水溶性抗氧化能力

酒中抗氧化能力ORAC分析1.实验原理ORAC反应是一个经典的氢原子转移(HAT)的氧化过程。在实验条件下，一分子的AAPH失去一分子氮气，生成两分子AAPH自由基(方程1)。在空气中，生成的AAPH自由基很快与O2反应(方程2)生成相对稳定的过氧自由基ROO· 。荧光素的荧光衰退曲线表明过氧自由基对荧光素的破坏程度，在没有抗氧化剂存在的情况下，ROO·从FL获得一个氢原子(方程3)，致使荧光素的荧光衰退；在有抗氧化剂(ArOH)存在的情况下，ROO·从抗氧化剂获得一个氢原子，生成ROOH和一个稳定的抗氧化剂自由基ArO· (方程4)，致使荧光素被过氧自由基破坏的速率受到抑制(见图1)。R－N＝N－R 2R· + N2 (1)R·+O2 ROO· (2)ROO· + probe (荧光素) ROOH + oxidized probe (失去荧光) (3)ROO·+ArOH（抗氧化剂） ArO· + ROOH (4)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/10/201310141626_470806_1613776_3.gif图1 ORAC检测示意图2.实验方法ORAC法即氧自由基吸收能力（又称为抗氧化能力指数），是一种测量不同食品抗氧化能力的国际通用标准单位，检测数值愈高代表其抗氧化能力就愈强。ORAC法适合抗氧化剂的高通量筛选，是目前评价抗氧化物质抗氧化活性的最为准确、灵敏度高、应用范围广的方法之一，目前国际上已经有很多商品的标签注明抗氧化能力（ORAC值）。将空白、样品以及标准抗氧化物(Trolox)各20μL，分别与160μL荧光素溶液混合后37℃保温30min，然后再加入AAPH溶液20μL，迅速开始测定，利用荧光酶标仪配备软件记录荧光强度，初始荧光强度值记为f0，以后每隔一段时间测定一个点，荧光强度分别记为f1, f2 …，抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的曲线下净面积(Net AUC)。抗氧化剂的ORAC值是通过其荧光衰退曲线的曲线下净面积与标准抗氧化物质Trolox的曲线下净面积相比得出的，ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。我们将以ORAC方法来验证，包括线性（定量限与检测限）、精密度与准确度、重复性与稳定性、回收率等。通过验证方法的可行性，以此来评价保健酒的抗氧化能力。3.试剂溶液的制备3.1磷酸盐缓冲溶液3.1.1缓冲溶液储备液0.75 M K2HPO4：130 g K2HPO4溶于1 LddH2O；0.75 M NaH2PO4：90 g NaH2PO4溶于1 LddH2O 3.1.2缓冲溶液工作液分别量取K2HPO4贮备液81 mL，NaH2PO4贮备液19 mL，混合后用ddH2O定容至1000 mL，这样得到75 mM，pH 7.4的缓冲溶液，冰箱下贮存。3.2荧光素钠盐溶液荧光素钠盐贮备液1：称取0.0456g荧光素钠盐定容到100 mL磷酸缓冲液，4℃黑暗贮存；荧光素钠盐贮备液2：1000μL贮备液1用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存；荧光素钠盐工作液：800μL贮备液2用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存。3.3 Trolox标准溶液的配制0.0125 g Trolox定容到50 ml磷酸缓冲液中，得到1000μM的贮备液，−20℃ 贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成100，50，25，12.5，6.25μM的工作液。3.4 AAPH溶液0.414g AAPH完全溶于10mL pH7.4，75mM的磷酸缓冲溶液，即得153mM的溶液，冰浴保存。（8h的有效期，现配现用）3.5

九味中药的抗氧化能力活性筛选 衰老的自由基学说最早1956年提出， 并逐步发展为自由基一氧化应激学说。此学说认为在生命活动过程中产生的自由基对生物大分子、细胞器、细胞等累积性氧化损伤，导致组织损伤和器官功能衰退，诱导及加速机体衰老。在病理条件下或随着年龄的增加，各种内外因素导致自由基大量、过多产生，超过了机体的抗氧化能力，便产生氧化应激，过多自由基通过损伤细胞核及线粒体DNA、生物膜脂质过氧化、蛋白质交联变性等多种方式引起细胞损伤，氧化损伤逐渐累积，最后导致各种老年性疾病的发生和发展。 本实验室通过大量调研文献，筛选出具有潜在抗氧化作用的中药，只在通过实验最终筛选出具有抗氧化作用比较强的药味，进一步开发利用！ DPPH（二苯基苦味酰基自由基，）在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心的自由基，其单电子在517 nm附近有最大吸收。甲醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。当甲醇溶液中有自由基清除剂存在时，的单电子被配对而使ESR信号减弱，溶液颜色变浅，直至达到稳定。因此，可以通过在517nm波长处检测不同待测样品对自由基的清除效果，从而评价样品的抗氧化能力。本实验参照相关文献用紫外分光光度计筛选了九味中药的DPPH自由基清除活性，并测定了半效应浓度（EC50）。一、试剂与仪器二苯代苦味酰自由基（DPPH）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；氯仿、甲醇均为分析纯；紫外可见分光光度计为上海产S54A型分光光度计。二、实验方法2.1样品的制备 待测样品：九味中药分别采用水煎煮的方法提取浓缩成每1g提取液相对于10g原药材。每份提取液以最适溶剂溶解后，配成1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml六个浓度的溶液待测。2.2 DPPH标准曲线的制备 精密称取DPPH标准品12.62 mg,加入200 ml无水甲醇,配制成浓度为0.16 mmol/L的储液。分别精密移取1.00 mL各个样品的六个浓度的待测溶液，依次迅速加入1.00 mL DPPH甲醇溶液。在选定最大吸收波长(517 nm)的条件下,分别测定其吸光度。2.3样品的自由基清除能力测定 DPPH[

胡萝卜汁中抗氧化能力指数（ORAC）的测定【生活中的仪器分析】食品安全——饮品卫生大检测抗氧化能力指数（ORAC），是一种测量不同食品抗氧化能力的国际通用标准单位，检测数值愈高代表其抗氧化能力就愈强。是目前评价抗氧化物质抗氧化活性的最为准确、灵敏度高、应用范围广的方法之一，目前国际上已经有很多商品的标签注明抗氧化能力（ORAC值）。ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmolTrolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。 (Trolox为一种标准抗氧化物，其测定方法以及原理在另一篇原创中有详细的概述。）1 仪器与试剂1.1 仪器Biotek Synergy 2多功能酶标仪，Biotek自动移液分液系统；梅特勒万分之一天平；96孔微孔板；Eppendorf移液枪；玻璃器皿：10mL容量瓶、50mL容量瓶、100mL容量瓶、1000mL容量瓶、100 mL烧杯；1000μL移液枪、100μL移液枪、1mL移液管。1.2 试剂K2HPO4，NaH2PO4，荧光素二钠盐，Trolox标准物质，AAPH 2,2’-Azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，双蒸水。2试剂的配制2.1 磷酸盐缓冲溶液2.1.1缓冲溶液储备液0.75 M K2HPO4：130 g K2HPO4溶于1 LddH2O；0.75 M NaH2PO4：90 g NaH2PO4溶于1 LddH2O 2.1.2缓冲溶液工作液分别量取K2HPO4贮备液81 mL，NaH2PO4贮备液19 mL，混合后用ddH2O定容至1000 mL，这样得到75 mM，pH 7.4的缓冲溶液，冰箱下贮存。2.2 荧光素钠盐溶液荧光素钠盐贮备液1：称取0.0456g荧光素钠盐定容到100 mL磷酸缓冲液，4℃黑暗贮存；荧光素钠盐贮备液2：1000μL贮备液1用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存；荧光素钠盐工作液：800μL贮备液2用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存。2.3 Trolox标准溶液的配制0.0125 g Trolox定容到50ml磷酸缓冲液中，得到1000μM的贮备液，−20℃ 贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成100，50，25，12.5，6.25μM的工作液。2.4 AAPH溶液0.414g AAPH完全溶于10mL pH7.4，75mM的磷酸缓冲溶液，即得153mM的溶液，冰浴保存。（8h的有效期，现配现用）3样品测定用自动移液系统对饮品进行稀释，用缓冲溶液依次稀释成1:100，1:200，1:400，1:800系列。然后将空白、样品各稀释梯度以及标准抗氧化物(Trolox)各20μL，分别与160μL荧光素溶液混合后37℃保温30min，然后再加入AAPH溶液20μL，迅速开始测定，利用酶标仪配备软件记录荧光强度，初始荧光强度值记为f0，以后每隔一段时间测定一个点，荧光强度分别记为f1,f2 …，抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的曲线下净面积(Net AUC)。抗氧化剂的ORAC值是通过其荧光衰退曲线的曲线下净面积与标准抗氧化物质Trolox的曲线下净面积相比得出的。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/12/201312212007_483831_1613776_3.jpg3.1 Trolox标准曲线使用0、6.25、12.5、25、50、100μM的Trolox标准工作溶液，绘制标准曲线，试验表明不同浓度的Trolox与Net AUC(曲线下净面积)相关系数都在0.99以上，说明不同浓度的Trolox与其Net AUC具有线性关系。Y=0.16*X+3.59，R2=0.997。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/12/201312212007_483832_1613776_3.jpg3.2 重复性实验每个样品有4个稀释梯度（其中1：100的稀释梯度超过了曲线最高点而无法计算），重复测定2次，结果如下。N1[/

