相关。5另有研究认为，SARS感染后，机体会因为受到较强的外界刺激而产生过度免疫，出现细胞因子风暴。而细胞因子风暴会造成的肺毛细血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞的弥漫性损伤，引发急性呼吸急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）。6最新发表在Lancet上的针对2019-nCoV 感染的研究揭示，感染2019-nCoV的患者有大量的IL1B、IFNγ、IP10和MCP1增高，可能与激活Th1细胞免疫反应有关。然而，2019-nCoV感染也启动了抑制炎症的Th2细胞因子（如IL4和IL10）分泌的增加，这与SARS-CoV感染还是不同的。进一步比较ICU患者与非ICU患者，发现ICU患者血浆IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP1、MIP1A、TNFα的浓度均高于非ICU患者，提示细胞因子风暴与疾病严重程度相关（图2）。7由此可见，检测病毒感染者的细胞因子的情况，有助于了解机体在冠状病毒感染后的一系列免疫应答状态，为疾病治疗和预后判断提供重要依据，同时也为探索新型冠状病毒的致病机制提供更多的线索。当然，对于新型冠状病毒的研究仍在继续，流式细胞术能贡献的检测指标也远不止淋巴细胞亚群和细胞因子，在条件允许的情况下，纳入更多有潜在意义的检测指标，也很有可能为探索新型冠状病毒感染的更优诊疗方案，以及致病机制研究带来新的助益和指引。参考文献1. 新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）2. 北京协和医院关于 “新型冠状病毒感染的肺炎”诊疗建议方案（V2.0）3. 传染性非典型肺炎(SARS)诊疗方案[J].现代实用医学,2004(02):119-126.4. He Z, Zhao C, Dong Q, et al. Effects of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus infection on peripheral blood lymphocytes and their subsets[J]. International Journal of Infectious Diseases, 2005, 9(6): 323-330.5. Chen J, Lau Y F, Lamirande E W, et al. Cellular Immune Responses to Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) Infection in Senescent BALB/c Mice: CD4+ T Cells Are Important in Control of SARS-CoV Infection[J]. Journal of Virology, 2010, 84(3): 1289-1301.6. 张艳丽, 蒋澄宇. 细胞因子风暴:急性呼吸窘迫综合征中的主宰生命之手[J].生命科学,2015,27(05):554-557.7. Huang C, Wang Y, Li X, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China[J]. The Lancet, 2020.

p　　有些细胞在血液和组织中的含量很少但却很重要，比如干细胞、循环内皮细胞、循环肿瘤细胞和残留病变细胞。准确检测和分析这些稀有细胞，是理解疾病进程和发育机制的关键。然而稀有细胞检测并不是一件容易的事，会受到样本质量等多种因素的影响。/pp　　流式细胞技术能对每个细胞进行多种定量分析，是在血液、骨髓等组织中检测稀有细胞的有力工具。稀有细胞检测往往需要大量样本才能采集到足够的数据，这个时候传统流式细胞仪也有些发怵，因为大样本意味着处理时间长，如果不想牺牲检测灵敏度，就不能贸然加快进样速率。/pp　strong　声波聚焦技术，不做任何无谓的牺牲/strong/pp　　样本溶液注射到流式细胞仪的时候，细胞是随机分布在三维空间内的。让这些细胞逐个穿过激光束，对于准确采集数据非常重要。绝大多数流式细胞仪通过快速流动的鞘液实现这一点。鞘液带动细胞并将其限制在中心位置，进而建立单细胞流，这一过程称为水动力聚焦。/pp　　与传统水动力聚焦不同的是，声波聚焦技术利用超声波将细胞紧密聚集在样本流中间，汇聚成一条直线。这种超声波大于2 MHz，与医学成像中的超声波类似。声波聚焦流式细胞仪基本不受进样速率的影响，能使细胞强聚焦于激光检测点，与样本-鞘液的比率无关。/ppstrong　　不牺牲通量和精度/strong/pp　　传统的水动力聚焦技术受到了不少限制。流速提高会增大样本流的宽度，使细胞的聚焦效果下降。细胞偏离激光中心越远，激发光强度变化就越大，CV值也越高。研究人员经常需要在分析通量和精度之间寻求平衡。/pp　　声波聚焦技术在很大程度上与进样流速无关，不论样本流与鞘液流的比例如何，都能使细胞紧密地聚集于激光检测焦点，避免分散。这样可以采集更多光子，在极高的样本通量下保证高精度分析。/pp　　声波聚焦流式细胞仪在高达1 mL/min的进样速率下也能维持精确聚焦，让研究人员能够获得更小的CV值，更好地鉴别弱阳性信号和背景，实现更小的差异和更好的信号分离。/pp　　不牺牲检测速度稀有细胞检测一般需要采集大量细胞，才能获得准确而可靠的结果。在这种情况下，传统流式细胞仪需要很长的处理时间。不过，声波聚焦流式细胞仪的样本运行速率非常快(可达1,000μL /min)，每次运行可采集2000万个细胞。这么高的样本采集速率和样本量可以帮助人们快速准确地检测稀有细胞，不会影响数据的质量。/pp　　不牺牲珍贵样本样本制备对稀有细胞检测有很大的影响。举例来说，洗脱和裂解红细胞(RBC)会造成严重的细胞损失和损伤。声波聚焦流式细胞仪支持无洗脱、无裂解的流式实验方案，可以最大程度的保留珍贵样本，避免不必要的细胞损失，简化样本制备步骤。/pp　　研究人员可以通过有目的地稀释样本来取代洗脱和裂解步骤，快速而有效地分析浓度较低的样本，比如脑脊液(CSF)、干细胞以及细胞数量较少的稀释样本。对于小鼠血液、骨髓等难以采集的样本、细针抽吸样本或低细胞产量样本，研究人员可以直接染色和稀释，无需洗脱或红细胞裂解。/pp　　值得一提的是，声波聚焦流式细胞仪处理全血样本可省去样本制备，既没有样本损失，也不会影响数据质量。/ppstrong　　选择流式细胞仪需要知道的事/strong/pp　　近三十年来，流式细胞仪已经成为科研和临床领域不可或缺的重要工具。不论你是不是第一次购买流式细胞仪，入手一个新平台都需要考虑很多因素。为了找到最适合自己的那一款，我们需要了解一些事：/pp　　流式细胞仪主要由三个部分组成：液流系统、光学系统和电子系统。液流系统将颗粒或细胞送给激光束进行检测。光学系统负责照明并将光信号引导到适当的检测器。而电子系统将光信号转变为电脑可以处理的电信号。/pp　　检测参数同时检测多种细胞参数，是流式细胞仪的一大优势。我们在选择流式细胞仪时一定要明确自己对参数的需求。因为一次实验能检测多少参数，取决于流式细胞仪配备的激光器和检测器。比如Attune® NxT声波聚焦流式细胞仪采用模块化设计，能够配置多达4种激光和14色荧光检测，适用于多参数分析。/pp　　检测性能了解流式细胞仪的灵敏度、分辨率、动态范围、检测能力和检测速度，可以帮助我们缩小选择范围。购买流式细胞仪是一笔不小的投资，我们不仅需要认清目前的研究需求，还应全面考虑到未来几年的应用。/pp　　样本类型现在绝大多数流式细胞仪都能处理几微升到几百微升的样本。如果细胞非常稀少，我们就需加大样本量同时尽量避免细胞损失。在这种情况下，Attune® NxT声波聚焦流式细胞仪将是不错的选择。这种流式细胞仪特别适用于稀少细胞和珍贵样本的检测。/pp　　系统软件流式细胞仪用起来顺不顺手，在很大程度上取决于其系统软件。除了方便性以外，我们还需要了解软件是否能呈现我们所需的数据，以及可不可以定时更新升级。Attune的采集和分析软件很直观而且功能强大，适合各种经验水平的用户。/pp　　实验室空间每一个实验室的空间都是有限的，越来越紧凑正是流式细胞仪的发展趋势。Attune声波聚焦流式细胞仪就是这样一种小巧方便的台式设备。/pp　　除此之外，购买流式细胞仪之前我们还需要了解多方面的信息，比如仪器的自动化程度，厂家提供的技术支持和培训，仪器的兼容性和可拓展性等等。br//p

