推荐厂家
暂无
暂无
维权声明:本文为holiogodness原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。黄连中非洲防己碱色谱条件浅析背景介绍 黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云南黄连Coptis teetoides C.Y.Cheng的干燥根茎。以上三种分别习称“味连”、“雅连”、“云连”。黄连苦、寒。归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。能够清热燥湿,泻火解毒。用于湿热痞满,呕吐,泻痢,黄疸,高热神昏,心火亢盛,心烦不寐,血热吐衄,目赤吞酸,牙痛,消渴,痈肿疔疮,外治湿疹,湿疮,耳道流脓。 黄连中生物碱是黄连中的主要活性成分,因此建立黄连中生物碱含量测定方法尤为重要, 为黄连及其制剂的工艺研究与质量控制提供评价指标与评价方法。在黄连属植物中发现的生物碱,绝大部分为苄基异喹啉类,如:原小檗碱类、阿朴菲类、双苄基异喹啉类、苯菲啶类等,其中原小檗碱类又包括有原小檗碱型、甲基原小檗碱型、假原小檗碱型、氧化原小檗碱型和四氢原小檗碱型等,这些大多是季铵型生物碱。 以下是黄连中含量较高生物碱的结构式(第4个为非洲防己碱): http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010191307_252215_2165312_3.jpg非洲防己碱色谱条件 非洲防己碱是黄连中分离得到的季铵型生物碱中的一个(第四个结构)。 此图为非洲防己碱三维液相分析图谱,色谱条件(乙腈:水=4:6;甲酸调PH=3) 色谱柱:YMC C18(250×4.6mm,5μm); 检测器:紫外 流速:1ml/min 温度:30http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010181250_252050_2165312_3.jpg谱图分析及改善 本人曾一度认为样品已变,之后查阅文献才分析得出结论:非洲防己碱为季胺型生物碱,其存在解离与游离两种不同的形式,若色谱条件不能满足,非洲防己碱只存在一种形式,就有可能一个化合物出现两个色谱峰。故季胺型生物碱色谱分析时要求流动相中加入离子对试剂SDS,使其只存在一种形式而呈现单峰。色谱条件: 流动相: 0.05mol ·L - 1 磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH值至3.0)-乙腈( 60∶40,含SDS 1.0g/L); 流速: 1.0ml/min; 检测波长:345nm; 色谱柱: YMC C18(250×4.6mm,5μm); 检测器: 紫外 室温: 30℃ 下图为非洲防己碱二维分析图谱:(色谱条件如上所述)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010192207_252330_2165312_3.jpg小结与讨论 此色谱条件配制繁琐,且需现配现用。若长期放置会影响分析结果。SDS加入量会影响出峰时间,SDS增多,出峰时间提前,最佳浓度为1.5g/ml。SDS最好先加入到有机相中,否则可能会出现不溶.参考文献胡 敏,黄连的生药学鉴定,Strait Pharmaceutical Journal,2009,Vol21(14):89- 90
[align=center]原创-非洲猪瘟自检实验室试剂选择参考[/align]非洲猪瘟自检实验室,指的是屠宰场、食品加工企业、种猪场、规模猪场,在国家有关部门要求下,建立的以非洲猪瘟病毒核酸检测为主的微型实验室。这些实验室以前大多没有分子生物学检测基础和经验,对于如何选择试剂心中无数。下面提供一些选择试剂的看法,供参考:一、抗凝剂非洲猪瘟病毒核酸检测,对于屠宰场和种猪场、规模猪场来说,样品一般选择EDTA抗凝血。对于种猪场和规模猪场来说,采样量不大,推荐采购EDTA抗凝管。对于屠宰场来说,采购抗凝管确实方便,但也确实不便宜。农业农村部要求屠宰场采血做到全覆盖,试想一下:每支EDTA抗凝管成本约1元,屠宰场每天屠宰1000头,一年的抗凝管成本就是36万元。因此,在屠宰场看来,抗凝管是“想说爱你不容易”。在控制成本的策略下,自行配制抗凝剂成为不二之选。