[b][b]水溶性酸、碱的测定[/b]一、[b]测定水溶性酸、碱的意义[/b]（一）[b]水溶性酸、碱[/b][/b]1. [b]概念石油产品中的水溶性酸、碱是指石油炼制及油品运输、储存过程中，混入其中的可溶于水的酸、碱。[/b]2. [b]水溶性酸、碱的化学组成[/b](1) 水溶性酸主要为硫酸、磺酸、酸性硫酸酯以及相对分子质量较低的有机酸等。(2) 水溶性碱主要为氢氧化钠、碳酸钠等。3. [b]水溶性酸、的来源[/b]原油中几乎不含有水溶性酸、碱，油品中的水溶性酸、碱多为油品精制工艺中加入的酸、碱残留物，它是石油产品质量检测的重要质量指标之一。[b]（二）[b]测定意义[/b][/b]1. [b]预测油品的腐蚀性[/b]水溶性酸、碱的存在，表明油品静酸碱净值处理后，酸没有被完全中和或碱洗后用水冲洗的不完全。这部分酸、碱在储存或使用时，能复试与其接触的金属设备及构建。水溶性酸几乎对所有金属都有较强的腐蚀性，特别是当油品中有水存在的情况下，其腐蚀性更加严重；水溶性碱对有色金属，特别是铝等金属材料有较强的的腐蚀性，例如，汽油中若有水溶性碱的存在，汽化器的铝制零件会生成氢氧化铝胶体，堵塞油路、滤清器及油嘴。2. [b]重要的油品质量指标[/b]油品中的水溶性酸、碱在大气中，在水分、氧气、光照及受热的长期作用下，会引起油品氧化、分解和胶化，降低油品安定性，促使油品老化。所以，在成品油出厂前，哪怕是发现有微量的水溶性酸、碱，都认为产品不合格，据不允许出厂。3. [b]指导油品生产[/b]油品中的水溶性酸、碱时导致油品氧化编制的不安定组分，油品中若检测出水溶性酸、碱，表明通过酸碱精制工艺处理后，这些物质还没有完全被清除彻底，产品不合格，需要优化工艺条件，以利于生产优质产品。[img=,667,500]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908201321571585_7702_1680058_3.jpg!w667x500.jpg[/img][b]二、[b]水溶性酸、碱的定方法概述[/b]（一）[b]应用方法[/b][/b]GB/T 259-1988（2016）《石油产品水溶性酸及碱测定法》[b]（二）[b]方法应用范围[/b][/b]1. [b]测定样品[/b]液体石油产品、添加剂、润滑脂、石蜡、地蜡及含蜡组分。2. [b]目标物质[/b]水溶性酸、碱3. [b]方法类别[/b]定性和定量分析[b]（三）[b]方法来源[/b][/b]参照采用前苏联国家标准ГОСТ 6307-1975《石油产品水溶性酸及碱测定法》。[b]（四）[b]方法原理[/b][/b]石油及其产品中的酸、碱性物质，主要分为亲水和疏水（亲油）两种类型。通常，精制工艺中加入的无机酸、碱残留物是亲水的，而相对分子质量较低的有机酸机油兼容性质。油品中的水溶性酸、碱的测定主要监测的是石油产品中亲水性物质。油品中水溶性酸、碱测定的基本原理是：用蒸馏水与等体积的式样混合，经摇动在油、水两相充分接触的情况下，使水溶性酸、碱被抽提到水相中。分离分液漏斗下层的水相，用甲基橙（或酚酞）指示剂或用酸度计测定其pH，以判断试样中有无水溶性酸、碱的存在。这是一种表示有品种是否含有酸、碱腐蚀活性物质的定性试验方法，既不能说明油品中究竟含有哪种类型的酸、碱，也不能该出酸、碱各自的准确含量但可以作为产品质量的控制指标。对汽油、溶剂油等轻质石油产品，试验时在常温下用蒸馏水抽提；对50 ℃时运动粘度大于7mm2/s的试样。需先用中性溶剂将试样稀释后，再加入50~60 ℃蒸馏水抽提；对固态试样，取样后像是扬中加入蒸馏水并加热至固形熔化后抽屉。如果试样蒸馏水混合时，形成不易分层的乳浊液作，则改用50~60 ℃的95%乙醇溶液（1:1）进行抽提，必要时再加入稀溶液，以降低试样的粘度，达到油、水两相彻底分离的目的。[b]（五）[b]方法概述[/b][/b]用蒸馏水或乙醇水溶液抽提试样中的水溶性酸或碱，然后分别用甲基橙或酚酞指示剂检查抽出水溶液的颜色，以此判断是否有水溶性酸或碱存在。或用酸度计测抽出水溶液的pH，判断有无水溶性酸或碱。[b]（六）[b]方法特点[/b][/b]该方法是一种定性与定量相结合的试验法，但是在实际测定中一般主要定性分析，就能满足要求。[b]（七）[b]结果报告[/b][/b]1. [b]用指示剂测定水溶性酸或碱[/b]根据测定情况予以报告“有水溶性酸”“有水溶性碱”或“无”。2. [b]用酸度计测定水溶性酸或碱[/b]取重复测定2次pH的算术平均值作为试验结果。[img=,600,400]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908201322260266_6913_1680058_3.jpg!w600x400.jpg[/img][b]三、[b]影响测定的主要因素[/b]（一）[b]取样的均匀程度[/b][/b]轻质油品中的水溶性酸、碱有时会沉积在盛样容器的底部，因此在取样前应将试样充分摇匀。[b]（二）[b]试剂为中性[/b][/b]实际要先检查，确认所用的试剂、蒸馏水、乙醇等为中性后方可使用。[b]（三）[b]保持器皿的清洁性[/b][/b]所用试管、分液漏斗、锥形烧瓶必须确保清洁、无水溶性酸、碱等物质存在，否则会影响的定结果的准确性。[b]（四）[b]油品的乳化[/b][/b]试油遇到水抽提液呈碱性反应时，试样发生乳化反应，通常是油品残留的皂化物水解的缘故。当用水单独试验发现试样呈碱性反应（形成难以分离的乳浊液）时，改用1:1的水-95%乙醇溶液作抽提剂重复试验，如仍呈碱性反应，方可确认为碱性。改用1:1乙醇溶液代替水的目的是抑制盐的水解。[b]（五）[b]控制指示剂的加入量[/b][/b]试验中反应的灵敏性与指示液的浓度油罐，所以加入的酚酞、甲基橙指示剂要按规定量加入，不得过量或少加。[b]（六）[b]充分摇荡分液漏斗内的混合液，使其充分接触[/b][/b]摇动分液漏斗中试验溶液时，要事实打开玻璃塞放气，以免漏斗因压力过高将玻璃塞冲出。注意放气时将分液漏斗的颈部抬高，并注意放气时不要对着人。[b]（七）[b]试样粘度[/b][/b]如果试样50 ℃时的运动粘度大于75 mm2/s，可用稀释溶剂对试样进行稀释并加热到一定温度后再行测定，不燃，粘稠试样中的水溶性酸、碱将难以抽屉出来，是测定结果偏低。[img=,640,426]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908201322471545_8732_1680058_3.jpg!w640x426.jpg[/img][b]四、[b]争议仲裁[/b][/b]当对石油产品质量评价出现不一致时，要用酸度计测定抽出液的pH。[b]参考文献：[/b][color=#333333]1、油品分析工：销售专用.上册/中国石油天然气集团公司职业技能鉴定指导中心编.——东营：中国石油大学出版社，2018.7[/color][color=#333333]2、油品分析/王宝仁，孙乃有主编.——北京：化学工业出版社，2008.4[/color][color=#333333]3、石油化工分析/廖克俭，戴跃玲，丛玉凤编著.——北京：化学工业出版社，2005.2[/color][color=#333333]4、油品化验/郑亦敏著.——上海：学林出版社，2001.3[/color][b][b][img=,690,460]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908201323072155_5527_1680058_3.jpg!w690x460.jpg[/img][/b][/b]

