细胞内相互作用

冷冻保存技术是将细胞长期维持在稳定的状态，从而应用于各种疾病的诊断和治疗。据1970年代以来的研究显示，多种类型细胞冷冻保存后的存活率会随着冷冻速率的不同而不同。大多数种类细胞的存活率与冷冻速率呈倒U形关系：即当超过最佳冷却速率后，细胞存活率随冷冻速率的增加而迅速下降，当低于最佳冷却速率时，细胞存活率随冷冻速率的降低而迅速下降。在快速冷冻速率下，细胞内的冰晶形成（Intracellular ice formation，IIF）会对细胞造成损害，并随着冷冻速率的增加导致细胞活性丧失。然而，IIF的机制仍无定论，目前业内存在的主要有以下三个假设：（1）Mazur假设称细胞外冰晶可以穿过膜孔生长进而诱导细胞内冰晶形成；（2）Asahina则认为冷冻直接破坏细胞膜是导致IIF的原因；（3）Toner等人则提出表面催化形成晶核是造成IIF的原因。　　传统低温光学显微镜技术是有限的，高速图像采集和双光子显微镜可以提高观察细胞冷冻的空间和时间分辨率，虽然可以在低温下观察细胞反应，却不能与每个细胞的活性相关联。显微拉曼光谱技术可对细胞进行无标记检测，并可用于细胞内水的热力学状态（即液态水与冰）等化学属性进行识别，因此可作为探究细胞冷冻反应的有力工具。此外，显微拉曼光谱的高空间分辨率和可区分细胞膜、线粒体等亚细胞结构的能力意味着该工具可用于进一步探究IIF及其成因，并通过拉曼光谱能够直接表征IIF对细胞活性的影响进而判别冷冻细胞后的活性。　　明尼苏达大学研究团队在Biophysical Journal发表题为“CharacterizingIntracellular Ice Formation of Lymphoblasts Using Low-Temperature RamanSpectroscopy”的研究成果（图1）[1]。研究结果表明显微拉曼光谱技术可用于研究细胞在不同冷冻速率和冷冻液成分下的冷冻反应。通过拉曼光谱发现胞内冰晶形成并不一定会导致细胞死亡，但细胞内冰晶的数量及大小会影响细胞活性。另外研究还发现，细胞内冰晶形成靠近于细胞膜并靠近于细胞外冰晶，而通过增加细胞膜和细胞外冰晶间的距离可以减少IIF；实验使用细胞松弛素D破坏肌动蛋白细胞骨架以改变细胞膜的渗透性来增加胞内冰晶形成量，当存在胞内冰晶时，可以显著的观察到细胞内渗透梯度，这些观察结果揭示了细胞膜与胞外冰晶的相互作用是导致IIF的原因。图1 研究成果（图源：[1]）　　此项研究选用Jurkat细胞作为淋巴细胞的模型细胞，采用的共聚焦显微拉曼系统Alpha 300R配备：UHTS300光谱仪、600 l/mm光栅以及DV401 CCD检测器。激发光源波长为532 nm，100×物镜(NA=0.9)，聚焦在被测物上的光功率为10mW，显微分辨率约为296 nm。将细胞冷冻至-50℃，并在成像前保持20分钟。每幅图像有60×60个像素，每个像素点采集的积分时间为0.2秒，因此，对整个细胞进行成像总共需要12分钟。分别在第20、80和140分钟时对相同细胞进行拉曼光谱成像采集，以排除来自激光照射带来的光损伤/光漂白的热量影响。　　单细胞中细胞色素c的分布被作为冷冻状态下细胞活性的衡量标准，其拉曼成像结果与台盼蓝染色结果高度一致。细胞色素c的空间分布使用 Moran' s I量化，并被用作细胞活性的标记。Moran' s I是一种基于信号位置和强度的进行空间相关性度量的方法，其值为-1时表示信号完全分散，+1时表示信号完全相关，0时表示信号随机分布。细胞色素c在750、1127、1314和1585 cm-1处具有强烈的拉曼信号，本实验以1127 cm-1作为标记峰用于生成细胞色素c的拉曼成像，并通过吖啶橙/碘化丙啶（Acridine orange/Propidium iodide，AO/PI）染色验证解冻后细胞的活性。根据常见的细胞内、外物质的特征峰位置（表1，图2），整合每个像素的光谱来组合拉曼成像，表征冰晶的大小、冷冻保护剂的细胞内浓度以及外部冰与细胞膜的接近程度。表1 拉曼光谱的波数分布数据来源：[1]∣制表：生物探索编辑团队图2 不同物质的拉曼光谱（图源：[1]）　　注：1)海藻糖；2)葡聚糖；3)DMSO；4)=细胞色素c；5)冰；6)冷冻保存在10% DMSO中的Jurkat细胞。根据左边的特定信号渲染出右边图像，并以光学显微镜图像为参考。　　结果发现：1　　细胞色素c的拉曼光谱可表征细胞复温后活性　　解冻后细胞复苏率与冷冻速率的之间的函数绘制曲线呈倒U形，可知“最佳”冷冻速率为1-3℃/min，当冷冻速率高于该曲线时认为是过快的，并会与IIF相关（图3A）。