色谱矫正法

新冠病毒肺炎疫情至今已造成全球1.4亿人感染和300余万人死亡。随着疫情进展，突变病毒株不断出现，对中和抗体和疫苗的防护效果提出了严重挑战，迫切需要针对各型突变株中高度保守的转录复制过程开展深入研究，阐明关键药物靶点的工作机制，发现能够有效应对各种突变株的抗病毒药物。 新冠病毒是目前已知RNA病毒中基因组最大的一种病毒（约30 kb），其基因组编码了一系列非结构蛋白，并按照一定的空间和时间顺序，形成复杂的超分子蛋白质机器“转录复制复合体”（RTC），负责病毒转录复制的核心过程，包含了众多保守的抗病毒药物设计的关键靶点。由于基因组极大，同时聚合酶复制保守性较差，新冠病毒进化出一种独特的“复制矫正”（proofreading）机制，利用转录复制复合体中关键的nsp14蛋白对复制过程进行矫正，一旦发现聚合酶合成了错误配对的碱基，立刻通过nsp14具有的外切核酸酶（ExoN）将错误碱基处理掉，保证复制的准确进行，这也是病毒逃逸核苷类抗病毒药物的关键途径。同时，nsp14是一个独特的双功能蛋白，除负责复制矫正的外切核酸酶外，还拥有一个N7甲基化酶（N7-MTase），负责mRNA加帽过程关键的第三步催化反应。复制矫正和加帽过程如何进行，特别是两个截然不同的生化过程如何在一个nsp14蛋白中协同作用，是20多年来冠状病毒研究领域中最关键的几个“未解之谜”之一。 2021年5月24日，清华大学饶子和院士、娄智勇教授团队与上科大高岩博士合作在Cell发表研究论文Cryo-EM Structure of an Extended SARS-CoV-2 Replication and Transcription Complex Reveals an Intermediate State in Cap Synthesis，解析了新冠病毒超分子蛋白质机器“转录复制复合体”关键状态的三维结构，揭示了病毒mRNA加帽、基因组复制矫正、逃逸核苷类抗病毒药物的分子机制。这是该团队在新冠病毒转录复制复合体研究中，继在Science、Cell等期刊上连续发表4项成果后的又一重要工作。 新冠疫情爆发后，清华大学饶子和院士、娄智勇教授团队针对新冠病毒转录复制机制开展的深入研究，先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）[1]、“延伸转录复制复合体”（E-RTC）[2]和“加帽中间态转录复制复合体”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作机制。在此基础上，研究团队成功解析了Cap(-1)’-RTC与nsp10/nsp14形成的超级复合体Cap(0)-RTC的三维结构（图1）。 图1 新冠病毒Cap(0)-RTC的工作机制 在该复合体中，nsp9蛋白发挥了“适配器”（adaptor）的作用，通过与nsp14蛋白相互作用，将nsp10/nsp14复合体招募到Cap(-1)’-RTC中，从而利用nsp14的N7甲基化酶结构域完成mRNA加帽过程的第三步关键反应。尤为重要的是，研究团队发现Cap(0)-RTC在溶液状态下会形成稳定的同源二聚体。在二聚体中，解旋酶nsp13通过其1B结构域的重大构象变化，引导模板核酸链反向移动，引发产物链backtracking机制，从而将产物链3’末端传输至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶结构域的反应中心，完成错配碱基的矫正过程（图2）。 图2新冠病毒复制矫正的in trans backtracking机制 这一发现所提出的in trans backtracking的复制矫正机制，与真核/原核细胞RNA聚合酶Pol II的复制矫正机制具有一定的类似性，表明作为基因组最复杂的RNA病毒，新冠病毒的转录复制过程已与高等生物具有一定的类似性，阐明了冠状病毒研究领域20多年来悬而未决的关键科学问题。