一般认为,1.5mg EDTA钠盐可以阻止1mL血液凝固。因此,每1mL血液需要用15 mg/mL EDTA钠盐溶液0.1mL。配制方法:(1)首先配制生理盐水溶液:取8.5g氯化钠,溶于1000mL纯水中;(2)配制EDTA溶液:取EDTA钠盐15g,溶于1000mL生理盐水溶液中,此时EDTA浓度为15mg/mL;(3)用法:取EDTA溶液0.1mL,置于塑料离心管或其它容器中,倾斜放置于37℃至45℃烘箱中烘干备用,可抗凝1mL以内的血液。使用方法:采血后立即将血液注入该离心管中,颠倒数次后混匀待用。如需抗凝更多血液,可按比例增加EDTA溶液用量。二、提取及扩增试剂1、提取试剂目前自检实验室普遍采用所谓的免提试剂盒,但站在专业的角度看,所谓的免提实际上是粗提,只不过省略了洗涤的过程。在此情况下,稀释核酸的试剂难免会对后续的扩增起到抑制作用。据报道,在不考虑试剂盒其他因素影响的情况下,提取核酸(也就是经过洗涤步骤)比免提取核酸(也就是未经洗涤步骤)灵敏度高10-100倍,反映到Ct值上,提取核酸比免提约低3-7左右。众所周知,屠宰场的待宰生猪,绝大多数是健康的。即便少数带毒,病毒量也极少。加上屠宰场采取混样检测,每个来源的生猪往往混成一份样品,有时混样比例甚至达到1:50。在此情况下,待检样品即使有病毒,其病毒核酸含量也被稀释得极低。如果再采用免提试剂盒,检测效果可想而知。综上,个人认为对于屠宰场,包括种猪场和规模猪场假定健康情况下,推荐采用核酸提取试剂盒,对于免提试剂盒应该慎用。2、扩增试剂目前荧光定量PCR扩增试剂已经非常成熟,一般的扩增试剂盒或者预混液,直接用于检测都能取得理想效果。因此,对于扩增试剂不需要过于纠结,选用推荐产品即可。3、引物探针及阳性对照在初步开放检测权限时,采用了“引物探针+提取试剂+扩增试剂”的模式,取得了不错的效果。在公布第二批试剂推荐名单前,多数实验室也是采用这种模式开展检测,包括参加各种比对试验。但遗憾的是,公布第二批名单后,引物探针及阳性对照不再供应,多数实验室也只能采购推荐名单产品。需要指出的是:目前市场上独立的DNA提取试剂盒,每个检测的成本约15元;通用的荧光定量预混液,每个检测的成本约10元;引物探针及阳性对照假设每个检测的成本为5元;合计每个样品提取及扩增的成本仅30元。而目前市场上非洲猪瘟检测试剂盒,供应价基本上每个检测在50-70元之间,无形之中增加了屠宰场及相关主体的经营成本。要知道,一个再小的屠宰场每天的检测量也有20份左右,每年增加的成本20份/天*360天*(20-40)元/份=(14.4-28.8)万元。基于此,强烈建议农业农村部考虑经济主体的经济承担能力,公布引物探针序列,并安排有关单位无偿或有偿供应阳性对照。三、消毒剂对于非洲猪瘟检测环境来说,极细小的污染都会造成实验结果的失败,甚至可能引起病毒扩散,因此做好消毒工作非常重要。对于非洲猪瘟来说,比较有效的消毒剂是0.8%氢氧化钠或氢氧化钾溶液。配制方法比较简单,取8g氢氧化钠或氢氧化钾溶于水即可。需要注意的是,一次不能配制太多,最好几天内用完。而且配制好的溶液,应贮存于密封的塑料喷壶或塑料瓶内,随用随取。四、灭菌指示剂按照规定,非洲猪瘟检测剩余样品、检测产物及废弃物等,均需经高压灭菌后进行无害化处理。灭菌效果是否达到要求,是一个不容忽视的问题。灭菌效果监测包括物理监测、化学监测和生物监测。物理监测:每次灭菌时观察温度、压力和时间等灭菌参数是否符合要求。温度波动范围在+3℃以内,时间满足最低灭菌时间的要求。化学监测:每次灭菌时,取一片灭菌指示卡或灭菌指示胶带,随同灭菌物品一同放入灭菌器,待灭菌结束后观察是否按规定变色。生物监测:每隔一段时间,应进行高压灭菌器生物监测,取嗜热脂肪肝菌芽胞菌片按规定程序灭菌,结束后在无菌条件下取出标准试验包的指示菌片,投入溴甲粉紫葡萄糖蛋白胨水培养基中,经56℃±1℃培养7d,观察培养结果。生化监测要求较高,涉及微生物实验操作,自检实验室可委托相关单位开展检测。