在冷冻细胞的不同焦平面上获得的拉曼成像显示，细胞中间（中心）的细胞色素c图像提供了最强的信号（图3B）。台盼蓝染色阴性细胞（活细胞）的细胞色素c局部拉曼信号强且最低Moran' s I值为0.65，而台盼蓝染色阳性细胞（死细胞）没有可区分的细胞色素c拉曼峰（图3C）。因此，可使用0.65的Moran' s I值作为区分活细胞和死细胞的阈值水平。图3 Jurkat细胞活性的拉曼检测（图源：[1]）　　注：（A）在10% DMSO中冷冻Jurkat细胞后的复苏率与冷冻速率的函数曲线图。（B）冷冻细胞在三个不同深度焦平面上细胞色素c的拉曼成像。（C）通过拉曼光谱检测冷冻后Jurkat细胞的活性并使用台盼蓝进行验证，对应的细胞色素c的拉曼特征、拉曼成像和计算的Moran' s I值。2　　拉曼光谱可分析细胞内冰晶的形成　　拉曼光谱测定了细胞在1、10和50℃/min冷冻速率下的细胞活性：以1℃/min冷冻保存后的细胞中有80%是活的，以10℃/min冷冻保存后的有60%的细胞是活的，而以50℃/min冷冻保存后的只有20%的细胞是活的（图4A）。每个细胞内冰的相对量可以根据冰的横截面积与细胞的横截面积的比值（Aic）来估计。Aic与不同冷冻速率相关性函数（图4B），Aic随着冷却速率的增加而增加。统计Aic与Moran' s I值的函数曲线图，结果表明活细胞中的冰晶比死细胞少，但存在群体上的差异（图4C）。图4 不同冷却速率下细胞内细胞色素C和冰晶的分布（图源：[1]）3　　基于拉曼图像可计算IIF的冰晶尺寸及位置　　在不同冷冻速率下，大多数细胞仅存在小冰晶。图5 细胞内冰晶的拉曼成像（图源：[1]）4　　拉曼图像可表征冰晶、细胞膜和IIF的相互作用　　分别将细胞以10℃/min的冷冻速率在10% DMSO或10% DMSO+10%葡聚糖中进行冷冻保存。通过拉曼成像分析IIF和Aic，细胞通常存在于相邻冰晶之间的未冷冻溶液中（图6A）。实验观察指定了两个不同的区域：1）细胞外冰晶靠近细胞膜的区域；2）相邻冰晶之间的区域，其中细胞膜远离细胞外冰晶（图6B）。通过测量细胞和细胞外冰晶之间的未冷冻溶液的厚度来表示细胞膜与细胞外冰晶的接近度（图6C）。图6 在10% DMSO或10% DMSO+10%葡聚糖中冰和Aic的拉曼图像（图源：[1]）5　　拉曼验证破坏细胞骨架增加了细胞内冰晶的形成量　　质膜不是孤立地起作用，而是与细胞中的其他结构相互作用，特别是细胞骨架。为了确定破坏膜结构对IIF的影响，将Jurkat细胞放置于50以及250μM细胞松弛素D（Cytochalasin D，CD）中培养30分钟，然后在10% DMSO中以10℃/分钟的速率进行冷冻。对于存在CD的实验，在10个细胞中有2个中观察到大块冰晶（图7A）。约83%的细胞靠近细胞膜存在比例很高的细胞外冰晶，其中带有大块冰晶的细胞确认死亡，而带有小冰晶的细胞部分死亡部分存活。细胞内冰晶与细胞膜的空间定位确证在细胞外冰晶附近（图7B）。在所有实验条件下，IIF的细胞比例相同（100%），但结果显示Aic会随着CD浓度的增加而显著增加（图7C）。图7 细胞松弛素破坏细胞骨架对IF的影响（图源：[1]）此项研究证实了拉曼光谱技术可用于研究细胞在不同冷冻速率、不同冷冻保护剂下的冷冻反应。此外研究还表明了IIF靠近于细胞膜，特别是与细胞外冰晶相邻的位置。随着靠近细胞膜且与胞外冰晶相邻的比例增加，IIF比例也会增加，并且随着细胞膜和胞外冰晶之间的距离减小，IIF比例也会随之增加，这些结果表明细胞膜和细胞外冰晶之间的相互作用是造成IIF的原因。该研究还进一步了解了冷冻保护剂的潜在作用机制，但是，研究中无法通过拉曼技术将细胞骨架与细胞内其他蛋白质成分区分开来，因此也无法明确IIF是否会损害细胞骨架。