【作者】任蕾【摘要】 芝麻素(Sesamin)属于脂溶性木脂素类化合物，是一种安全、高效的天然抗氧化剂， 具有较强的抗氧化活性，是芝麻中的特殊成份。芝麻素具有多种生理保健功效，如抗氧化，延缓衰老，调节脂质代谢及降低血清胆固醇，促进乙醇代谢，保护肝脏， 提高机体免疫力等，芝麻素对流感病毒、仙台病毒和结核杆菌有抑制作用。农业上用作除虫菊酯的增效剂。芝麻是芝麻素的主要来源，本文以国产芝麻为原料，研究了芝麻素的超临界CO2 法萃取、分析与检测及高温条件下抗氧化能力，为芝麻素的开发利用提供基础。 1.本文以芝麻为原料，对采用超临界二氧化碳萃取芝麻油工艺的可行性及其适宜条件进行了全面而系统的研究。探讨了不同萃取参数（原料预处理（水分含量、粉碎粒度）、萃取压力、萃取温度、CO2 流量、萃取时间、分离压力及温度等）对芝麻油提取率的影响，确定了芝麻油超临界CO2 法萃取的最适宜的工艺技术条件：萃取压力35MPa、萃取温度40℃、萃取时间3h、CO2 流量15 kg/h、粉碎粒度40 目。 2. 采用高效液相色谱法快速测定芝麻油中芝麻素的含量，并对分析进行了研究。液相色谱条件为色谱柱：Diamonsil (C18 250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇与水的比例为70∶30，流速：1mL/min，检测波长：290nm。芝麻素浓度和液相色谱图上的吸收峰面积在在5 ～ 200μg/mL 内呈现良好线性的关系， 其回归方程： y=72741x+105063，相关系数为R=0.9999；加标回收率为95.51% （RSD=1.29%, n=6）。该方法简便、结果准确、灵敏度高，可用于芝麻素含量的定量分析与检测。 3. 以猪油及大豆油为对象，对芝麻素在高温处理条件下对油脂的氧化稳定性的影响进行了研究，试验结果表明：在高温下，芝麻素具有良好的抗氧化性，且随添加量的增加而增强，如猪油经150℃高温处理后空白组过氧化值是添加0.10%芝麻素组的15.7 倍，而一级大豆油经150℃高温处理后空白组过氧化值是添加0.10%芝麻素组的4.1 倍；芝麻素对猪油和一级大豆油抗氧化效果高于同浓度的茶多酚；与乳酸、EDTA 相比，磷酸对芝麻素的高温抗氧化能力具有显著的增效作用。 【关键词】 芝麻；芝麻素；超临界CO2 萃取；高效液相色谱法；抗氧化性 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208201155_384605_2352694_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208201155_384606_2352694_3.jpg

[b]钛盐比色（TSS）法——一种新的抗氧化能力检测方法[/b]过氧化氢（H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]）是一种非自由基形态的ROS，生物机体中的H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]主要产生于胞内的过氧化物酶体，包括葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶等在内的多种氧化酶在催化氧化还原反应的过程中均会伴随H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]的形成（Valko et al. 2007）。另外，SOD催化O[sub]2[/sub][sup]• -[/sup]的歧化分解也产生H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]。较其它生物类自由基，H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]活性（氧化还原能力）较弱但膜穿透能力较强，在正常生理pH和温度环境下，尤其是无过渡金属离子存在时，H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]通常被过氧化氢酶转化为O[sub]2[/sub]和H[sub]2[/sub]O。然而，H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]一旦产生过量，即可跨膜抵达胞内其它部位进而攻击多种生物大分子，如H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]可降解血红蛋白并释放出Fe[sup]2+[/sup]（Karadag et al. 2009），后者又催化H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]通过芬顿反应产生细胞毒性极强的[sup]• [/sup]OH。目前研究中用于测定物质清除H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]能力的方法主要分为三类：基于紫外分光技术的直接清除法、基于荧光的高香草醛法和冬莨菪素法以及基于化学发光的芳基草酸酯法和鲁米诺法，其中荧光法和化学发光法因仪器普及度不高和所用试剂昂贵而较少使用，应用较多的即为直接清除法（Direct scavenging, DS）。DS法依据H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]在紫外区有特征吸收且强度与其浓度成正比的原理而建立，当反应体系中存在H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]清除剂时230~240 nm处的特征吸收随之减弱（Ruch et al. 1989）。然而在DS法实际应用中，由于绝大部分物质在≤ 240 nm这一紫外区段都存在强烈的本底吸收而干扰读数，易致测试不能正常进行，尤其是对于植物提取物之类的复杂混合物样品（Amous et al. 2002 Karadag et al. 2009）。本研究在采用DS法测试VPE清除H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]能力时就遇到类似问题，因此有必要重新建立一种切实有效的测试复杂混合物清除H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]能力的方法。H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]在酸性条件下与钛离子（Ti[sup]4+[/sup]）可形成稳定的显色络合物，颜色深浅与H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]或Ti[sup]4+[/sup]量成比例，目前依据上述原理并利用TiOSO[sub]4[/sub]、Ti(SO[sub]4[/sub])[sub]2[/sub]、K[sub]2[/sub]TiO(C[sub]2[/sub]O[sub]4[/sub])[sub]2[/sub]、TiCl[sub]4[/sub]等钛盐定量H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]或H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]定量钛的研究多集中在植物生理学、冶金、印染等领域（Patterson et al. 1984 段颖等2001 张瑛洁等2008）。本文在DS法的基础上结合Ti(IV)-H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]显色原理，以VPE为测试对象，以期建立一种新的测定清除H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]能力的抗氧化评价方法。另外，对多种抗氧化测试手段的方法学特征进行综合考量，以期优选出一套系统研究冬剪枝条抗氧化的方法体系。[b]1 材料与方法1.1 供试材料1..2 主要试剂[/b]甲醇（MeOH）、丙酮（Me[sub]2[/sub]CO）、硫酸（H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub]）等分析纯化学试剂购自西安化学试剂厂；过氧化氢（H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]）、四氯化钛（TiCl[sub]4[/sub]）及硫酸钛（Ti(SO[sub]4[/sub])[sub]2[/sub]）等购自国药集团；维生素C（Vc）、没食子酸（GA）、水溶性维生素E（Trolox）等购自Sigma-Aldrich上海贸易有限公司。[b]1.2 研究方法1.2.1 钛盐比色法（Titantnium saltsspectrophotometry, TSS）[/b]TSS测试分为两步，第一步为清除反应，反应体系包括一定量（1 mL）不同浓度样品（标准物质或VPE）、H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]（0.5 mL, 10 mM）及PBS（1.5 mL, 60 mM pH 7.4），混匀于37°C水浴中准确温育30 min；第二步为显色反应，向温育后的反应体系中加入Ti(SO[sub]4[/sub])[sub]2[/sub]溶液（0.1 mL, 50 mM），振荡后会产生少量黄色沉淀，随后再加H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub]（2.0 mL, 1.2 M），待沉淀完全溶解即可测404 nm下Abs，反应体系终体积为5.1 mL。同体积H[sub]2[/sub]O替换H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]作空白或80% MeOH替换样品作对照。TSS法所测抗氧化能力，即H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]清除率按公式3-1计算，结果以EC[sub]50[/sub]（半清除浓度）、TEE（与单位质量VPE等效的Trolox量）及TES（与单位质量植物材料等效的Trolox量）表示。[b]1.2.2 直接清除法（Direct scavenging, DS）[/b]DS测试步骤同TSS法中的第一步反应，温育后的反应体系直接在240 nm下测Abs。同体积H[sub]2[/sub]O替换H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]作空白或80% MeOH替换样品作对照。DS法结果计算与表示同TSS法。[b]1.2.3 冬剪枝条中抗氧化物质的提取[/b]同3.1.2.1[b]1.3 数据处理[/b]以上指标至少重复测定3次，结果以均值（± S.D.）