同时，复制矫正机制是新冠病毒逃逸核苷类抗病毒药物（如瑞德西韦）的关键机制，一旦核苷类药物被加入RNA产物链中，即会被病毒的复制矫正过程去除，从而丧失抑制活性，目前仅有NHC及其衍生物可以逃逸该过程。该成果也将对未来进一步优化和发展新型核苷类抗病毒药物提供关键的结构基础。 该成果的获得得益于研究团队在冠状病毒转录复制领域中17年多的长期积累。自新冠疫情发生后，研究团队系统研究了新冠病毒转录复制过程，阐明了关键药物靶点蛋白主蛋白酶Mpro和转录复制复合体多个状态三维结构，为认识病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，先后在Nature[4]、Science[1]、Cell上[3,5]和Nature Communications[2]上发表系列研究论文，是国际上抗新冠药物靶点研究中最为系统、引用最多的工作之一。 清华大学饶子和院士、娄智勇教授/ChangJiang学者特聘教授和上海科技大学的高岩博士为共同通讯作者，清华大学医学院和生命学院的闫利明博士、杨云翔博士，以及博士生李明宇、张盈、郑礼涛、葛基、黄雨岑、刘震宇为共同第一作者。 专家点评（一） 钟南山（中国工程院院士） 从“非典”到“新冠”，科学依靠坚守 基础研究是科技创新的源头，是人类认识自然、适应和改造自然的知识源泉，需要科学家长期的坚守和耕耘。 自2003年“非典”开始，在不到20年的时间里，全球已经出现了3次由冠状病毒导致的传染病。尤其是此次新冠疫情，在全球已经造成超过1亿多人感染，而且随着疫情发展，突变病毒不断出现，一些已有的中和抗体不能很好的中和突变病毒，部分疫苗针对突变病毒的保护效果也有一定程度下降。深入认识病毒的生命周期，开发能够有效应对各种突变病毒的广谱抗病毒药物，将成为今后一段时间抗疫工作的重点内容之一。 目前针对新冠病毒的抗病毒药物研究，主要针对的是病毒转录复制过程的关键靶点蛋白，如蛋白酶和聚合酶等。针对这两个靶点的抑制剂已有相当数量的进入临床实验，例如瑞德西韦（Remdesivir）等。以瑞德西韦为代表的核苷类抗病毒药物主要作用于病毒的聚合酶，在被掺入产物核酸链后，阻断病毒核酸的合成，进而抑制病毒的转录复制过程。然而，在此类抑制剂进入临床研究后，其抗病毒效果与预期有一定差距。除药物代谢等问题外，冠状病毒通过特有的“复制矫正”（proofreading）机制逃逸核苷类抗病毒药物的抑制，可能是此类抗病毒药物抑制效果不佳的一个重要原因，目前仅有NHC及其衍生物能够躲避病毒复制矫正机制的干扰。对这个机制开展深入研究，将为今后发展广谱、高效的抗冠状病毒药物提供关键的科学信息。 子和教授及其团队在新冠疫情爆发后，针对新冠病毒转录复制机制开展了系统研究，先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）[1]、“延伸转录复制复合体”（E-RTC）[2]和“加帽中间态转录复制复合体”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作机制。在这些工作的基础上，他们又在世界上第一次成功组装成含有形式复制矫正功能的nsp14蛋白的超分子机器Cap(0)-RTC。通过结构分析，他们发现在Cap(0)-RTC形成的同源二聚体中，解旋酶通过自身构象改变，引导模板核酸链反向移动，引发产物链“回溯”（backtracking）机制，进而将产物链3’末端传输至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶结构域的反应中心。复制矫正机制是新冠病毒逃逸核苷类抗病毒药物的关键机制，一旦核苷类药物被加入RNA产物链中，在其被聚合酶感知为“错配碱基”后，立刻会被病毒的复制矫正过程去除，从而丧失抑制活性。他们的研究工作，为我们生动展现了这一过程的可能机制。复制矫正的回溯机制，是从低等到高等生物细胞保证基因复制准确性的重要机制，但在病毒中以往还没有发现此类机制。这一研究成果不但发现病毒中的类似机制，是认识生命进化的重要成果，而且为进一步优化和发展新型核苷类抗病毒药物提供了关键的结构基础。 