酒石酸沃尼妙林对照品

我们大多数人可能都喜欢在闲暇的时候约上三五好友“来两杯”，或在特殊的日子为自己的爱人精心准备一场浪漫的红酒晚餐，亦或只是“我自饮来我自醉”的消遣，但是我们却很少关注并意识到葡萄酒酿造及酿酒工艺的科学。一瓶葡萄酒，从开始种植到酿造装瓶，大约需要生长5年、发酵3个月、橡木桶存放6~18个月，有时甚至还需要在海上运输2~3个月，毫无疑问，这是一门需要时间和耐心的技艺。在葡萄培育和酿酒工艺中，科学培育出优良的葡萄品种、改进酿造工艺、提升质量都是至关重要的环节，而这需要借助先进的科学手段和工具，扫描电子显微镜（SEM）作为一种超高分辨率的微观观测和分析的工具，在葡萄酒酿造产业中也“大有用武之地”！扫描电镜可从细胞、亚细胞水平乃至生物大分子水平对各种样品进行深入细致的分析观察。通过观察研究葡萄树的叶片、花朵、果实等的形态结构，可对葡萄品种选育、种植管理、采摘储藏等生产环节提供重要参考；通过观察分析发酵过程中原料、菌种、发酵产物等的状态和性质，可以帮助研究人员改善发酵工艺，分析生产中遇到的实际问题。图：由TESCAN合作发布的利用电镜研究葡萄培育和葡萄酒酿造工艺的相关文章入选《Lab+Life Scientist》期刊封面为了培育出优良的葡萄品种，研究人员需要借助高分辨率的扫描电子显微镜观察不同组织、器官的形貌结构（如植物表皮细胞组织、维管组织、气孔等），寻找优良植株的内在原因，最终培育成需要的品种。图：葡萄藤死表皮组织细胞的表面形貌（注：使用TESCAN MIRA3 FE-SEM在高真空下观察）图：在显微镜下观察到淀粉颗粒（绿色）沉积在葡萄藤的维管组织中（注：研究使用了TESCAN FE-SEM与冷冻传输系统对样品进行冷冻固定、冷冻断裂并保持在冷冻下观察，以获取样品的真实形貌。冷冻电镜方案特别适用于脆嫩的植物组织及一些冷冻下才能稳定保存的样品，如冰激凌等。）在具有超高分辨率的电子显微镜下，还可以清晰地观察到葡萄叶的形态细节以及位于葡萄叶表面的气孔。气孔在植物碳同化、呼吸、蒸腾作用等气体代谢中，成为空气和水蒸气的通路，在生理上具有重要的意义。图：葡萄叶及其表面气孔的微观形貌细节（注：样品使用化学固定、脱水及临界点干燥处理）酵母菌在葡萄酒酿制中是不可缺少的。简单来说，酿酒酵母就是一种单细胞微生物，可以将葡萄中的糖分转变为酒精，也就是俗称的酒精发酵。为了培养、识别出优质的酵母，研究人员需要通过观察菌种的大小、形貌等细节来辨识不同菌种。酒香酵母（Brettanomyces），是一种在酿酒过程中随时可能出现的物质，它因为能够为葡萄酒增加“香味”，而被人铭记。适量的酒香酵母可以为葡萄酒增添风味，但过量存在时则会使葡萄酒散发出一种类似“臭袜子”或“马骚味”的气味，破坏酒的气味和口感。图：电子显微镜下观察到的酒香酵母细胞（注：样品使用化学固定、脱水及临界点干燥处理） 另外，在葡萄酒酿造中，还会产生一种副产品—酒石酸氢钾。这是一种无色至白色的斜方晶系结晶性粉末，无臭，有令人愉快的清凉酸味，通常被食品工业称作塔塔粉。但在酿酒过程中，产生的酒石酸氢钾会与酵母细胞结晶产生浑浊的细白色或淡黄色沉淀物，这些沉淀物虽然不会影响葡萄酒的味道或气味，但它会影响葡萄酒的美感。图：肉眼观察到的的酒石酸氢钾图：电子显微镜下的酒石酸氢钾与附着在其表面的酵母细胞（注：酒石酸氢钾易溶于水，样品不能用常规制样方法，例如化学固定，因此使用TESCAN MIRA3 FE-SEM低真空功能直接进行观察。TESCAN的低真空功能特别适用于不导电样品的直接观测及电子束下不稳定的生物样品。）在葡萄酒发酵成熟时，酒液中也会有残留的死酵母、杂质、葡萄残渣以及部分酒石酸结晶，这些物质会沉淀形成酒泥。因此，在装瓶前，酿造者通常会使用“倒桶”、过滤或下胶澄清、冷却结晶等方式去除这些沉淀物，来保证葡萄酒的“美感”。图：在电子显微镜下观察葡萄酒的澄清过滤（过滤孔筛的孔隙范围为0.45~1.2μm）（注：使用TESCAN水汽注入系统可直接观察样品，保持样品最原始的状态。水汽注入系统特别适用于易失水的生物样品及水汽参与反应的原位实验，如食盐溶解与重结晶、水泥固化等）以上图像及数据来自于由全球扫描电子显微镜的领先制造商TESCAN与捷克国家葡萄酒中心合作开展的一项研究，该项研究利用超高分辨扫描电子显微镜探究葡萄培育和葡萄酒的酿造工艺。