水溶性抗氧化能力

酒中抗氧化能力ORAC分析1.实验原理ORAC反应是一个经典的氢原子转移(HAT)的氧化过程。在实验条件下，一分子的AAPH失去一分子氮气，生成两分子AAPH自由基(方程1)。在空气中，生成的AAPH自由基很快与O2反应(方程2)生成相对稳定的过氧自由基ROO· 。荧光素的荧光衰退曲线表明过氧自由基对荧光素的破坏程度，在没有抗氧化剂存在的情况下，ROO·从FL获得一个氢原子(方程3)，致使荧光素的荧光衰退；在有抗氧化剂(ArOH)存在的情况下，ROO·从抗氧化剂获得一个氢原子，生成ROOH和一个稳定的抗氧化剂自由基ArO· (方程4)，致使荧光素被过氧自由基破坏的速率受到抑制(见图1)。R－N＝N－R 2R· + N2 (1)R·+O2 ROO· (2)ROO· + probe (荧光素) ROOH + oxidized probe (失去荧光) (3)ROO·+ArOH（抗氧化剂） ArO· + ROOH (4)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/10/201310141626_470806_1613776_3.gif图1 ORAC检测示意图2.实验方法ORAC法即氧自由基吸收能力（又称为抗氧化能力指数），是一种测量不同食品抗氧化能力的国际通用标准单位，检测数值愈高代表其抗氧化能力就愈强。ORAC法适合抗氧化剂的高通量筛选，是目前评价抗氧化物质抗氧化活性的最为准确、灵敏度高、应用范围广的方法之一，目前国际上已经有很多商品的标签注明抗氧化能力（ORAC值）。将空白、样品以及标准抗氧化物(Trolox)各20μL，分别与160μL荧光素溶液混合后37℃保温30min，然后再加入AAPH溶液20μL，迅速开始测定，利用荧光酶标仪配备软件记录荧光强度，初始荧光强度值记为f0，以后每隔一段时间测定一个点，荧光强度分别记为f1, f2 …，抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的曲线下净面积(Net AUC)。抗氧化剂的ORAC值是通过其荧光衰退曲线的曲线下净面积与标准抗氧化物质Trolox的曲线下净面积相比得出的，ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。我们将以ORAC方法来验证，包括线性（定量限与检测限）、精密度与准确度、重复性与稳定性、回收率等。通过验证方法的可行性，以此来评价保健酒的抗氧化能力。3.试剂溶液的制备3.1磷酸盐缓冲溶液3.1.1缓冲溶液储备液0.75 M K2HPO4：130 g K2HPO4溶于1 LddH2O；0.75 M NaH2PO4：90 g NaH2PO4溶于1 LddH2O 3.1.2缓冲溶液工作液分别量取K2HPO4贮备液81 mL，NaH2PO4贮备液19 mL，混合后用ddH2O定容至1000 mL，这样得到75 mM，pH 7.4的缓冲溶液，冰箱下贮存。3.2荧光素钠盐溶液荧光素钠盐贮备液1：称取0.0456g荧光素钠盐定容到100 mL磷酸缓冲液，4℃黑暗贮存；荧光素钠盐贮备液2：1000μL贮备液1用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存；荧光素钠盐工作液：800μL贮备液2用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存。3.3 Trolox标准溶液的配制0.0125 g Trolox定容到50 ml磷酸缓冲液中，得到1000μM的贮备液，−20℃ 贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成100，50，25，12.5，6.25μM的工作液。3.4 AAPH溶液0.414g AAPH完全溶于10mL pH7.4，75mM的磷酸缓冲溶液，即得153mM的溶液，冰浴保存。（8h的有效期，现配现用）3.5

九味中药的抗氧化能力活性筛选 衰老的自由基学说最早1956年提出， 并逐步发展为自由基一氧化应激学说。此学说认为在生命活动过程中产生的自由基对生物大分子、细胞器、细胞等累积性氧化损伤，导致组织损伤和器官功能衰退，诱导及加速机体衰老。在病理条件下或随着年龄的增加，各种内外因素导致自由基大量、过多产生，超过了机体的抗氧化能力，便产生氧化应激，过多自由基通过损伤细胞核及线粒体DNA、生物膜脂质过氧化、蛋白质交联变性等多种方式引起细胞损伤，氧化损伤逐渐累积，最后导致各种老年性疾病的发生和发展。 本实验室通过大量调研文献，筛选出具有潜在抗氧化作用的中药，只在通过实验最终筛选出具有抗氧化作用比较强的药味，进一步开发利用！ DPPH（二苯基苦味酰基自由基，）在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心的自由基，其单电子在517 nm附近有最大吸收。甲醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。当甲醇溶液中有自由基清除剂存在时，的单电子被配对而使ESR信号减弱，溶液颜色变浅，直至达到稳定。因此，可以通过在517nm波长处检测不同待测样品对自由基的清除效果，从而评价样品的抗氧化能力。本实验参照相关文献用紫外分光光度计筛选了九味中药的DPPH自由基清除活性，并测定了半效应浓度（EC50）。一、试剂与仪器二苯代苦味酰自由基（DPPH）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；氯仿、甲醇均为分析纯；紫外可见分光光度计为上海产S54A型分光光度计。二、实验方法2.1样品的制备 待测样品：九味中药分别采用水煎煮的方法提取浓缩成每1g提取液相对于10g原药材。每份提取液以最适溶剂溶解后，配成1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml六个浓度的溶液待测。2.2 DPPH标准曲线的制备 精密称取DPPH标准品12.62 mg,加入200 ml无水甲醇,配制成浓度为0.16 mmol/L的储液。分别精密移取1.00 mL各个样品的六个浓度的待测溶液，依次迅速加入1.00 mL DPPH甲醇溶液。在选定最大吸收波长(517 nm)的条件下,分别测定其吸光度。2.3样品的自由基清除能力测定 DPPH[