一、非洲猪瘟概述非洲猪瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短,最急性和急性感染死亡率高达100%,临床表现为发热(达40~42℃),心跳加快,呼吸困难,部分咳嗽,眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物,皮肤发绀,淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血,非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似,只能依靠实验室监测确诊。2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情。目前,我国内地各省(市、自治区)均有非洲猪瘟疫情报告。二、实验室检测资格开放时间表1、2018年8月3日前,各实验室在我国确诊首例非洲猪瘟疫情前,有关部门对非洲猪瘟的检测并未明确进行限制。但对于含有活病毒的感染性材料,相关法律法规和文件规定必须在BSL-3实验室进行。2、2018年8月5日,指定实验室农业农村部下发《关于做好非洲猪瘟防治工作的紧急通知》,规定“除我部指定的实验室外,任何单位和个人不得擅自保存病料,不得从事疑似含有非洲猪瘟病毒样品的实验活动。”指定的实验室包括:中国动物卫生与流行病学中心(国家外来动物疫病研究中心,简称动卫中心)、中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农科院哈尔滨兽医研究所、中国农科院兰州兽医研究所、军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所。3、2018年9月5日,省级实验室农业农村部下发《关于开展非洲猪瘟专项监测的通知》,决定各省、自治区、直辖市和新疆生产建设兵团省级畜牧兽医主管部门各推荐一个承担非洲猪瘟专项监测工作的实验室,并于2018年9月6-11日参加中国动物疫病预防控制中心组织的实验室检测能力比对。此后,通过能力比对的省级实验室,可开展非洲猪瘟实验室检测工作。4、2018年10月25日,其他实验室农业农村部下发《关于做好非洲猪瘟实验室检测工作的通知》,规定“现承担实验室检测任务的各省级动物疫病预防控制机构根据工作需要,并经省级畜牧兽医部门批准,可选择辖区内具有相应设施设备和专业技术人员,管理体系健全,近三年内未发生任何生物安全事故,具有生物安全二级或以上的实验室分担样品检测任务。受委托实验室可为高等院校、各级动物疫病预防控制机构、第三方检测机构等符合条件的实验室。”至此,各省(市、自治区)将非洲猪瘟检测权限逐渐下放至有相应管理和检测能力的实验室。实际操作中,一般是先下放至各地级市兽医实验室,然后逐步下放至县(市、区)实验室、第三方检测机构等。5、2019年1月2日,屠宰场自检农业农村部公告第119号规定:“生猪屠宰厂(场)应当在驻场官方兽医组织监督下,按照生猪不同来源实施分批屠宰,每批生猪屠宰后,对暂储血液进行抽样并检测非洲猪瘟病毒。经PCR检测试剂盒或免疫学检测试纸条检测为阴性的,同批生猪产品方可上市销售。其中,经PCR检测为阴性的,有关生猪产品可按照规定在本省或跨省销售;经免疫学检测试纸条检测为阴性的,有关生猪产品仅可在本省范围内销售。”并规定上述措施自2019年2月1日起执行。2019年3月13日农牧发7号《加强屠宰环节非洲猪瘟检测工作的通知》中指出屠宰企业开展自检,自建PCR实验室或委托实验室检测,要求生猪进场前以车为单位采集全部生猪血液样品,均匀混合后检测。跨省销售生猪产品和年屠宰10万头以上的屠宰企业以及生猪屠宰、加工一体化企业最迟于4月1日前开展非洲猪瘟自检;年屠宰5万头以上的屠宰企业最迟于5月1日前开展自检;其他屠宰企业最迟于7月1日前开展自检。6、2019年4月3日,猪肉制品加工企业自检市场监管总局、农业农村部和工业和信息化部发布《关于在加工流通环节开展非洲猪瘟病毒检测的公告》,要求猪肉制品加工企业、生猪产品经营者采购生猪产品应当批批查验其非洲猪瘟病毒检测结果(报告),不得采购没有非洲猪瘟病毒检测结果(报告)的生猪产品。猪肉制品加工企业应当参照《农业农村部办公厅关于非洲猪瘟病毒检测试剂盒有关事宜的通知》(农办牧〔2019〕3号)和农业农村部第119号公告的要求,从2019年5月1日对生猪产品原料开展非洲猪瘟病毒核酸检测。7、2019年4月12日,规模猪场、种猪场自检农业农村部办公厅发布《关于加强养殖环节非洲猪瘟疫情排查工作的通知》,鼓励规模猪场、种猪场配置检测仪器设备,规范使用经农业农村部批准或经中国动物疫病预防控制中心比对符合要求的检测方法,自行开展非洲猪瘟检测,提高排查工作的针对性和有效性。