这项研究工作在TESCAN MIRA3超高分辨场发射扫描电镜（FE-SEM）上完成，在本研究中使用的样品由位于布尔诺的孟德尔大学的葡萄培育和葡萄栽培部提供。目前，相关研究成果已在捷克国家葡萄酒中心公开展览，展览地设在著名的Valtice城堡的总部，该城堡也被联合国教科文组织列为世界遗产地。图：在捷克葡萄酒酒都Valtice城堡展出的“特殊展览” 该项研究的合作和技术支持—TESCAN公司的总部位于捷克布尔诺市，该地区被称为欧洲电子显微镜的摇篮。布尔诺也是捷克共和国南部与奥地利和斯洛伐克接壤的摩拉维亚地区的首府，这里是捷克主要的葡萄酒产区，占其国家总产能的96%。捷克国家葡萄酒中心主任Pavel Kr?ka谈到：“据我们所知，这个展览是同类型展览中的第一次，展览非常受欢迎。参观者们被这些图像所震撼，因为这个展览在吸引葡萄酒爱好者，传播葡萄酒文化的同时，还为参观者展示了葡萄酒种植及酿造相关的科学内容！“

导语2020年山西省运城市垣曲县北白鹅村发现一处古墓，山西省考古研究院等对该处墓地进行了抢救性发掘，经认定这是西周到东周时期召氏家族的墓地。2022年2月12日，中国科学院大学人文学院考古学与人类学系杨益民教授课题组在《Microchemical Journal》期刊发表关于《中国中部北白鹅遗址酒类残留物的表征》的文章。该研究设计了一套GC-MS和HPLC-MS/MS分析疑似古酒残留的综合分析流程，并将其应用于中国中部北白鹅墓地（约公元前8世纪）出土铜壶内的液体和淤泥，研究认为北白鹅遗址出土的这批酒类遗存为非葡萄原料的果酒，这是目前东亚地区经过科学分析确认的最早果酒。研究成果快览山西省运城市垣曲县北白鹅村对于大多数人可能比较陌生，但对于考古届是一个非常著名的地方，早在上世纪50~70年代，这里曾先后发现数十处遗址，这些遗址的年代跨越旧石器时代、新时期时代以及夏商周代。2020年4月12日，山西省考古研究院等对垣曲北白鹅村的一处墓地进行了抢救性发掘，发现两周之际高等级墓葬九座，并初步认定该墓地为召氏家族太保匽中(燕仲)一支在东周王畿内的采邑公共墓地。其中M1、M2、M5等墓葬出土铜壶中含有液体或土样（图1），怀疑是古酒遗存。图1 山西垣曲白鹅墓地出土铜壶及其内部液体和淤泥遗存为确认铜壶内液体残留物的成分组成，中国科学院大学人文学院考古学与人类学系与山西考古院、岛津北京分析中心合作，对M1铜壶内液体残留物、器底土样和M2、M5铜壶器底土样进行取样研究。科研人员建立了一系列标准化测试流程，从液体样品、土样中提取有机残留物，利用气相色谱质谱（GCMS-QP2020NX）检测到乙醇、乙酸、乙酸乙酯等挥发性有机物，并开发出一套利用高效液相色谱-串联质谱（LCMS-8045）快速、准确测试成分复杂的考古样品中多种有机酸的定量方法。图2 中国科学院大学硕士研究生李敬朴在岛津北京分析中心开展部分实验气相色谱质谱仪分析北白鹅墓地铜壶内残留物科研人员从液体样品、土样中提取有机残留物，液体样品采用顶空-气相色谱质谱仪，检测出乙醇等成分。土样样品使用有机溶剂提取后，进行衍生化处理，采用GCMS仪器检测出有机酸、酯、醇酯、糖类等与酒直接相关的物质。图3 岛津气相色谱四极杆质谱仪GCMS-QP2020 NX仪器及其特点图4 BBE-1顶空进样GC-MS分析的TIC谱图（峰2为乙酸乙酯；峰3为乙醇；峰5为乙酸）液相色谱质谱仪分析北白鹅墓地铜壶内有机酸科研人员建立了一种使用岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪LCMS-8045测定考古残留物中的7种有机酸的方法。将液体样品过滤后，用超高效液相色谱分离，三重四极杆质谱仪进行定性定量分析。研究结果显示，垣曲北白鹅墓地铜壶残留物中发现较多的酒石酸、丁香酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、乳酸等多种有机酸。丁香酸的存在，证实残留物为果酒遗存。通过分析酒石酸的相对含量判断该遗存并非葡萄酒。