表示，实验数据采用Microsoft Office 2003和SPSS Statistics 17.0进行分析，差异显著水平为[i]P[/i] TSL ≥ CS CF KY ≥ ML RG CH ≥ HMG ≥ PN，除TSL与CS间、CH、HMG、PN互相间外，其余品种间皆存在显著差异（[i]P[/i] 0.05）。标准物质中清除力最强的为Catechin，略高于VPE中的VT；其次为TBHQ，清除力仅高于CH、HMG及PN；Vc和Trolox清除力相当。[align=center]表4-3 钛盐比色法和直接清除法测定冬剪枝条和标准物质清除过氧化氢能力[/align][align=center]Table 4-3 H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub] scavenging capacities of vine prunings andstandards estimated by TSS and DS assays[/align] [table][tr][td=2,2] [align=center]样品[/align] [align=center]Sample[/align] [/td][td=3,1] [align=center]TSS-H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub][/align] [/td][td=3,1] [align=center]DS-H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]EC-[sub]50 [/sub][/align] [align=center](μg/mL)[/align] [/td][td] [align=center]TEE [/align] [align=center](mM/g extr)[/align] [/td][td] [align=center]TES[/align] [align=center] (mM/g samp)[/align] [/td][td] [align=center]EC-[sub]50[/sub][/align] [align=center][sub] [/sub](μg/mL)[/align] [/td][td] [align=center]TEE[/align] [align=center] (mM/g extr)[/align] [/td][td] [align=center]TES[/align] [align=center] (mM/g samp)[/align] [/td][/tr][tr][td=1,10] [align=center]VPE[/align] [/td][td] [align=center]CF[/align] [/td][td] [align=center]116.43 ± 3.49 c[/align] [/td][td] [align=center]11.39 ± 0.34 e[/align] [/td][td] [align=center]1.61 ± 0.05 d[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]CH[/align] [/td][td] [align=center]183.65 ± 3.67 f[/align] [/td][td] [align=center]7.22 ± 0.14 b[/align] [/td][td] [align=center]0.81 ± 0.02 a[/align] [/td][td] [align=center]148.65 ± 7.98[/align] [/td][td] [align=center]8.32 ± 1.59[/align] [/td][td] [align=center]1.42 ± 0.11[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]CS[/align] [/td][td] [align=center]100.42 ± 2.01 b[/align] [/td][td] [align=center]13.20 ± 0.26 f[/align] [/td][td] [align=center]2.09 ± 0.04 e[/align] [/td][td] [align=center]90.22 ± 10.23[/align] [/td][td] [align=center]14.65 ± 1.16[/align] [/td][td] [align=center]2.09 ± 0.17[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]HMG[/align] [/td][td] [align=center]269.56 ± 4.20 h[/align] [/td][td] [align=center]4.92 ± 0.11 a[/align] [/td][td] [align=center]0.79 ± 0.02 a[/align] [/td][td] [align=center]88.76 ± 8.47[/align] [/td][td] [align=center]14.94 ± 0.65[/align] [/td][td] [align=center]2.39 ± 0.11[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]KY[/align] [/td][td] [align=center]119.66 ± 2.39 c[/align] [/td][td] [align=center]11.07 ± 0.22 e[/align] [/td][td] [align=center]1.41 ± 0.03 c[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]ML[/align] [/td][td] [align=center]140.53 ± 2.81 d[/align] [/td][td] [align=center]9.43 ± 0.19 d[/align] [/td][td] [align=center]1.40 ± 0.03 c[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]PN[/align] [/td][td] [align=center]253.75 ± 4.07 g[/align] [/td][td] [align=center]5.22 ± 0.10 a[/align] [/td][td] [align=center]0.76 ± 0.02 a[/align] [/td][td] [align=center]130.54 ± 9.87[/align] [/td][td] [align=center]11.04 ± 0.90[/align] [/td][td] [align=center]1.61 ± 0.08[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]RG[/align] [/td][td] [align=center]153.82 ± 4.61 e[/align] [/td][td] [align=center]8.62 ± 0.26 c[/align] [/td][td] [align=center]1.19 ± 0.04 b[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]TSL[/align] [/td][td] [align=center]94.63 ± 2.37 b[/align] [/td][td] [align=center]14.01 ± 0.35 g[/align] [/td][td] [align=center]2.10 ± 0.05 e[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]VT[/align] [/td][td] [align=center]63.64 ± 0.64 a[/align] [/td][td] [align=center]20.82 ± 0.21 h[/align] [/td][td] [align=center]3.05 ± 0.03 f[/align] [/td][td] [align=center]126.54 ± 9.87[/align] [/td][td] [align=center]11.04 ± 0.90[/align] [/td][td] [align=center]1.61 ± 0.08[/align] [/td][/tr][tr][td=1,4] [align=center]标准[/align] [align=center]物质[/align] [align=center]Stand.