瑞士Cytosurge AG公司的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是将原子力系统、微流控系统、细胞培养系统合为一体的单细胞操作系统，采用不同孔径的微型纳米注射器，可实现单细胞注射（Injection）、活细胞内物质提取（Extraction）、单细胞分离（Isolation）、粘附力测定（Adhesion）、纳米打印(Nano-printing)等多种功能，全程机械臂操纵，将污染风险和人为误差降到低，提高工作效率与实验可重复性，具有高度自动化、操作速度快与操作度高等特点，能够在单细胞水平上为研究者提供大的便利，可应用于单细胞质谱、单细胞力谱、单细胞基因编辑、细胞系构建、药物研发、医疗等领域。北京大学生命科学学院公共仪器中心的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是国内套多功能单细胞显微操作系统，于2020年9月顺利安装于金光楼126室并开始试运行，由公共仪器中心覃思颖老师负责接样测试与维护管理。目前本中心的FluidFM BOT系统已成功应用于单细胞注射与物质提取（小鼠体外培养原代海马神经元、昆虫叶蝉细胞、MDA-MB-231细胞等）、单细胞分离（植物细胞原生质体、U2OS细胞等）与粘附力测定（细菌侵染细胞时细菌的粘附力、血管内皮细胞对不同基底的粘附力等）等多方面科研需求。以下是多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT的多个功能应用与实例介绍。FluidFM BOT结合原子力系统、微流控系统于一体（https://doi.org/10.1021/nl901384x）FluidFM BOT功能应用单细胞注射实例FluidFM BOT可以将多种不同类型的可溶性物质注入细胞核或细胞质中，可量化注射体积（fL别），可实现批量注射（每小时注射超过100个细胞），尤其适用于使用传统方法难转染的细胞，且对细胞几乎没有损伤。CHO细胞的Lucifier Yellow染料注射C57小鼠体外培养原代海马神经元DIV7的Dextran染料注射（北大生科院数据）活细胞内物质提取实例FluidFM BOT系统的活细胞内物质提取功能十分温和，可直接用微型纳米注射器吸取活细胞的细胞质或细胞核中的物质，无需经过化学或生物学手段进行破膜处理，不会产生裂解的细胞碎片，不会对内部细胞器造成任何破坏，可用于电镜成像、酶活检测、核酸表达检测、代谢组学、基因测序等多方面研究。活细胞提取物可结合电镜观察、酶活测定、转录检测等分析手段（http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.06.025）HeLa细胞的细胞质物质提取单细胞分离实例FluidFM BOT可进行无损细胞分离，对于悬浮细胞，可将细胞吸取并转移释放即可。对于贴壁细胞，可在探针的样品池中加入消化液如胰酶，对指定位置的细胞进行消化，然后再进行吸取与转移释放。FluidFM BOT实现的单细胞分离存活率很高，结合单细胞注射可实现快速转染细胞并建立单克隆细胞群，对于工程细胞株的建立十分有效。植物原生质体的单细胞分离（北大生科院数据）贴壁细胞CHO的单细胞分离粘附力测定实例FluidFM BOT系统通过负压将细胞吸附在探针针孔处，对细胞的吸附力比蛋白结合更加牢固，能够直接将细胞从基底上分离。这种方法不需要激活细胞的任何信号通路，可以得到接近细胞原生的数据。不同的探针针孔直径（2、4、8um）可适用于不同大小的细胞粘附力测定，我们甚至可使用孔径为300nm的探针进行更小个体的吸附与粘附力测定，目前在本中心的FluidFM BOT系统已成功应用于金黄色葡萄球菌侵染大鼠肠上皮细胞时的细菌粘附力测定（nN别）。不同大小的单细胞粘附力测定（https://doi.org/10.1038/s41598-019-56898-7）纳米打印实例FluidFM BOT系统还是一台纳米打印设备，可以在实验器材上铺设特定的基底膜，如打印亲水或亲脂性物质，从而实现对细胞贴壁的操纵，构建不同的细胞模式，实现对细胞信号转导机制、肿瘤细胞群落迁徙、神经细胞树突或轴突形成的研究。CMD基底打印cRGDfK的细胞贴壁生长Pattern研究（DOI: 10.1021/acs.langmuir.8b03249）多功能单细胞显微操作系统在高性能单元的监控下，通过全自动的工作站实施操作，可确保实验的平稳、顺利的进行。探针有多种孔径规格可选，也可结合FIB技术进行探针定制，结合不同的探针可实现各式各样的应用，以上仅展现部分应用，更多的新功能有待各位老师与同学结合自己的课题需求进行探索与发掘，欢迎大家联系前来测试样品！

宫颈癌是全世界女性第四大常见恶性肿瘤，每年可造成30多万人死亡。宫颈鳞癌（CESC）作为宫颈癌主要病理类型约占75%，通常经历由正常宫颈到宫颈上皮内瘤变再到CESC的发生和进展过程。然而，CESC进展过程中上皮和微环境细胞相互作用关系及其关键分子途径的发展尚不清楚。2023年1月27日，山东省肿瘤医院于金明院士、岳金波教授团队与解放军总医院第五医学中心刘兵研究员团队合作在Science Advances杂志上发表了题为Single-cell dissection of cellular and molecular features underlying human cervical squamous cell carcinoma initiation and progression的研究论文。为宫颈癌的诊疗提供了疾病诊断与预后的生物标志物和潜在的治疗靶点。为了阐明了宫颈上皮细胞的转录致瘤轨迹并揭示了 CESC 启动和进展中涉及的关键因素，文章作者对来自对四组13例不同病变阶段的宫颈组织（包括NC、CIN、早期CESC和晚期CESC）的起始和进展过程中，上皮细胞、巨噬细胞、NK和T细胞、内皮细胞、成纤维细胞的转录组变化及亚群特征进行了深入探索。该研究通过单细胞转录组测序，进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）构建了宫颈鳞癌发生和进展过程中的细胞和分子特征图谱，发现了大量肿瘤发生和进展相关的新的细胞亚群和分子。在此基础上，提出了针对“CESC生态系统“进行分析的必要性，尤其是考虑到免疫系统是作为一个动态的整体，简单对于单个细胞亚型的描述不足以展现更大的”全景“。围绕这个目标，在文章中通过大量的转录组数据，研究者发现几个细胞簇的相对丰度显示与较短的存活期显着相关：CCL20 +Mac、APOE+Mac、epi7、CD56+NK、TH17、耗尽的CD8 +T、PODXL+EC、TNFRSF9高Treg和 mCAF。相反，其他细胞簇的丰度与更长的存活率显着相关：pDC、CD16+NK、GZMK+CD8+T、ZNF683+CD8+T、CLEC9A+DC、epi8和肥大细胞。 实验部分除了转录组测序相关之外，作者使用TissueGnostics公司TissueFAXS Plus全景组织细胞定量分析系统获取图像。在长存活率相关的因素中，作者重点提出了CESC中的epi8的高相对丰度可以促进我们观察到的高水平T细胞浸润从而增强与肿瘤细胞的串扰。文中作者表示，尽管对 CESC 进行了大量的转录组分析，但这些方法无法提供对主要细胞参与者、它们的相互作用伙伴以及驱动疾病发生和发展的关键分子途径的高分辨率洞察，尤其是CAF，作为肿瘤微环境中的关键组成部分，其通过多种机制促进恶性生长和侵袭 ，而且空间 CESC 信息对于理解细胞簇的位置及其相互作用很重要，但在 scRNA-seq 分析的解离过程中存在丢失。