图 5 岛津超高效液相-三重四极杆质谱联用仪 LCMS-8045及其特点图6 标准样品(混标中酒石酸、丁香酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸浓度均为500 ng/mL，乳酸，富马酸浓度为5000ng/mL)的MRM色谱图表1 古代样品、现代参考样品和古代对照样品中七种有机酸的含量专家心声中国科学院大学人文学院考古学与人类学系杨益民教授杨益民教授指出，对古酒残留的鉴定需要对其中的多种有机物进行分析。现代质谱分析技术具有检测信息丰富与对复杂基质样品的高耐受性的特点，特别适合于分析如酒类残留物等有机质考古遗存样品。本研究使用了岛津的GCMS与LCMSMS对北白鹅墓出土的酒类遗存样品进行了检测，实现了对样品中醇类、酯类，特别是有机酸类物质的综合分析，为确认样品为果酒遗存提供了让人信服的证据，这将果酒在中国的历史提前约五百年，改变了过去酿酒史学界关于东亚缺乏果酒酿造传统的观点。参考文献Jingpu Li , Jiyun Yang , Jun Cao , Puheng Nan , Jie Gao , Danshu Shi , Bin Han , Yimin Yang *. Characterization of liquor remains in Beibaie site, central China during the 8th century BCE. Microchemical Journal.177(2022)107293.本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

精准药物分析的工作，离不开稳定的分析系统和可靠的标准物质（标准品/对照品等）。标准物质具有复现、保存和传递量值的基本作用，对实现测量结果的溯源性，保证测量结果在时间与空间上的连续性与可比性，进而确保测量结果的准确可靠、有效与国际互认具有关键作用。 岛津为制药行业客户提供稳定可靠的标准品/对照品制备解决方案：制备液相系统（Prep LC）、质谱引导的制备液相系统（MS-trigger Prep LC），超快速制备纯化液相色谱系统（UFPLC）、制备超临界流体色谱（Prep SFC）。 超快速制备纯化液相色谱系统（UFPLC）可在线完成从分离、浓缩、纯化到回收的制备全过程。 2020年，中国药科大学药物分析系吴春勇博士于新药仿药CMC实操讨论群进行了精彩而全面的主题分享，并发表在“新药仿药CMC实操讨论”公众号，经过“新药仿药CMC实操讨论”的授权，在此分享吴春勇博士的《化学药物研发过程中的对照物探讨》。 概述案例 对于吴春勇博士的《化学药物研发过程中的对照物探讨》，新药仿药CMC实操讨论群也进行了较为热烈的探讨。PPT正文后续延申的讨论内容如下（基本按照时间先后顺序列出）。 沈晓斌博士（前FDA资深审评员，FDA报批咨询顾问）：very nice.吴博士论述的非常全面、非常细。我们就说比如说在FDA做review的时候呢，我们个人不会接触那么全面，各种各样的方式，这个标准品的这个去就是抽点它的含量呀，就是拿到他的COA，通常不会把各种方法都是看过一遍的。 就是它这个PPT呢，把所有的东西都给想细细的捋了一遍，个人觉得就是这是一个对知识体系的全面的补充，有些东西，因为你以前没有接触过，你不会考虑那么细，当在FDA的时候你看到的是公司怎么做，然后你来评估他是否合理，是否可以接受，或者跟FDA的现有要求，来评估。 想要就说一点，FDA本身他不去说去该怎么去定量，这个标准品他只是负责审评，就是评审你（的资料），外界可以自己去建议你想要的方式，但是你要有足够多的科学依据，然后他（FDA）来评估是否可以接受，就是完全靠自己来论述清楚。 另外就是说国内看起来，这个我以前对国内这个没有太多的，而且也没有特别去关注，因为我这个工作最早才从FDA报批方面的东西，吴教授这个主题一讲，觉得国内在有些方面其实要求是似乎是比USP、FDA的要求更细更多一些，有一种感觉就是弯道超车已经超了，在有些方面实际上是做的更好。只不过，过去这些年，西方就是设定了这种既定的质量标准，那其他国家，就因为你要照着西方去做仿药嘛，你就必须根据他的规则来走，更多的是这方面的区别。 