[/align] [/td][td] [align=center]Trolox [/align] [/td][td] [align=center]343.21 ± 5.02 i[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]321.21 ± 9.32[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]Vc[/align] [/td][td] [align=center]345.35 ± 3.23 i [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]322.14 ± 7.65[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]TBHQ[/align] [/td][td] [align=center]180.32 ± 1.43 f[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]124.48 ± 6.32[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]Catechin[/align] [/td][td] [align=center]61.93 ± 0.83 a[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]78.36 ± 8.84[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td=2,1] [align=center]VPE均值Avg.[/align] [/td][td] [align=center]149.61 ± 65.45[sup]**[/sup][/align] [/td][td] [align=center]10.59 ± 4.57[/align] [/td][td] [align=center]1.52 ± 0.70[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][td] [align=center]N/A[/align] [/td][/tr][/table]注: TEE或TES: 表示与单位干重VPE或植物材料等效的Trolox量 同列内数值后相同字母表示差异不显著 上标[sup]**[/sup]表示所有VPE的EC[sub]50[/sub]均值与Trolox间存在显著差异 N/A: 不可用.Note:TEE or TES: the amounts of Trolox having equivalent effects to unit mass ofextracts or botanical samples on dryweight Values with same letters in each column are not significantly differentat [i]P[/i] 0.05 ‘**’ indicatessignificant difference of the mean EC[sub]50[/sub] between all VPE and Troloxat [i]P[/i] 0.01 N/A: Not Available.对比TSS法，DS法在测试VPE过程中仅能对部分样品的H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]清除能力做出评价，但测定结果的重复性较差，其余样品因背景干扰过大且难以消除而致无法正常测试。当对VPE进行稀释时我们发现：稀释倍数较小时不足以消除干扰吸收，较大时VPE则丧失了清除能力。另外，在DS测试中，当VPE与H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]反应后，样品本底可能已经发生改变，尤其是对于紫外区波段下的吸收，这种情况下即便设置样品空白也可能是无效的。在对标准物质的测试中，就EC[sub]50[/sub]值而言，DS法虽在数值上低于TSS法，但两者所测不同物质间清除能力的差异趋势相同，同时，DS法依旧存在测定重复性差的问题，这主要是因为方法自身精密度较差（详见2.2.3精密度考察）。[b]2.4 TSS法与其它抗氧化测定方法的相关性[/b]相关性研究结果显示：在针对VPE的抗氧化能力测试中，TSS法与清除O[sub]2[/sub][sup]• -[/sup]的PMS/NADH法、清除[sup]• [/sup]OH的TBA法及清除ONOO[sup]-[/sup]的EB法之间呈极显著正相关（[i]P[/i] 0.01），与测定螯合力的Ferrozine法显著正相关（[i]P[/i] 0.05），而与清除人工自由基的ABTS法、清除[sup]1[/sup]O[sub]2[/sub]的RNO法、清除ROO[sup]• [/sup]的Crocin/ABAP法、测定还原力的CUPRAC法及抗脂质过氧化的TBARS法间呈弱相关无相关性。[align=center]表4-4 钛盐比色法与其它抗氧化方法之间的相关性[/align][align=center]Fig. 4-4Correlations between TSS and other antioxidative methods [/align] [table][tr][td] [/td][td] [align=center]TSS[/align] [/td][td] [align=center]ABTS[/align] [/td][td] [align=center]PMS/N.[/align] [/td][td] [align=center]TBA[/align] [/td][td] [align=center]Crocin/A.[/align] [/td][td] [align=center]RNO[/align] [/td][td] [align=center]EB[/align] [/td][td] [align=center]TNB[/align] [/td][td] [align=center]TBARS[/align] [/td][td] [align=center]Ferrozine[/align] [/td][td] [align=center]CUPRAC[/align] [/td][/tr][tr][td]TSS[/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]0.195[/align] [/td][td] [align=center]0.809[sup]**[/sup][/align] [/td][td] [align=center]0.925[sup]**[/sup][/align] [/td][td] [align=center]-0.001[/align] [/td][td] [align=center]0.212[/align] [/td][td] [align=center]0.787[sup]**[/sup][/align] [/td][td] [align=center]0.018[/align] [/td][td] [align=center]0.189[/align] [/td][td] [align=center]0.405[sup]*[/sup][/align] [/td][td] [align=center]0.277[/align] [/td][/tr][/table]注: 上标**表示在0.01水平显著(双尾) 上标*表示在0.05水平显著(双尾).Note:‘**’ indicate the significant correlation at the 0.01 level (two-tail) ‘*’indicates the significant correlation at the 0.05 level (two-tail).[b]2.5 不同抗氧化测试的方法学比较[/b]由于物质抗氧化作用的多重性特点，目前已建立的抗氧化方法虽达几十种之多，但尚无一种可全面评价物质的抗氧化特性，每种方法具体特征不一且仅能反映抗氧化作用的某一方面，因此在对给定测试物的抗氧化研究中，须结合实际情况同时采用多种不同方法尽可能给出全面评价。在方法的具体选择中，既要优先考虑使用具有生物相关性或近生理条件的方法，又要避免类似机理方法的重复但不失测试全面性，同时尽可能兼顾效率和成本。遵循上述原则，对本研究中的19种不同抗氧化测试进行了综合比较，结果见表4-5。在清除人工自由基测试中，DPPH和ABTS是两种同时基于电子转移（ET）和氢原子转移（HAT）的非竞争性机制方法，虽不具生物相关性，但因测试便捷、准确度高等特点，目前仍是应用最广泛的两种抗氧化评价方法，尤其适合大量样品初筛。两种方法在本研究中呈极显著的正相关关系，但因ABTS测试可在近生理pH下进行，且较DPPH法省时，因此在后续研究中若需进行人工自由基清除测试，则推荐使用ABTS法。在清除O[sub]2[/sub][sup]• -[/sup]中，PMS/NADH和VB[sub]2[/sub]/Met均为基于ET的竞争性机制方法，两者在VPE测试中呈极显著相关。PMS/NADH法虽然成本较高，但因其自由基产生过程为易控制的化学反应，较VB[sub]2[/sub]/Met的光激发更准确迅速、结果重复性也越高，同时测试环境更近pH，因此推荐PMS/NADH。在清除[sup]• [/sup]OH中，首先需说明的是外源抗氧化剂清除机体内[sup]• [/sup]OH的可能性很小，主要因为[sup]• [/sup]OH存在时间极短，一旦产生遂即攻击胞内的生物分子。尽管体外清除[sup]• [/sup]OH测试现实意义不大，但仍为广大研究者使用。本研究中TBA和Phen均为竞争性机制方法，但两种测试所用靶分子不同，前者为生物大分子脱氧核糖，后者为邻二氮菲-亚铁，因此TBA法的生物相关性更高，故推荐之。[align=center]表4-5 19种抗氧化方法的综合比较[/align][align=center]Table 4-5Comprehensive comparations of methodological aspects among 19 antioxidativeassays[/align] [table][tr][td] [align=center]方法[/align] [align=center]Method[/align] [/td][td] [align=center]动力学[/align] [align=center]Kinetics[/align] [/td][td] [align=center]pH值[/align] [align=center]pH value[/align] [/td][td] [align=center]生物相关性[/align] [align=center]Biolo. rele.