多重免疫荧光标记与转录组测序为了揭示了 mCAF 和 vCAF 的两个主要亚群，作者选择使用TissueFAXS Cytometry技术了，通过多重免疫荧光标记验证了它们在人类 CESC 中的存在，发现 mCAF 表达高水平的与促肿瘤途径相关的基因（主要位于富含胶原蛋白的基质条纹内），以及细胞间相互作用分析表明，mCAF 可主要通过 NRG1/ERBB3途径促进 CESC 进展，该途径参与抗雄激素对前列腺癌的抗性，在之前的研究中尚未报道。这部分内容也是TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry技术在关键领域取得的最新科研进展之一。Fig 1 CESC样本组织切片中的T细胞（PAN-CK(红色)、HLA-DR(蓝色)、IDO1(绿色)和CD3(灰色)）的多重免疫荧光标记图像。在较短存活期显著相关的因素中，作者研究了CESC进展过程中基质癌相关的呈现为细胞（mCAF）的亚群特征，发现mCAF可能促进CESC的进展，并进一步发现其作用机制是通过NRG1/ERBB3 通路来实现的。Fig 2 多重免疫荧光CESC组织样本中mCAF和vCAF上的特异性标记物。Fig 3 mCAF肿瘤特异性配体-受体对的多重免疫荧光标记，包括NRG1-ERBB3和Wnt5A-FZD6。&bull 单细胞测序技术完成了细胞水平的组学研究，但是获取的信息内缺失了细胞的空间分布信息。如果想要补充细胞的空间位置表型，就需要引入多重免疫荧光技术。多色免疫荧光技术通过单细胞分辨率的组织成像，能够多靶点、可视化地描绘细胞的复杂空间位置信息，从而揭示细胞间的相互作用关系，细化微环境的空间结构。&bull 单细胞测序技术与多重免疫荧光技术的结合能够多层次、多角度、多组学地研究肿瘤微环境及免疫微环境，同时获悉胞间联系、基因空间变化等信息，并赋予关键基因的细胞分布信息和组织分布信息，从而更加精准地研究疾病相关分子机制并探索潜在的治疗靶点。同时作者也在讨论部分，使用TissueFAXS Cytometry技术生成的数据，可以针对人体组织进行更详细的研究，以回答 scRNA-seq 无法解决特定问题。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等信息物质在细胞间转运的载体, 是细胞与细胞间通讯的重要媒介，参与大量正常生理和病理过程，包括感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管和其他炎症性疾病、癌症和凝血障碍等，因此研究EV在人类健康和疾病中的作用具有重要意义。EVs常分为三类外泌体 (30-150 nm) ，在胞体内区室中形成多囊泡小体，随后与质膜融合后从细胞中释放。微囊泡或微粒 (100-1000 nm) ，这是质膜起泡/出芽以及随后从细胞中释放的结果。凋亡小体 (1000-5000 nm) ，由凋亡细胞释放。目前还没有特异性标记物可以最终鉴定不同类型的囊泡。因此，我们把这些小的生物颗粒统称为细胞外囊泡。细胞外囊泡示意图EVs检测研究表明，不同疾病状态下，组织器官释放到体液中的EVs的数量及所包裹的物质是完全不一样的，因而通过检测分析EVs的特性即可对相关疾病进行精准诊断、预后判断及指导治疗。EVs具有尺寸小、异质性高且数量巨大等特点，一直以来，检测灵敏度都是EVs研究中的一个重大挑战。虽然一些关于EVs的检测是利用传统流式细胞术开展的，但也暴露出了明显的局限性，一方面由于传统流式仪器更适用于检测细胞，而细胞表面结合的荧光分子数量远远多于EVs表面；另一方面，一些传统流式仪器在检测小于500 nm单个颗粒上表现吃力。因此，想要准确的检测EVs，就需要更强大且具备高通量功能的检测工具。Amnis 成像流式的技术优势近年来，随着Amnis成像流式技术的发展，越来越多的研究利用这项技术解决了EVs检测这一难题。Amnis技术的核心是使用时间延迟积分CCD (TDI-CCD)进行信号检测。与光电倍增管(PMT)相比，CCD具有更大的动态范围、更低的“噪声”和更高的量子效率，使其更适合测量微弱信号。与传统流式细胞术相比，这种方法信号整合时间更长，噪音低，灵敏度大幅增加，对研究EVs具有独特的优势。Amnis技术EVs应用案例分享以下研究体现了Amnis 成像流式技术在小颗粒检测中的高灵敏度特点。检测脂质体和微球流式技术对比用常规流式技术 (A-B)和成像流式技术 (C-D)获得的200 nm大小的荧光标记脂质体和不同尺寸的聚苯乙烯珠(220、450、880和1300 nm)。Amnis成像流式可以清晰地分辨出缓冲液背景信号(灰色)以上的所有脂质体(粉色)，而常规流式仅能通过荧光分辨出一小部分脂质体。健康人类供体的血浆微粒检测(a)从6名健康供体中获取无血小板血浆，并使用CD235(红细胞)、CD41(血小板)、CD45(白细胞)和CD146(内皮细胞)标记物进行染色以确定微粒细胞的来源。(b)利用CD14(单核细胞)、CD66b(中性粒细胞)和CD3(淋巴细胞)标记物进一步对白细胞微粒进行表型分析，以确定其来源细胞。下方是图库中事件的代表性图片。(c)表为N = 6例供体的绝对计数±SEM。如图所示，Amnis成像流式技术可实现不同来源的外泌体的精准鉴定与计数。单核细胞内化外泌体检测(a)用Amnis成像流式技术分析PKH67标记的外泌体。BF和FITC荧光图像(E)所示。(b) PKH67预标记外泌体与外周血单个核细胞共孵育。使用AmnisIDEAS软件内化功能测量外泌体的内化程度。Amnis成像流式技术不仅实现了PKH67标记的外泌体鉴定，同时也实现了单个核细胞内化外泌体检测，且呈现直观图像佐证结果准确性。小结综上，Amnis成像流式技术做到了真正意义上的流式数据可视化。既具备传统流式可大量检测样本的特点，又利用高灵敏度TDI-CCD技术针对每个检测到的外泌体颗粒进行成像，并可通过海量形态学数据分析EVs与亲本细胞或靶细胞间的相互作用。Cytek Amnis ImageStreamx Mk II 成像流式细胞分析仪以上研究均通过 Cytek Amnis ImageStreamX Mk II 仪器完成。通过将流式细胞术的表型分析能力、高速度和高灵敏度等优势，与荧光显微镜技术在细胞形态学细节的洞察力和针对细胞功能研究的深度有机结合在一起，Amnis ImageStreamXMk II 平台可高速获取每个细胞的多个图像，包括明场、暗场 (SSC) 和多达 10 色荧光标记。ImageStreamX Mk II 通过高分辨率成像，可以定位荧光蛋白表达位置（细胞膜、细胞质或者细胞核），实现超乎想象的广泛应用需求。技术特点应用广泛：样本利用率高达 95%，可以更高效的方式分析稀有细胞。简单易用：简单友好的用户界面，可实时观察全部细胞图像和统计学数据。配置灵活：最高可升级至 6 根激光器。功能强大：提供数百种量化成像分析参数，实现无与伦比的广泛应用。参考文献：Erdbrügger, Uta, and Joanne Lannigan. "Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques." Cytometry Part A 89.2 (2016): 123-134.Headland, S., Jones, H., D'Sa, A. et al. Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry. Sci Rep 4, 5237 (2014). https://doi.org/10.1038/srep05237.Clark, R. Imaging flow cytometry enhances particle detection sensitivity for extracellular vesicle analysis. Nat Methods 12, i–ii (2015). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.380.Gurunathan, S. Kang, M.-H. Jeyaraj, M. Qasim, M. Kim, J.-H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells 2019, 8, 307. https://doi.org/10.3390/cells8040307.