细胞是跨越了至少四个数量级的、复杂而精妙的模块化系统【1】。对细胞内模块化系统的刻画主要有两种方式，一是蛋白质荧光成像，一是蛋白质生物物理特性，这两种方面的技术可以产生大量的数据，但是这两种方式所产生的数据库具有不同的质量和分辨率，通常需要分别进行处理。那如何将两种方式的优点进行同时整合呢？近日，美国加州大学圣地亚哥分校Trey Ideker研究组（第一作者为博士生秦越）与瑞典皇家理工学院以及斯坦福大学Emma Lundberg研究组合作发文题为A multi-scale map of cell structure fusing protein images and interactions，将来自于人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）【2】的免疫荧光图像与BioPlex数据库【3】中亲和纯化结果进行整合，构建了多维度细胞整合图谱MuSIC1.0（Multi-scale integrated cell），对人类细胞中的结构层次进行了统一化的分析，从而解析出69个亚细胞系统，为整合各种各样不同类型的数据来创建全蛋白细胞模型铺平了道路。真核细胞由多种大的组分组成，比如细胞器、凝聚体或者蛋白质复合体，从而形成一个多维度的结构。人类蛋白图谱系统性地对人类细胞中蛋白质在亚细胞结构中定位进行了全面解析，与此同时质谱与亲和纯化（Mass spectrometry combined with affinity purification， AP-MS）技术将临近标记引入蛋白质组学探究之中，从而能够快速检测蛋白和蛋白之间的相互作用。因此，如果能将蛋白质成像与生物物理之间的关联结合起来，便可以对细胞结果进行更进一步地解析。为此，作者们构建了一种机器学习方法，可以将蛋白质成像与生物物理特性进行关联和集成，从而构建一个亚细胞结构组成组分的统一图谱。图1 蛋白质成像与AP-MS数据库整合策略首先，作者们使用深度神经网络（Deep neural network，DNN）对蛋白质图像与相互作用数据进行整合，确定每个平台中蛋白质的坐标，对蛋白质之间的距离进行校准和组合，从而确认在不同维度下蛋白质复合体的组装方式（图1）。这两个全方位的数据库均来自HEK293细胞。作者们对蛋白质配对之间的相互作用距离进行检测，举例来说，来自蛋白质复合体中的蛋白之间相互作用距离少于20nm，而细胞器中的蛋白质之间距离可能会超过1μm。作者们分析了661个蛋白质之间的所有距离，以识别相互接近的蛋白质组分。随着距离的变化，能够产生一个蛋白质多维度结构层次图谱（图2）。由此，作者们发现所构建的MuSIC系统能够以很广的范围对生物系统内的蛋白质相互作用进行测量和捕捉。图2 结构层次图谱建立和检测的流程在建立起该整合图谱后，作者们希望对MuSIC系统进行一个全局性的评估。MuSIC图谱中有370个蛋白以前未在AP-MS实验中用于亲和标记进行相互作用因子的钓取。因此，作者们对134个猎物蛋白进行标记进行AP-MS实验，从而检测到339个相互作用配对，进而对该整合图谱的准确性进行了全面的验证。在MuSIC发现的全新的亚细胞系统中，有一个由七个蛋白质复合体组成的直径估计为81nm的系统，作者们将此系统命名为前体核糖体RNA加工组装复合体（Pre-ribosomal RNA processing assembly，PRRPA）。为了对PRRPA复合体在前体rRNA加工中的作用进行确认，作者们使用siRNA对每个蛋白进行了敲降，发现所有的敲降都会一定程度上破坏核糖体RNA的成熟。另外，作者们使用RNA免疫共沉淀定量qPCR对这些蛋白结合45S前体rRNA的能力进行检测，再次证明了这些蛋白质在前体rRNA加工过程中的作用。同时作者们发现所建立的MuSIC系统也可以对一些蛋白质的功能进行更为全面的认识，包括发现已知蛋白的全新功能和未知蛋白的潜在功能。总的来说，该工作通过汲取蛋白质荧光成像与蛋白质生物物理特性两方面之长构建了多尺度细胞整合图谱MuSIC 1.0，进一步地提高了现有蛋白质荧光图像中信息的分辨率，也为蛋白质相互作用提供了空间维度的信息，为人类细胞中蛋白质组研究提供了更为全面的认识。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04115-9

项目编号：0705-2240JDSMTXDK/04/招设2022A00214项目名称：上海交通大学单细胞相互作用仪预算金额：200.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：200.0000000 万元（人民币）采购需求：序号货物名称简要技术规格数量交货期1单细胞相互作用仪1）采用声场作用力，最大作用力高达1 nanoNewton（10 µm polystyrene beads）；2）具备单细胞分辨率：实时记录单个细胞相互作用的生物力学及位置的变化；3）其他技术要求详见第八章第二部分《技术规格》。1套签订合同后3个月内合同履行期限：签订合同后3个月内交货本项目( 不接受 )联合体投标。