[/align] [/td][td] [align=center]可能机理Possi. mech.[/align] [/td][td] [align=center]反应时间[/align] [align=center]Time (min /one samp.)[/align] [/td][td] [align=center]费用[/align] [align=center]Cost (CNY /100 samp.)[/align] [/td][td] [align=center]难度[/align] [align=center]Diffi.[/align] [align=center]level[/align] [/td][td] [align=center]综合推荐[/align] [align=center]Recom.[/align] [align=center]level[/align] [/td][/tr][tr][td]DPPH[/td][td] [align=center]NC[/align] [/td][td] [align=center]‘N/A’[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]ET, HAT[/align] [/td][td] [align=center]40[/align] [/td][td] [align=center]30[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆[/align] [/td][/tr][tr][td]ABTS[/td][td] [align=center]NC[/align] [/td][td] [align=center]7.0[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]ET, HAT[/align] [/td][td] [align=center]25[/align] [/td][td] [align=center]35[/align] [/td][td] [align=center]※※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]PMS/NA.[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]++[/align] [/td][td] [align=center]ET[/align] [/td][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]170[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]VB[sub]2[/sub]/Met[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.8[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]ET[/align] [/td][td] [align=center]16[/align] [/td][td] [align=center]50[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆[/align] [/td][/tr][tr][td]TBA[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]+++[/align] [/td][td] [align=center]EA, HAT[/align] [/td][td] [align=center]75[/align] [/td][td] [align=center]95[/align] [/td][td] [align=center]※※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]Phen[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]EA[/align] [/td][td] [align=center]60[/align] [/td][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]TSS[/td][td] [align=center]NC[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]EA[/align] [/td][td] [align=center]35[/align] [/td][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]CRT/LA[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.0[/align] [/td][td] [align=center]+++[/align] [/td][td] [align=center]HAT[/align] [/td][td] [align=center]180[/align] [/td][td] [align=center]720[/align] [/td][td] [align=center]※※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]Crocin/AB.[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]+++[/align] [/td][td] [align=center]HAT[/align] [/td][td] [align=center]50[/align] [/td][td] [align=center]35[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]RNO[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.0[/align] [/td][td] [align=center]+++[/align] [/td][td] [align=center]PQ[/align] [/td][td] [align=center]40[/align] [/td][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]TNB[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]++[/align] [/td][td] [align=center]ET[/align] [/td][td] [align=center]15[/align] [/td][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]※※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]SNP[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]++[/align] [/td][td] [align=center]ET, NT[/align] [/td][td] [align=center]190[/align] [/td][td] [align=center]40[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]EB[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]++[/align] [/td][td] [align=center]NT[/align] [/td][td] [align=center]30[/align] [/td][td] [align=center]20[/align] [/td][td] [align=center]※※※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]TBARS[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]+++[/align] [/td][td] [align=center]HAT[/align] [/td][td] [align=center]115[/align] [/td][td] [align=center]670[/align] [/td][td] [align=center]※※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]FTC[/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]7.4[/align] [/td][td] [align=center]+++[/align] [/td][td] [align=center]HAT[/align] [/td][td] [align=center]10085[/align] [/td][td] [align=center]1450[/align] [/td][td] [align=center]※※