4月8日，国际学术期刊Circulation Research(《循环研究》)在线发表了中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所周斌研究组的最新研究成果“Endocardium minimally contributes to coronary endothelium in the embryonic ventricular free walls”。该研究利用遗传谱系示踪技术发现胚胎期心脏壁上的冠状血管起源于静脉窦而非心室心内膜，从而揭示了心血管研究领域内长期存在的争论性问题，为研究冠状血管的发生发育与再生治疗提供了理论基础。　　心血管领域关于胚胎期冠状血管的起源一直存在争论，静脉窦和心室心内膜是最主要也是最具争议的两个起源。周斌组通过利用传统的心内膜标记基因Nfatc1构建了Nfatc1-Cre等工具小鼠，并对心室心内膜进行了谱系示踪实验。研究发现，虽然Nfatc1-Cre可以标记上大量冠状血管，但Nfatc1基因并不仅仅表达在心室心内膜，还表达在胚胎早期的静脉窦内皮细胞中。由此，研究人员对冠状血管的心室心内膜起源提出了质疑。　　为了对心室心内膜实现特异性标记，周斌组等研究人员利用单细胞实时定量PCR、原位杂交实验等技术，发现并鉴定了特异性表达在心室心内膜的基因Npr3。通过构建Npr3-CreER等工具小鼠，对心室心内膜开展谱系示踪实验发现，心室心内膜很少贡献到胚胎期冠状血管。通过多种工具小鼠实验，进一步证实静脉窦内皮细胞很可能是胚胎期冠状血管的主要来源。　　心内膜细胞和冠状血管内皮细胞虽都是内皮细胞，但两者的基因表达存在很大差异。在该课题中，研究人员还利用多种工具小鼠，分离出了胚胎期心内膜细胞和冠状血管内皮细胞，通过RNA-sequencing实验发现并鉴定出了一系列特异性表达在心内膜细胞或冠状血管内皮细胞上的基因，这对心血管领域内的后续研究具有重要意义。　　该课题由张辉在研究员周斌的指导下完成，并得到了合作者斯坦福大学教授Sean M. Wu和南加州大学教授Henry M. Sucov的帮助。该工作得到了中科院、国家科技部、基金委、中组部、上海市科委等经费支持。 文章链接心内膜来源的细胞（红色）很少形成胚胎期心脏壁的冠状血管（绿色）。蓝色为细胞核。

一项由德国、法国和西班牙科学家进行的新研究发现，新冠病毒会杀死被称为内皮细胞的脑细胞，导致大脑血管受损，从而损害认知功能。相关论文发表在近日的《自然神经科学》杂志上。此前研究发现，多达84%的新冠肺炎患者出现神经系统症状、味觉或嗅觉丧失、癫痫发作、中风、意识丧失和神志不清，这可能是原因之一。研究人员研究了新冠肺炎病亡患者的大脑，发现其弦血管增加。弦血管是一种不能让血液流动的死亡细胞，是认知障碍、轻微中风等许多病症的迹象。这一发现在两种被新冠病毒感染的动物模型中得到证实。弦血管是空的基底膜管，通常含有周细胞突起。研究人员认为，弦血管与隧道纳米管（一种新型的细胞间通讯连接方式）相似或至少部分相同，纳米管被认为与调节脑血管耦合有关。不管这种功能如何，弦血管与内皮细胞死亡、血脑屏障破坏和脑缺血的相关性很强。新冠肺炎患者中脑内皮细胞的死亡是其感染新冠后的继发性死亡。新冠病毒是如何导致脑内皮细胞死亡的？结果表明，新冠病毒主要蛋白酶Mpro能高效切割宿主细胞核因子-κB的基本调节剂NEMO。在感染细胞中，Mpro和NEMO都位于胞浆和胞核中。NEMO被切割可能会阻止依赖NEMO的抗病毒I型干扰素的诱导，从而使病毒受益。研究还发现，受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）的缺失是受调节细胞死亡的介质，可阻止由于NEMO消融引起的血管稀疏和血脑屏障的破坏。重要的是，RIPK信号传导的药理学抑制剂阻止了Mpro诱导的微血管病变。数据表明，RIPK是治疗新冠肺炎的神经病理学的潜在治疗靶点。研究人员称，新冠肺炎的这一过程或是可逆的。该论文的合著者文森特普雷沃表示：“我们已经看到，在患有轻型新冠肺炎的仓鼠身上，这种现象显然可逆，因此我们希望它在人类身上也可以逆转。”

肺，作为呼吸和免疫防御的关键战场，在体外建立模拟感染和炎症反应的仿生肺模型一直是生物医学研究人员面临的一项重要但具有挑战性的任务。 长久以来，二维细胞培养模型为我们提供了肺上皮研究的初步平台，然而，这些模型却难以捕捉到肺部复杂多变的三维结构和免疫互动的丰富性。动物模型虽然有三维结构，但与人类肺组织的结构差异增加了制备过程的难度。直接培养人体组织则有免疫细胞丢失、体外维持时间不足等问题。 东南大学团队2023年1月在《Biosensors and Bioelectronics》（影响因子：12.6）期刊上发表了题为“A storm in a teacup -- A biomimetic lung microphysiological system in conjunction with a deep-learning algorithm to monitor lung pathological and inflammatory reactions”的文章（第一作者：东南大学青年至善学者、艾玮得生物CTO陈早早副教授，通讯作者：巢杰教授，浦跃朴教授和顾忠泽教授），介绍了体外肺微生理系统模型的构建方法与应用。该模型不仅在芯片上建立了肺泡-支气管复杂器官模型，而且在模型中引入了多种免疫细胞，增强了模型的仿真性，可以在模型上模拟肺脏病理和炎症级联反应，再现气溶胶微滴在肺中的传播，研究阻断病原传播的方法。该模型对于评价肺泡和支气管的通透性、粘液分泌、炎症反应等功能、开展高风险传染性肺疾病研究有重要作用。 体外肺微生理系统的设计与构建研究人员选择了多种肺上皮细胞系，如BEAS-2B（支气管上皮细胞）、NCI-H441（2型肺泡上皮细胞）、A549和Calu-3，人单核细胞系（THP-1）和人内皮细胞系（HUVEC），并将它们接种到膜式芯片上。芯片由支气管和肺泡腔组成，每个腔室由多孔膜分割为上下两个独立空间，上层接种肺上皮或支气管上皮细胞，下层接种肺血管内皮细胞，这些细胞在芯片内形成了致密的上皮层，模拟了肺部的自然结构。芯片使用多通道流控系统进行液体灌注。B)肺mps的典型构建时间C)上皮和内皮形态分析(I)肺- mps transwell样膜上的肺上皮(BEAS2b)和内皮(HUVEC)示意图。(II)肺- mps的冷冻切片和H&E染色显示在低(上)和高(下)放大下膜两侧存在上皮和内皮(第5天)(III)扫描电镜(SEM)图像显示内皮和上皮在膜上生长(第5天)(IV)芯片腔内内皮和上皮的活/死染色，显示肺- mps细胞的高活力(第7天) 肺微生理系统芯片的应用 1 在肺微生理系统芯片上模拟炎症级联反应巨噬细胞受免疫原性物质如PAMP和DAMP激活，进而分泌炎症因子、活化内皮细胞，造成更多单核细胞粘附并聚集于内皮层，引发炎症级联反应，而炎症级联反应通常用来描述炎症反应的放大。 为了模拟肺炎症反应，研究人员构建了一套器官芯片流路灌注系统，将肺微生理系统先后用组织定居巨噬细胞和循环单核细胞进行灌注，并用脂多糖（LPS）处理模型上腔，激活巨噬细胞，诱发炎症反应。通过连续观测芯片中流动的单核细胞，可以观察到LPS刺激后内皮细胞层有大量单核细胞粘附。炎症因子（如TNF-α、IL-6、MCP1）、跨上皮电阻（TEER）值、肺泡腔粘液分泌等指标的变化也证明了模型的炎症状态。肺器官芯片模拟早期炎症反应A)巨噬细胞在上皮上的播种B)灌注过程中LPS (10 μg/ml)对内皮细胞附着的单核细胞的影响C)在经LPS预处理的肺mps中，红色箭头表示内皮上原有的单核细胞，绿色箭头表示新的单核细胞附着D)扫描电镜图像显示单核细胞附着在内皮与不处理LPSE)肺- mps w/或w/o LPS组内皮上单核细胞粘附的定量比较 2肺微生理系统芯片上用于液滴与空气传播疾病的研究飞沫通过说话、呼吸和咳嗽传播是空气传播疾病的典型传播方式。为了构建能够模拟液滴扩散的体外模型，研究人员设计了一个全面的集成系统，整合了传播链上游的肺器官芯片、雾化器、防护口罩、下游的肺器官芯片以及泵和辅助设备。上游肺芯片肺泡室内的培养液通过雾化器产生液滴或气溶胶，经泵导入下游肺芯片。 在佩戴外科口罩与不戴口罩的情况下，追踪上游形成的色素微滴和荧光微珠扩散至下游介质的情况。结果显示，佩戴口罩能将两者的传播数量减少至5%以下，证明了防护口罩的预防效果。