子和教授自2003年SARS爆发后，就一直在冠状病毒转录复制机制研究领域开展工作，至今已坚持了18年。2003年SARS疫情爆发期间，我当时即已了解子和教授在SARS病毒的一系列成果，智勇教授那时才刚刚开始博士阶段的学习。子和教授的研究组在国际上率先解析了SARS-CoV主蛋白酶的三维结构[6]，并研发了一系列高效抑制剂[7]，他们当时在转录复制复合体上的研究[8]至今仍被国际同行认为是冠状病毒转录复制复合体机制研究的“开篇之作”。这些积累，为新冠疫情爆发后他们在新冠病毒基础研究中取得的一系列重要成果奠定了坚实的基础，通过阐明新冠病毒主蛋白酶和转录复制复合体多个状态的三维结构，为认识该病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，先后在Nature[4]、Science[1]、Cell[3,5]和Nature Communications[2]上发表系列研究论文，是国际上抗新冠药物靶点研究中最为系统、引用最多的工作之一。 2020年9月11日，习近平总书记在科学家座谈会上总结了新时代科学家精神，强调要有勇攀高峰、敢为人先的创新精神，追求真理、严谨治学的求实精神，淡泊名利、潜心研究的奉献精神，集智攻关、团结协作的协同精神，甘为人梯、奖掖后学的育人精神。18年来，子和教授的团队中有100多人先后参与冠状病毒研究，累计发表50余篇研究论文，引用超过6000余次，均篇引用超过100次，一批早期参与的俊彦陆续成长为国家科研骨干。科学依靠坚守，子和教授团队在冠状病毒的奋斗历程，对科学家精神做了一个很好的诠释。 专家点评（二） 康乐（中国科学院院士） 从结构生物学角度认识新冠病毒的转录复制机制 新冠病毒造成的疫情，是近一个世纪以来人类面对的最大的一次公共卫生事件，深入研究病毒生命周期的分子机制，是认识病毒特征、研发抗病毒手段的关键所在。新冠病毒非常特殊，它的基因组是目前已知RNA病毒中基因组最大的一种，其生命过程所涉及的分子机制也非常复杂。新冠病毒通过两个机制保证蛋白质翻译和相对准确的转录复制过程，一是要在病毒mRNA前端加上一个帽结构（cap），用于维持mRNA的稳定性和蛋白翻译的有效进行；二是通过一个独特的“复制矫正”（proofreading）机制，对病毒基因组的复制实施控制，一旦发现核酸中的错配碱基，随时进行修正。病毒转录复制复合体上的nsp14蛋白参与了这两个关键过程，可通过其C端的N7甲基化酶完成mRNA加帽过程的第三步催化反应，同时还可通过其N端的外切核酸酶完成复制矫正过程。这一现象在“非典”病毒（SARS-CoV）即已发现，但20年来一直无法回答两个截然不同的过程如何由一个蛋白来协同执行，是冠状病毒研究领域中多年来关注的核心基础生物学问题之一。 清华大学饶子和教授、娄智勇教授团队与上海科技大学合作在Cell发表的这一工作，解析了两种不同状态的“Cap(0)转录复制复合体”Cap(0)-RTC的三维结构，发现在转录复制复合体中，病毒编码的nsp9蛋白发挥了“适配器”（adaptor）的作用，将nsp10/nsp14形成的复合体招募到聚合酶上，与聚合酶上的NiRAN结构域共同形成一个“共转录加帽复合体”（Co-transcriptional Capping Complex, CCC），展示了mRNA加帽过程中，mRNA 5’端在多个关键酶分子之间的传输路径，第一次明确揭示了基因组超大的RNA病毒是如何将以聚合酶为中心的“延伸复合体”（Elongation Complex, EC）与“加帽复合体”连接起来。更加重要的是，他们在研究中发现Cap(0)转录复制复合体在溶液状态下会形成稳定的同源二聚体，通过深入研究该二聚体的结构，提出了冠状病毒复制矫正中称之为反式回溯（in trans backtracking）的机制。进一步的研究发现，在二聚体中，一个Cap(0)转录复制复合体的聚合酶催化中心与另一个Cap(0)转录复制复合体的nsp14外切核酸酶结构域催化中心相对，使合成的产物RNA 3’末端能够通过回溯的方式传输到nsp14外切核酸酶结构域进行加工。