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]Ferrozine[/td][td] [align=center]NC[/align] [/td][td] [align=center]6.8[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]CO[/align] [/td][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]35[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][tr][td]PB[/td][td] [align=center]NC[/align] [/td][td] [align=center]6.6[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]ET[/align] [/td][td] [align=center]30[/align] [/td][td] [align=center]205[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆[/align] [/td][/tr][tr][td]FRAP[/td][td] [align=center]NC[/align] [/td][td] [align=center]3.6[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]ET[/align] [/td][td] [align=center]30[/align] [/td][td] [align=center]100[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆[/align] [/td][/tr][tr][td]CUPRAC[/td][td] [align=center]NC[/align] [/td][td] [align=center]7.0[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]ET[/align] [/td][td] [align=center]20[/align] [/td][td] [align=center]50[/align] [/td][td] [align=center]※[/align] [/td][td] [align=center]☆☆[/align] [/td][/tr][/table]注: C: 竞争性机制 NC: 非竞争性机制 EA: 亲电加成 ET: 电子转移 HAT: 氢原子转移 PQ: 物理猝灭 NT: 硝基化 CO: 配位 ‘-、+、++、+++’：无、低、中、高生物相关性 ‘※、※※、※※※’: 低、中、高操作难度 ‘☆、☆☆、☆☆☆’: 低、中、高推荐程度 N/A: 不可用.Note: C:competitive NC: non-competitive EA: electrophilic addition ET: electrontransfer HAT: hydrogen atom transfer PQ: physical quenching NT: nitration CO: coordination ‘-、+、++、+++’:non-、low-、medium-、high-relevance ‘※、※※、※※※’: low-、medium-、high-operationdifficulty ‘☆、☆☆、☆☆☆’: low-、medium-、high-recommendation N/A: Not Available.对于清除H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]，传统的直接清除法因背景干扰难以消除，未能够准确评价全部被测VPE，新建TSS测试虽属于非竞争性机制反应，但却适用于VPE和众多其它抗氧化剂的测试，故作推荐。对于清除ROO[sup]• [/sup]，CRT/LA和Crocin/ABAP在方法机制、生物相关性及反应机理等方面均相似，两者之间在本研究中也呈极显著正相关。但在具体反应过程中，两者靶分子敏感度不同，CRT/LA测试中除ROO[sup]• [/sup]之外的多种因素可致CRT漂白，而Crocin/ABAP法中Crocin只对ROO[sup]• [/sup]敏感且测试更为快速、经济，故而推荐后者。RNO法是一种基于物理猝灭[sup]1[/sup]O[sub]2[/sub]的竞争性机制方法，具有生物相关性高、操作相对简单、费用低廉等特点，宜作推荐。清除HOCl的TNB法是一种基于ET的竞争性机制测试，生物相关性中等，但自由基获取非常方便，也宜作推荐。在清除含氮活性氧NO[sup]• [/sup]和ONOO[sup]-[/sup]测试中，SNP法和EB法均属竞争性反应机制，生物相关性中等，反应机理前者以硝基加成（NT）和ET为主，后者主要为NT。本研究中中SNP与EB间存在极显著正相关性，但因生物机体内NO[sup]• [/sup]易转化活性更强的ONOO[sup]-[/sup]，故而应用EB法评价ONOO[sup]-[/sup]清除能力现实意义更大，故作推荐。在抗脂质过氧化测试中，TBARS和FTC在反应机制、机理及生物相关性等方面均相似，两者之间也呈极显著的正相关关系，不同之处在于FTC法耗时长且费用高，因此在后续研究中推荐使用TBARS法。螯合过渡金属离子作为物质抗氧化的重要机制之一，对于抑制自由基形成和脂质过氧化有着重要意义。Ferrozine法测定Fe[sup]2+[/sup]螯合力方便、快速、准确，故作推荐。还原力测试中，PB、FRAP及CUPRAC均为基于ET的非竞争性机制方法，三者之间相关度极高，不同的是PB和FRAP须在酸性条件下进行，且反应易受糖、有机酸等还原性物质干扰，而CUPRAC可在近生理的中性环境下进行，反应选择性较高（由于Cu[sup]2+[/sup]氧化还原电位低于Fe[sup]2+[/sup]），同时耗时少、费用低，故推荐之。综上，为了尽可能全面分析葡萄冬剪枝条的抗氧化能力，我们推荐使用ABTS、PMS/NADH、TBA、TSS、Crocin/ABAP、RNO、TNB及EB等方法检测冬剪枝条清除人工自由基和多种活性氧的能力，使用TBARS法评价其抗脂质过氧的能力，使用Ferrozine法测试其螯合金属离子的能力，使用CUPRAC法衡量其还原特性。[b]3 小结[/b]本文在DS法的基础上应用Ti(IV)-H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]显色原理，建立了一种新的测定H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]清除能力的抗氧化方法—钛盐比色（TSS）法。另结合第三章内容，对19种抗氧化测试的方法学特征进行了综合考量，小结如下：（1）TSS法测试分为清除和显色两步，清除步骤的反应体系：适量VPE（1.0 mL, 0~400μg/mL）、H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]（0.5 mL, 10 mM）及PBS（1.5 mL, 60 mM pH 7.4），反应温度37°C，反应时间30 min。显色步骤参数：Ti(SO[sub]4[/sub])[sub]2[/sub]（0.1 mL, 50 mM）和H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub]（2.0 mL, 1.2 M）。反应体系终体积5.1 mL。最佳检测波长404 nm。（2）方法验证结果：线性范围1.7~33.3 mg/mL，摩尔吸光系数1030.6 L/M cm，检测限0.11 mg/L，定量限0.35 mg/L，精密度（RSD）0.58~3.36%，回收率84.3~96.1%。TSS法可成功用于评价VPE和多种标准物质的H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]清除能力，且灵敏度高于DS法近23倍，同时精密度、重复性、准确度均优于DS法。（3）所有VPE在测试浓度范围内均能有效清除H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]，且量效关系明显，平均清除力约为标准物质Trolox和Vc的2.3倍，但低于Catechin和TBHQ。不同品种间的清除能力存在差异，最强和最弱的分别为VT和PN。（4）相关性研究显示TSS法与PMS/NADH、TBA、EB及Ferrozine法之间存在极显著或显著正相关关系（[i]P[/i] 0.01或0.05），而与ABTS、RNO、Crocin/ABAP、CUPRAC及TBARS法间无相关性或呈弱相关。综合考量19种抗氧化测试的方法学特征，推荐使用ABTS、PMS/NADH、TBA、TSS、Crocin/ABAP、RNO、TNB、EB、TBARS、Ferrozine及CUPRAC等11种用于系统研究冬剪枝条的抗氧化特性。