用这一系统也可以观察到伪病毒从病毒感染的上游肺器官向下游的传播，而口罩几乎完全阻止了伪病毒的感染。A）模拟液滴在人体肺部之间扩散的肺器官芯片集成系统B)肺器官芯片流路灌注系统，包括:两个控制系统口罩阻断伪病毒传播。 在空气传播的感染性疾病尤其是呼吸系统疾病领域，构建一个能够全面反映肺部感染和炎症反应的仿生模型，不仅需要技术的革新，更需要对生命本质的深刻理解和对病理过程的精准把握。体外肺器官芯片模型的研究与构建，使得仿生肺模型更加完整，更能模拟真实世界的人体组织内的复杂情况，致力于填补现有科学技术的空缺。 文献索引：Chen Z, Huang J, Zhang J, Xu Z, Li Q, Ouyang J, et al. A storm in a teacup -- A biomimetic lung microphysiological system in conjunction with a deep-learning algorithm to monitor lung pathological and inflammatory reactions. Biosens Bioelectron. 2023 Jan 1 219:114772. doi: 10.1016/j.bios.2022.114772. PMID: 36272347 江苏艾玮得生物科技有限公司（AVATARGET）是一家专注于提供人体器官芯片产品与解决方案的创新型科技公司，致力于器官芯片、智能装备及生物试剂等产品和服务的研发生产，构建器官芯片全产业链生态体系，创新突破传统动物模型与2D细胞模型的限制，解决种属差异难题、实现体外模型3D动态培养，构建高仿真的人体微环境、提高实验数据的准确性，为肿瘤精准诊疗、疾病建模、药物筛选、药物评价、化妆品评价、再生医学研究、航天医学研究等领域用户提供精准高效的产品与解决方案。 本期文献提及的肺器官芯片与肺器官芯片流路灌注系统已在艾玮得生物实现量产转化。单腔膜式芯片可用于构建体外肺模型、肠道模型、肝脏模型、皮肤模型、肾脏模型与血脑屏障模型。高通量膜式屏障芯片可用于构建体外肺模型、肠道模型、肝脏模型、皮肤模型、肾脏模型、血脑屏障模型与免疫共培养模型。器官芯片流路控制系统可实现细胞空间结构排布，模拟细胞生长的流体环境和气体-液体界面环境，实现自动化培养，节省人力，减少误差和人为操作失误，并大大降低实验的复杂性。 欢迎咨询详情：电话：0512-65367666邮箱：bd@avatarget.com.cn

基本信息 关键内容： 高压灭菌器,过氧化氢灭菌,细胞计数器 开标时间： 2022-04-25 15:00 采购金额： 325.00万元 采购单位： 保山市中医医院 采购联系人： 李先生 采购联系方式： 立即查看 招标代理机构： 云南洪力汇中商务咨询有限公司 代理联系人： 张先生 代理联系方式： 立即查看 详细信息 保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目公开招标公告 云南省-保山市-隆阳区 状态：公告 更新时间： 2022-03-31 招标文件: 附件1 保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目公开招标公告 项目概况 保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目的潜在投标人应在云南省公共资源交易电子化平台（http://116.55.195.54:8001/#/homePage），通过平台正上方选择“保山市”切换至保山市公共资源交易中心获取招标文件，并于2022年04月25日15点00分（北京时间）前提交投标文件。 一、项目基本情况： 1.项目编号：HLZB2022[004]号。 2.项目名称：保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目。 3.采购方式：公开招标。 4.采购预算价：￥3250000.00元。 5.采购内容：保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目，包含本次采购涉及到的相关设备、设施、材料采购、运输、安装、调试、验收、合同履行期限及售后技术服务等，采购清单详见下表： 序号 设备名称 数量 计量单位 是否接受进口产品 交货地点 备注 1 手术显微镜 1 台 是 采购人指定地点 技术要求详见招标文件 2 眼底激光治疗仪 1 台 是 3 高速玻切超乳机 1 台 是 4 光学相干断层扫描仪 1 台 是 5 眼科A/B超声诊断仪 1 台 否 6 角膜内皮细胞计数仪 1 台 否 7 预真空高压蒸汽灭菌器 1 台 否 8 超声雾化器 2 台 否 6.标包划分：本项目共划分1个标包，投标人须对项目内所有内容进行投标报价。 7.质保期：大于等于1年。 8.质量要求：符合国家及行业相关质量要求。 9.合同履行期限：合同签订后30日内完成供货及安装调试，交付采购人正常使用。 10.付款方式：甲乙双方合同约定。 11.本项目不接受联合体投标。 12.资格审查方法：资格后审。 二、投标人的资格要求： 1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定； 2.落实政府采购政策需满足的资格要求：扶持中小企业政策，评审时小型、微型企业提供的产品（提供本企业制造的货物、承担的工程或者服务，或者提供其他中小企业制造的货物）价格给予6%的扣除。监狱企业、残疾人福利性单位视同小型和微型企业，其产品在评审时给予相同的价格扣除。执行政策文件：《中华人民共和国中小企业促进法》、《政府采购促进中小企业发展管理办法》（财库〔2020〕46号）、 《财政部司法部关于政府采购支持监狱企业发展有关问题的通知》（财库[2014]68号）、《财政部民政部中国残疾人联合会关于促进残疾人就业政府采购政策的通知》（财库〔2017〕141号） 。 3.本项目的特定资格要求： 3.1投标人须为本项目采购产品的生产厂家或产品销售代理商，须具备相关部门核发的医疗器械生产许可证或医疗器械经营许可证，所投产品应具备相关部门核发的医疗器械经营备案证或产品注册登记表；所投产品为进口产品的，必须具有中国总代理或区域代理出具的产品授权书或产品长期代理证书。 3.2单位负责人为同一人或者存在直接控股、管理关系的不同投标人，不得参加同一合同项下的政府采购活动。 3.3投标人在投标文件递交截止时间以前未被列入“信用中国”网站（www.creditchina.gov.cn）“失信被执行人”、“重大税收违法案件当事人名单” “政府采购严重违法失信名单”，未被列入中国政府采购网（www.ccgp.gov.cn）“政府采购严重违法失信行为记录名单”，由采购人或采购代理机构在投标文件递交截止时间以前进行查询核实，存在不良记录的将取消其投标资格。 三、招标文件的获取 1.获取时间：2022年04月01 日至2022年04月08日，每天上午08：30至11：30，下午14：30至17：30（北京时间，法定节假日除外）。 2.获取方式：投标人请于本公告规定招标文件获取时间内，登录云南省公共资源交易中心（网址：http://116.55.195.54:8001/#/homePage），通过平台正上方选择“保山市”切换至保山市公共资源交易中心，凭单位数字证书（CA）在网上投标确认并免费获取电子招标文件（格式为*.ZCZBJ）及其它采购项目相关资料，未办理数字证书（CA）的投标人需要按照保山市公共资源交易电子认证的要求，申请办理证书，以便获取招标文件。 获取成功后请投标人将“营业执照（社会信用统一代码证）或其他组织证件或自然人身份证件，法定代表人（负责人）身份证明书、被授权人授权书（含投标人的联系方式、参与投标的项目名称等）、网上报名截图”等加盖公章的扫描件通过电子邮件形式发送至招标代理机构电子邮箱（ynhlhz@163.com）进行信息登记。招标公告或招标文件如有变更，便于书面通知各投标人。如投标人未按公告要求提供材料的，采购代理机构有权要求投标人修正进行补充。提供虚假材料者一经查实，将报监管部门备案，由监管部门依法处罚。 3.售价：￥0.00元。 四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点 1.投标文件递交截止时间：2022年04月25日15时00分。 