孙亚洲老师（长沙晶易首席科学家）：意见1：研发人员买的非法定对照品，外标法测定杂质含量时，很多人直接采用了COA的赋值，也直接采用相应的测定结果订入了标准，有些不妥。包括批检验，最初的朔源需要是法定对照或者经过标定的对照品。 意见2：在吴博士的ppt中，对于非法定来源的如百灵威，sigma等买到的杂质对照品，拿到后是否需要再行进行研究工作或者分析一下是否存在风险，似乎没有提出来。这个问题建议大家是否深入思考一下。 群主补充：只有经过标化赋值且可溯源（过程，方法，验证）的，风险才是最低的。 群主补充：尽管杂质测定中，如5%的误差是可以接受的（这属于科学性的范畴）；但不等同于对照品/标准品可以草率拿来，草率采用他人的赋值，这完全是两个范畴。也许某份杂质对照品中含水量10%，无机成分包括前处理过程带来的硅胶等30%，若草率定量，杂质的真实含量会被低估如40%。 沈晓斌博士：同意以上的观点。 群友1：通过药品杂质的公司购买的对照品，我们就碰到了，欧美的一家知名公司提供的对照品结构出现偏差，我们通过多次比对都无法拿到和代谢产物吻合的结果，多次交涉和讨论之后才发现该公司的产品是另外一个同分异构体。 吴春勇博士（中国药科大学药物分析系副教授）：看来概率虽然小，这个问题还是客观存在的。 沈晓斌博士：提供化合物的公司没有责任和义务。使用者必须做该做的来证明给监管机构标准品的使用是合理的。 刘国柱博士（长沙晨辰医药创始人、技术总监）：我请教吴博士一个问题，目前国内杂质对照品市场非常混乱，大部分购买的杂质对照品都是经几手倒卖才到厂家手里，对照品塑源存在问题，谱图与赋值真实性也存在问题，请问对此引入的风险有何看法？ 群友2：在购买对照品的时候，在COA的同时能否得到该合成方法的信息，这个在技术层面上是有难度的。没有哪个合成公司愿意提供产品合成路线给对方的。 群友3：好多杂质对照品本身不稳定，需要在-20℃保存，有可能在运输过程中就发生了变化，拿到的第一时间应该进行确认，遇到好几次这种情况。 吴春勇博士：在现有的条件下，购买的商业化对照品全部自己赋值，实践上还是存在相当的困难，成本上也没法控制。所以我个人观点：1）尽量选择知名公司；2）自己对风险进行评估，尤其是校正因子与各国药典不同，或者结构上与待测药物的生色团类似，分子量相当，校正因子却有显著不同。 【插话：知名公司依旧有风险或风险大】 是的，分享的那个案例，购买公司是业界相当知名的！ 群友4：购买杂质时能同时获得合成信息的可能性非常小，最多提供四大谱（还不带解谱的），那就需要公司内部有比较强大的解谱能力，有碰到过解谱结果和供应商提供的不一致的情况，所以购买“商业化”的杂质对照风险是很大，市场良莠不齐，缺乏有效的管控。 群友5：我们碰到问题的那家公司就是业界知名对照品公司，也有出失误的概率。 刘国柱博士：另请教吴博士及大家一个问题，目前国内许多企业对于杂质对照品的结构确证，很多时候都只做了质谱与NMR氢谱与碳谱，不做二维；而事实上不做二维NMR谱，NMR信号是无法归属的，从而不足以确定杂质结构，有可能确证的结构是错的；请问这个问题大家如何看待？ 吴春勇博士：我个人只要做结构确认，一定做二维。 刘国柱博士：那我和您观点一致，强烈呼吁大家做结构确证一定要做二维。 购买的杂质对照品一般只提供质谱与NMR氢谱与碳谱，不做二维与结构解析；在此习惯引导下，国内许多企业自已做杂质结构确证也只做个质谱与NMR氢谱与碳谱，个人观点这是存在风险的做法。 代孔恩（安士研发总监）：法规有明确规定必须这么表征，很多标准品量很小，做全应该不容易。【插话：情况多，复杂，没法一刀切】 黄常康博士（南京百泽医药创始人）：有些杂质是定向合成的，或者是有文献数据的。我觉得根据实际情况来判断需不需要。不用二维定不了结构的，该做就做，有些简单的杂质，其实氢谱已经足够了，质谱只是多一个证据。 自己做的话，还需要加上做结构确证的杂质的钱，很多时候会差很多。 群友6：对照品的检测分析，既要有普遍性的，也要特殊性的，这个普遍性与特殊性的界点怎么界定，很难有一个文件化的说法。 以上讨论内容来源： 新药仿药CMC实操讨论公众号