白芍提取物体外抗氧化作用的研究目的：测定白芍提取物抗氧化的活性。方法：采用分光光度法对白芍提取物总抗氧化活性进行测定，使用754分光光度计，在520nm处测定其吸光度。结果：白芍提取物具有抗氧化活性，其抗氧化活性大小与浓度具有明显的关系。结论：分光光度法测定白芍提取物抗氧化活性稳定可行，简便，可作为白芍提取物的抗氧化测定标准之一。 白芍系毛莨科芍药植物( Paeonia lactiflora Pall.)的去皮干燥根，性微苦，味苦酸。有养血柔肝，缓中止痛，敛阴收汗的功能。我国白芍主产为浙江、安徽、四川等地。其化学成分主要为挥发油类、单萜类、三萜类及黄酮类化合物等。白芍具有抗凝血作用，能有效清除血管内皮过氧化物，能够明显改善由高胆固醇血症引起的血管内皮细胞的功能下降。可治疗胸腹胁肋疼痛，泻痢腹痛，自汗盗汗，阴虚发热，月经不调，崩漏，带下。中医认为白芍归肝、脾经,有养血、柔肝、疏肝的作用。近年来的研究证实，人体内自由基增多导致的脂质过氧化作用与多种疾病有关。因此，对抗氧化药物的研究已成为自由基医学研究领域中的一个重要课题。测定样品的总抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)或总清除自由基抗氧化力(total radical-trap pingantioxidative capacity， TRAC)激起了许多学者的兴趣。我国有丰富的植物资源，植物中酚类、黄酮类、萜类和多种提取的抗氧化活性物质的研究越来越受到关注，并且在衰老的自由基学说以及与衰老相关的疾病研究中，抗氧化活性物质的研究也占有很重要的地位。本文采用分光光度法对白芍提取物总抗氧化活性进行测定，以没食子酸标准品为对照，为白芍的进一步研究和应用提供依据。1 仪器和材料1.1 仪器 UV–754N型分光光度计（上海天普）；分析天平（TG-328A，上海天平仪器厂）；恒温鼓风干燥箱（DHG-9070AS，深圳亿博兰电子有限公司）；电热套；恒温水浴箱。1.2 材料白芍（安徽，121001）购于哈药世一堂。1.3 试剂总抗氧化能力测定试剂盒（研域化学试剂有限公司)，没食子酸标准品(121131)。其余试剂：双蒸水。2 实验方法[f

看到一年一度的原创大赛又开始了，收到坛主大人的邀请，将自己的一些心得和经历总结出来与大家分享，主要还是希望能够从中得到一些提高~~下面小生就再次献丑了~=====================================写在前面==============================================这次我们一同探究的是肝脏的抗氧化能力，为什么要探究这个问题呢？因为抗氧化和我们人体延缓衰老、解除有害代谢物有很大的关系，那么这个抗氧化又要从哪里说起呢？主要是与以下几个方面有关系：　1.　自由基也称游离基，是指含有奇数价电子并因此在一个轨道上具有一个未成对电子的原子或原子团。其产生途径很多，但一般是通过分子或离子的均裂获得的：具体有辐射诱导;热诱导;单电子氧化还原。它是机体代谢过程中所产生的一种副产品，可使脂类发生过氧化反应，而生成过氧化脂质(LPO)，LPO又可使细胞膜脂质组成发生变化，导致细胞内酶和蛋白质变性，而破坏细胞的结构和功能，且LPO还可使机体内重要脏器如心、肝等组织损伤，因而它对机体是有害的。　2.　超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)是一种广泛存在与生物体内与细胞氧化代谢密切相关的蛋白质，它是清除机体细胞中有害物质-氧自由基的功能活性蛋白质。是人体防御内外环中超氧负离子对自身侵害的一类金属活性酶，细胞中SOD以Cd2+、Cu2+等金属为辅基。SOD是人体内一种十分重要的活性物质，起着抗衰老和防止多种疾病的重要作用。它具有抗辐射、消炎、抑制肿瘤和心血管病的功能;可以改善人体自身免疫、延缓衰老;最具明显的功能为抗衰老、抗氧化，对创伤的修复、缺血再灌流损伤的防护有明显效果。 3. 在红细胞等组织中含有一种含硒的谷胱甘肽过氧化酶(GSH—Px)，可使氧化脂质(ROOH)和H2O2与还原型谷胱甘肽(GSH)反应，从而将它们转变为无毒的水或醇。所以还原型谷胱甘肽(GSH)可保护红细胞蛋白膜、血红蛋白及酶的巯基等免受氧化剂的毒害，维持细胞的正常功能。测定该酶的活性数量可作为人体衰老和生命活力状况的一个定量指标。　4.　Cd2+(或Cu2+)等金属离子都对动物(小白鼠)产生毒害作用，如对小鼠体内抗氧化酶活性产生影响，通过对小鼠体内抗氧化活性在注射前后的变化可以测定外来化合物的毒性强弱。　　所以为了探究外来重金属对肝脏的影响，我们就通过分析不同浓度的Cd2+注射对小鼠在不同血液中抗氧化酶的活性的变化来定量测定Cd2+金属对小鼠产生的毒性强弱，以及毒害程度随时间的变化情况，从而为细胞分子水平的毒性机制探讨和环境综合完全性评价提供科学依据。背景介绍完下面就是我们的实验部分了~~========================================实验经过========================================http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191422_305728_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191423_305730_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191424_305731_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191432_305737_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191433_305738_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191434_305740_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191435_305742_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191435_305743_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191439_305744_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191439_305745_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191440_305746_1947624_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107191442_305747_1947624_3.jpg========================================后记=============================================总的说来这次实验不是特别的满意，但是结论和我预想的是保持一致的，属于验证类的实验，使用的实验方法也比较简单，无非就是一些基本的实验操作~~也没有用什么特殊的仪器，后期数据处理的工作量比较大，因为是自己设计的验证性实验，所以也没有对出局处理仔细推敲，分享出来大家纯属参考下好了~~最后，帮活动宣传下吧，这次活动设计的很好，大家积极参赛，不要让版面落后哦！！

抗氧化剂是能阻止或延缓食品氧化变质、提高食品稳定性和延长贮存期的食品添加剂。但高剂量的抗氧化剂反而会对人体产生氧化损伤。常见的植物油中有9种抗氧化剂，均属于人工合成油溶性抗氧化剂，一般来说使用量较少，国家对抗氧化剂的最高限量做了严格规定。01、[b]适用范围[/b]适用于食品中PG、THBP、TBHQ、NDGA、BHA、Ionox-100、OG、DG、BHT九种抗氧化剂的测定。02、[b]参考标准：[/b]《GB 5009.32-2016 食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》03、[b]标准品：[/b]没食子酸丙酯（PG），叔丁基对苯二酚（TBHQ），去甲二氢愈木创酸（NDGA），叔丁基对羧基茴香醚（BHA），2,6-二叔丁基-4-羧甲基苯酚（Ionox-100），没食子酸辛酯（OG），2,6-二叔丁基对甲基苯酚（BHT），没食子酸十二酯（DG），2,4,5-三羧基苯丁酮（THBP）04、[b]GPC净化步骤[/b]凝胶色谱条件如下：表1[align=center][img=,600,197]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910121601149759_748_932_3.png!w580x191.jpg[/img][img=,600,211]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910121601180792_4870_932_3.jpg!w690x243.jpg[/img][/align]液相色谱条件：色谱柱：月旭Ultimate XB-C18，5μm，4.6×250mm流动相：A：0.5%甲酸水溶液；B：甲醇流速： 1mL/min进样量：5μL柱温：35℃检测波长：280nm[align=center][img=,600,401]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910121601213815_7787_932_3.jpg!w640x428.jpg[/img][/align][align=center]植物油加标20mg/kg过GPC后图谱[/align]表2：加标回收率[align=center][img=,600,424]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910121601261931_5294_932_3.png!w457x323.jpg[/img][/align]结论：[color=#3e3e3e][/color]使用月旭 Bio-beads S-X3 25*400mm对植物油中9种抗氧化剂进行净化提取，回收率范围80-101%，结果满足要求。详细的实验操作细节，请拨打400电话咨询。