2.地点：保山市公共资源交易中心第三开标室（云南省保山市隆阳区兰城路永昌传媒中心二号楼四楼）。 3..网上上传：网上上传网址为http://116.55.195.54:8001/#/homePage，投标人须在投标截止时间前完成所有投标文件的上传。投标人根据拟要投标的项目，按照网上投标系统要求上传全部投标文件，投标文件上传后须自行检查投标文件的完整性并进行确认签名后，方完成全部投标文件网上上传操作。投标人可自行打印“上传投标文件回执”。投标截止时间前未完成投标文件传输的，视为撤回投标文件。 4.其他要求： 4.1现场开标或网上开标方式：本项目采用网上开标方式 （远程网上开标解密）。 4.2参加远程开标解密文件的各投标单位无须到现场提供电子投标文件光盘、纸质投标文件及其他材料，应按开标现场要求时限参加远程解密，否则，拒绝其投标。投标人应提前熟悉网上开标远程解密有关操作事项，由保山市公共资源交易中心和北京筑龙信息技术有限责任公司提供咨询服务。 4.3技术支持：网上报名、电子投标文件制作及上传技术支持电话：400-9618-998, QQ: 4009618998。 五、公告期限 自本公告发布之日起5个工作日。 六、其他补充事宜 1.本项目投标保证金金额：￥：50000.00元。 2.本项目投标保证金形式为转账或银行保函或保证保险或其他非现金方式（不接收现场缴纳现金），采用转账的方式提交投标保证金的，投标保证金缴纳账户如下： 投标保证金交纳专用账户 开户名称：保山市政务服务管理局 开户银行：中国邮政储蓄银行保山隆阳区支行 账号：10076469507001000202467 汇入地址：云南省保山市 业务咨询电话： 010-86483801 技术支持单位：北京筑龙信息技术有限责任公司 注：参与本项目的投标人采用转账的方式提交保证金的须从单位基本户转出，并注明项目名称或采购编号，请投标人在转账完成后，使用数字证书（机构CA证书）登录投标系统，在系统主界面的“确认投标保证金”中对投标保证金进行确认绑定，最后打印保证金缴纳回执。 七、公告发布媒体 1.本项目招标公告发布媒体：《云南省政府采购网》、《云南省公共资源交易中心》、《保山市公共资源交易中心》。 2.投标人在参加投标申请之前务必认真阅读公开招标公告全部内容；公开招标公告或招标文件如有变更，将在以上网站或以书面形式发布。 3. 采购代理服务费，由中标人在领取中标通知书时向代理机构缴纳，采购代理服务费收费标准详见招标文件。 4. 监督电话：保山市财政局政府采购管理科：0875-2216045 八、凡对本次采购提出询问，请按以下方式联系 1.采购人信息 采购单位：保山市中医医院 地址：云南省保山市隆阳区永昌路3号 电话：0875-2193177 2.采购代理机构信息 名 称：云南洪力汇中商务咨询有限公司 地址：保山市隆阳区杏花小区（东大门） 联系方式：0875-2128766 3项目联系方式 采购人项目联系人：李先生 电 话：0875-2193177 采购代理机构项目联系人：张先生 电 话：0875-2128766 附件信息 附件： 序号 文件名 创建时间 1 眼耳鼻喉科医疗设备招标公告（3.31）.pdf 2022-03-31 09:53:57 采购文件 附件： 序号 文件名 创建时间 无 × 扫码打开掌上仪信通App 查看联系方式 基本信息 关键内容：高压灭菌器,过氧化氢灭菌,细胞计数器 开标时间：2022-04-25 15:00 预算金额：325.00万元 采购单位：保山市中医医院 采购联系人：点击查看 采购联系方式：点击查看 招标代理机构：云南洪力汇中商务咨询有限公司 代理联系人：点击查看 代理联系方式：点击查看 详细信息 保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目公开招标公告 云南省-保山市-隆阳区 状态：公告 更新时间： 2022-03-31 招标文件: 附件1 保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目公开招标公告 项目概况 保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目的潜在投标人应在云南省公共资源交易电子化平台（http://116.55.195.54:8001/#/homePage），通过平台正上方选择“保山市”切换至保山市公共资源交易中心获取招标文件，并于2022年04月25日15点00分（北京时间）前提交投标文件。 一、项目基本情况： 1.项目编号：HLZB2022[004]号。 2.项目名称：保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目。 3.采购方式：公开招标。 4.采购预算价：￥3250000.00元。 5.采购内容：保山市中医医院眼耳鼻喉科医疗设备采购项目，包含本次采购涉及到的相关设备、设施、材料采购、运输、安装、调试、验收、合同履行期限及售后技术服务等，采购清单详见下表： 序号 设备名称 数量 计量单位 是否接受进口产品 交货地点 备注 1 手术显微镜 1 台 是 采购人指定地点 技术要求详见招标文件 2 眼底激光治疗仪 1 台 是 3 高速玻切超乳机 1 台 是 4 光学相干断层扫描仪 1 台 是 5 眼科A/B超声诊断仪 1 台 否 6 角膜内皮细胞计数仪 1 台 否 7 预真空高压蒸汽灭菌器 1 台 否 8 超声雾化器 2 台 否 6.标包划分：本项目共划分1个标包，投标人须对项目内所有内容进行投标报价。 7.质保期：大于等于1年。 8.质量要求：符合国家及行业相关质量要求。 9.合同履行期限：合同签订后30日内完成供货及安装调试，交付采购人正常使用。 10.付款方式：甲乙双方合同约定。 11.本项目不接受联合体投标。 12.资格审查方法：资格后审。 二、投标人的资格要求： 1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定； 2.落实政府采购政策需满足的资格要求：扶持中小企业政策，评审时小型、微型企业提供的产品（提供本企业制造的货物、承担的工程或者服务，或者提供其他中小企业制造的货物）价格给予6%的扣除。监狱企业、残疾人福利性单位视同小型和微型企业，其产品在评审时给予相同的价格扣除。执行政策文件：《中华人民共和国中小企业促进法》、《政府采购促进中小企业发展管理办法》（财库〔2020〕46号）、 《财政部司法部关于政府采购支持监狱企业发展有关问题的通知》（财库[2014]68号）、《财政部民政部中国残疾人联合会关于促进残疾人就业政府采购政策的通知》（财库〔2017〕141号） 。 3.本项目的特定资格要求： 3.1投标人须为本项目采购产品的生产厂家或产品销售代理商，须具备相关部门核发的医疗器械生产许可证或医疗器械经营许可证，所投产品应具备相关部门核发的医疗器械经营备案证或产品注册登记表；所投产品为进口产品的，必须具有中国总代理或区域代理出具的产品授权书或产品长期代理证书。 3.2单位负责人为同一人或者存在直接控股、管理关系的不同投标人，不得参加同一合同项下的政府采购活动。 3.3投标人在投标文件递交截止时间以前未被列入“信用中国”网站（www.creditchina.gov.cn）“失信被执行人”、“重大税收违法案件当事人名单” “政府采购严重违法失信名单”，未被列入中国政府采购网（www.ccgp.gov.cn）“政府采购严重违法失信行为记录名单”，由采购人或采购代理机构在投标文件递交截止时间以前进行查询核实，存在不良记录的将取消其投标资格。 三、招标文件的获取 1.获取时间：2022年04月01 日至2022年04月08日，每天上午08：30至11：30，下午14：30至17：30（北京时间，法定节假日除外）。 2.获取方式：投标人请于本公告规定招标文件获取时间内，登录云南省公共资源交易中心（网址：http://116.55.195.54:8001/#/homePage），通过平台正上方选择“保山市”切换至保山市公共资源交易中心，凭单位数字证书（CA）在网上投标确认并免费获取电子招标文件（格式为*.ZCZBJ）及其它采购项目相关资料，未办理数字证书（CA）的投标人需要按照保山市公共资源交易电子认证的要求，申请办理证书，以便获取招标文件。 获取成功后请投标人将“营业执照（社会信用统一代码证）或其他组织证件或自然人身份证件，法定代表人（负责人）身份证明书、被授权人授权书（含投标人的联系方式、参与投标的项目名称等）、网上报名截图”等加盖公章的扫描件通过电子邮件形式发送至招标代理机构电子邮箱（ynhlhz@163.com）进行信息登记。招标公告或招标文件如有变更，便于书面通知各投标人。如投标人未按公告要求提供材料的，采购代理机构有权要求投标人修正进行补充。提供虚假材料者一经查实，将报监管部门备案，由监管部门依法处罚。 3.售价：￥0.00元。 四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点 1.投标文件递交截止时间：2022年04月25日15时00分。 2.地点：保山市公共资源交易中心第三开标室（云南省保山市隆阳区兰城路永昌传媒中心二号楼四楼）。 3..网上上传：网上上传网址为http://116.55.195.54:8001/#/homePage，投标人须在投标截止时间前完成所有投标文件的上传。投标人根据拟要投标的项目，按照网上投标系统要求上传全部投标文件，投标文件上传后须自行检查投标文件的完整性并进行确认签名后，方完成全部投标文件网上上传操作。投标人可自行打印“上传投标文件回执”。投标截止时间前未完成投标文件传输的，视为撤回投标文件。 4.其他要求： 4.1现场开标或网上开标方式：本项目采用网上开标方式 （远程网上开标解密）。 4.2参加远程开标解密文件的各投标单位无须到现场提供电子投标文件光盘、纸质投标文件及其他材料，应按开标现场要求时限参加远程解密，否则，拒绝其投标。投标人应提前熟悉网上开标远程解密有关操作事项，由保山市公共资源交易中心和北京筑龙信息技术有限责任公司提供咨询服务。 4.3技术支持：网上报名、电子投标文件制作及上传技术支持电话：400-9618-998, QQ: 4009618998。 五、公告期限 自本公告发布之日起5个工作日。 六、其他补充事宜 1.本项目投标保证金金额：￥：50000.00元。 2.本项目投标保证金形式为转账或银行保函或保证保险或其他非现金方式（不接收现场缴纳现金），采用转账的方式提交投标保证金的，投标保证金缴纳账户如下： 投标保证金交纳专用账户 开户名称：保山市政务服务管理局 开户银行：中国邮政储蓄银行保山隆阳区支行 账号：10076469507001000202467 汇入地址：云南省保山市 业务咨询电话： 010-86483801 技术支持单位：北京筑龙信息技术有限责任公司 注：参与本项目的投标人采用转账的方式提交保证金的须从单位基本户转出，并注明项目名称或采购编号，请投标人在转账完成后，使用数字证书（机构CA证书）登录投标系统，在系统主界面的“确认投标保证金”中对投标保证金进行确认绑定，最后打印保证金缴纳回执。 七、公告发布媒体 1.本项目招标公告发布媒体：《云南省政府采购网》、《云南省公共资源交易中心》、《保山市公共资源交易中心》。 2.投标人在参加投标申请之前务必认真阅读公开招标公告全部内容；公开招标公告或招标文件如有变更，将在以上网站或以书面形式发布。 3. 采购代理服务费，由中标人在领取中标通知书时向代理机构缴纳，采购代理服务费收费标准详见招标文件。 4. 监督电话：保山市财政局政府采购管理科：0875-2216045 八、凡对本次采购提出询问，请按以下方式联系 1.采购人信息 采购单位：保山市中医医院 地址：云南省保山市隆阳区永昌路3号 电话：0875-2193177 2.采购代理机构信息 名 称：云南洪力汇中商务咨询有限公司 地址：保山市隆阳区杏花小区（东大门） 联系方式：0875-2128766 3项目联系方式 采购人项目联系人：李先生 电 话：0875-2193177 采购代理机构项目联系人：张先生 电 话：0875-2128766 附件信息 附件： 序号 文件名 创建时间 1 眼耳鼻喉科医疗设备招标公告（3.31）.pdf 2022-03-31 09:53:57 采购文件 附件： 序号 文件名 创建时间 无

人体组织器官由具有不同细胞类型的异质细胞群组成。传统批量测序（Bulk Sequencing）方法仅能捕获器官与组织群体细胞成分的平均水平，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性常常被忽略。近年来，随着单细胞测序（Single-cell sequencing）技术的发展，实现了单个细胞水平上DNA或RNA的测序，从而能够特异和精准地探索单个细胞的基因变异水平，弥补了传统批量测序的不足[1]。图1. 单细胞测序与传统批量测序比较[1]单细胞基因组测序技术，是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术，广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等生物医学方向的研究。本期主要对单细胞基因组测序的技术原理、技术流程、技术平台及其在生物医学领域的应用实例做简单介绍。技术原理单细胞基因组测序的原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，揭示细胞间异质性的基因信息。技术流程单细胞基因组测序主要包括四个步骤，即单细胞分离→全基因组扩增→高通量测序→数据分析。目前单细胞基因组测序技术的发展依然面临两方面的技术挑战：一是易于分离和操作的单细胞分离工具（即第一步）；二是能够稳定复制单个细胞中微小核酸的方法（即第二步）[2]。2.1 单细胞分离从组织中将单个细胞分离出来是单细胞基因组测序的第一步。目前常用的单细胞分离方法主要有：有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选术、激光捕获显微切割技术（LCM）、微流控芯片技术等，表1总结了上述提到的单细胞分离方法的原理和优缺点，在使用时可根据不同的科研需求及样品情况综合考虑选择适宜的分离方法[3,4]。表1. 单细胞分离技术分离方法原理优点缺点有限稀释法对细胞进行一系列的倍比稀释，最终使细胞处于单个状态，理论上每μL约1个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液进行单细胞分离。操作简便；成本低，一般不需要特殊的设备。分离效率低；需要研究人员排除大量空白孔和多细胞孔，费时费力；细胞分离过程依赖梯度计算，容易出现错误。显微操作法在高倍倒置显微镜下，利用显微镜操作器（手动或自动）实现单细胞分离。能够准确地控制单细胞的吸取与释放；可以从不同的发育阶段或多样化的群体分离单个细胞。通量低，需要大量的起始量；细胞特异性由显微镜决定，并利用微量移液管分离，可能不够准确。流式细胞分选术通过流式细胞仪，根据细胞特异性分子标志物或细胞光散射特性，分选出单个细胞或特殊细胞群，实现单细胞分离。通量高；基于细胞表面标志物的特异标记，能够确保特定细胞的分离；利用荧光标记可分离亚群。无法扩展到大规模项目；且需要流式细胞仪，设备昂贵。激光捕获显微切割技术（LCM）在显微镜下，从冰冻/石蜡包埋组织切片（或细胞固定在装配有可以激光脉冲激活的热塑膜的涂片）中分离某一类型细胞群或单个细胞，实现单细胞分离。无需解离组织，制备细胞悬液；能够直观准确、快速地获取单个细胞或单一细胞亚群；能够保留所分离细胞的完整性。需要适当的组织处理（冷冻保存或固定）；显微切割可能存在挑战；小的细胞可能难以分离；可能存在污染。微流控芯片技术通过微流控芯片隔离流动通道中的单个细胞从而达到单细胞分离的目的。通量高；上样体积小；周期短；可根据细胞表面标志物分离特定细胞。细胞大小必须均匀；消耗品昂贵。2.2 全基因组扩增（Whole-Genome Amplification , WGA）全基因组扩增是单细胞基因组测序的第二步。由于单个哺乳动物细胞中DNA的含量一般少于10pg，达不到测序仪的检测要求，因此在测序之前必须进行全基因组扩增（WGA）以获得足够的材料用于后续的文库制备。目前常用的全基因组扩增方法按原理可分为三类（见表2）[5-7]：基于聚合酶链式反应（PCR）的WGA方法{主要是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)}、多重链置换扩增法（Multiple Displacement Amplification , MDA）和多重退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，MALBAC）等。表2. 全基因组扩增技术DOP-PCRMDAMALBAC原理基于PCR技术，通过加入部分简并的寡核苷酸引物与模板结合来实现扩增整个基因组的目的。基于恒温核酸扩增技术，恒温条件下，使用一条由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火；紧接着在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，并最终完成扩增。结合了MDA法和PCR扩增法的特点，即由一组随机引物启动扩增（每个引物具有通用引物序列和随机碱基），随机引物与模板均匀杂交，随后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，最终完成扩增示意图特点该方法实现了高度均匀的扩增，产物产量较高，操作较为简单；但仅产生基因组的稀疏覆盖，实验的条件需要较多优化。 MDA可以实现更好的基因组覆盖，产物片段长；但对模板质量要求高，可能产生非特异性产物。一种实现基因组广泛覆盖和均匀扩增的技术，灵敏度高，产物产量高。技术平台：目前，国内外研究机构使用的大规模单细胞测序技术平台主要有五种：Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution、BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System、10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、ICELL8 Single-Cell System和C1™ 单细胞全自动制备系统。国内也有多家企业进军单细胞测序领域，产品包括新格元自动化单细胞处理系统、万乘基因高通量单细胞测序平台、达普生物星海单细胞测序建库系统、墨卓生物高通量单细胞测序平台、德运康瑞痕量单细胞测序平台和原位测序平台等。各个平台各有特点，这里主要简单介绍一下两种应用较多的技术，即10X Genomics 公司的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。10x Genomics单细胞测序技术：10X Genomics单细胞测序起源自Drop-Seq技术，应用液滴微流体技术分选单细胞，将单个细胞与含有条形码（Barcode）和引物的凝胶珠一起包裹于油滴中；然后每个油滴中的凝胶珠溶解， 细胞裂解释放mRNA，通过反逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA，cDNA在液体油层破坏后进行文库构建，使用测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。该平台具有“三高（high）两低（low）”的特点：即通量高，细胞捕获效率高，细胞活性要求高（大于90%），分析时长低，成本低。 图2. 10X Genomics Chromium Controller技术原理示意图3.2 BD Rhapsody单细胞测序技术：BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了Cytoseq分子标签技术，能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时，将每个细胞标记上特异性细胞标签，实现了高通量平行建库。该技术在基因扩增和后续的测序部分等整体流程与10x Genomics单细胞测序技术相近，主要区别在于起始的单细胞分离和捕获技术。该技术并非基于微流控芯片技术，而是基于蜂巢板技术，基于微孔来保证单细胞的捕获，避免了10x Genomics单细胞测序技术中存在的概率碰撞对捕获效率从影响。细胞悬液经注入孔注入后，自然沉降到反应孔中，随后， 将磁珠同样由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。微孔和纳米孔方法允许稀释的细胞悬浮液在每孔一个珠子和一个细胞的条件下与寡聚结合珠一起沉降到皮升大小的孔中，从而保证了单孔中是单细胞捕获。 图3. BD Rhapsody技术原理示意图4、应用实例：目前，单细胞基因组测序技术的应用可以归纳为两大类，即应用于人类细胞图谱研究和非细胞图谱研究。单细胞基因组学的优势就在于能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。自2017年“人类细胞图谱计划”提出以来，单细胞测序技术已陆续揭示了多个组织器官的单细胞图谱，如通过对肾脏肿瘤进行单细胞测序，发现肾肿瘤细胞之间的突变频率和位置不尽相同，每个细胞的突变状态和转录情况也均不相同，表明肾肿瘤更加具有异质性，需要开发更加有效的细胞靶向疗法。2022年发表在Nature杂志上的研究，对人脑血管系统的单细胞图谱进行了分析，描绘出海马和皮质的脑血管细胞组成：内皮细胞、相邻的壁平滑肌细胞 (SMC) 和周细胞、血管周围的免疫细胞和星形胶质细胞等，这些细胞在大脑不同区域存在差异并沿动静脉轴变化，沿动静脉轴的细胞组成异质性产生了大脑健康所必需的功能分段的循环、代谢和渗透特性。揭示了人类大脑血管系统的细胞组成和分子特征，提示了阿尔茨海默病（AD）风险因素在人类中的进化转变，有助于对人类大脑健康基础的了解、疾病机制和治疗靶点的发现[8]。随着单细胞基因组覆盖范围扩大、通量提升以及多组学技术的不断进步，单细胞基因组学技术将为丰富发育谱系树、生殖细胞突变模式、癌症进化、基因组功能和微生物群落的分辨研究等提供策略[9]。参考文献：[1] Xia Y, Gawad C. Bringing precision oncology to cellular resolution with single-cell genomics[J]. Clinical and experimental metastasis, 2022(1):39.[2] Liang J, Cai W, Sun Z. Single-cell sequencing technologies: current and future. J Genet Genomics. 2014 Oct 20 41(10):513-28. doi: 10.1016/j.jgg.2014.09.005. Epub 2014 Oct 18. PMID: 25438696.[3] Wang Y, Navin N. Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.[4] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 2015 Jul 24 16(8):16897-919. [5] Gawad C, Koh W , Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.[6] Grün D, van Oudenaarden A. Design and Analysis of Single-Cell Sequencing Experiments. Cell. 2015 Nov 5 163(4):799-810.[7] 徐晓丽 吴凌娟.单细胞全基因组扩增技术与应用.[J]生物化学与生物物理进展 .2019.46(4)[8] Yang A C , Vest R T , Kern F , et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk[J]. Nature, 2022, 603.[9] Evrony G D, Hinch A G, Luo C. Applications of Single-Cell DNA Sequencing[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2021, 22(1).相关会议推荐：第六届基因测序网络会议来袭！六大会场，含单细胞和空间组学会场，点击下图免费报名！点击链接进入会议官网：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/