同时，他们还发现解旋酶nsp13的1B结构域发生了重大构象变化，并通过与模板核酸链的作用，引导模板核酸链反向移动，引发产物链回溯机制。值得指出的是，通过回溯的方式进行复制矫正，在真核/原核细胞中广泛存在，但是在病毒中还是第一次观察到此类机制。虽然该过程与真核/原核细胞Pol II转录过程的复制矫正机制具有一定类似性，但在Pol II的研究中，并未观测到蛋白具有巨大的构象变化，因而Pol II中回溯的驱动力也不是十分明确，而该工作表明解旋酶通过构象变化提供了回溯的驱动力，为深入理解这一基础生物学过程提供了重要的范例。

项目编号：DDZK202202项目名称：300kV球差矫正透射电子显微镜（进口）预算金额：1900.0000000 万元（人民币）采购需求：300kV球差矫正透射电子显微镜，可实现原子级透射成像（TEM）和扫描透射成像（STEM）, 通过球差矫正器，透射成像分辨率≤70pm，扫描透射成像分辨率≤60pm。球差矫正透射电子显微镜配备具有原子级分辨能力的电制冷能谱仪EDS，可进行原子级尺寸的点、线、面的定性定量分析。数量：1套合同履行期限：合同签订后360日内交货。本项目( 不接受 )联合体投标。

下肢畸形临床较常见，患者不仅下肢功能受到严重限制，晚期还会造成关节退变引起骨关节炎。而且影响患者外观和步态异常等造成患者心理压力、影响患者心理健康，因此需要早诊断、早治疗。21岁的钱小姐，正值花样年华却遭受此病痛烦扰，由于双下肢的严重畸形，且已错过最佳诊疗时机，不少医院同行都表示束手无策，不敢妄下决断。但是钱小姐经介绍找到了华南理工大学医学院教授、广州市第一人民医院关节外科丁焕文主任医师，在计算机技术、3D打印、虚拟仿真、XR技术以及白光三维扫描等医工结合高新技术的配合运用之下，解决了钱小姐的人生厄运，为她开启了美好的全新人生篇章。钱小姐治疗过程中广州市第一人民医院进行了临床决策和手术具体实施。国家人体组织功能重建工程技术研究中心辅助完成了手术导板、个性化外固定支架和钙磷基植入体3D打印。华南理工大学医学院解剖教研室虚拟解剖应用研究团队辅助进行了手术虚拟仿真，完善和优化了手术方案。诺曼数字医疗科技有限公司辅助完成了手术三维设计、手术导板三维设计和医学3D模型平面三维渲染显示。广州联睿智能科技有限公司采用XR技术进行了患者畸形状态、手术方案、手术效果预测等3D显示，辅助医患沟通、病例讨论和术前讨论过程。先临三维科技股份有限公司辅助进行了术前、术中、术后下肢外观白光三维扫描，术前白光扫描了解下肢畸形状态，术中白光扫描引导手术导板精准安放，术后白光扫描评估患者下肢畸形矫正情况和引导矫形过程。治疗经过病例简介：21岁女性。因双下肢畸形、跛行步态7年余就诊。体查：患者身高148cm，双下肢严重畸形，左侧明显（图1）。右膝关节屈曲挛缩，右膝活动度120°-25°-0°。2019年10月行左股骨、胫骨截骨矫形+术后缓慢撑开延长术（图2）。2020年11月23日行右股骨、胫骨微创截骨三维精准矫形+外固定术（图3）。术后1年余左股骨、胫骨正侧位片显示左股骨延长区域愈合、胫骨延长区域有明显骨痂生长（图4），左下肢延长12cm，遗留左小腿外旋畸形，（图5），采用3D打印个性化外固定支架非手术矫正（图6）。新兴科技助力诊疗，术前精准定量诊断树蚁智能数字精准外科云服务系统团队在获得患者CT数据之后即刻进行了三维重建（图7），借助3D虚拟模型，更细致了解患肢在三维层面的畸形程度。同时对下肢的解剖参数精确测量，建立了以下三维数字化定量精准诊断：1.右下肢严重畸形：①双股骨前倾角增大1.7144°②右股骨远端关节面后倾32.2495°③右股骨远端内翻股骨角88.3453°④右胫骨远端外翻，胫骨角92.1646°⑤右胫骨扭转角减少-3.6716°⑥右下肢短缩畸形。2.左下肢矫形术后明确患情后丁焕文教授带领广州市第一人民医院临床研究团队制定了以下治疗计划：1.右股骨、胫骨微创截骨三维精准矫形外固定+术后缓慢撑开延长术2.左小腿个性化外固定架更换遗留外“八”字畸形矫正术手术三维设计和虚拟仿真优化手术方案为更好的解决钱小姐右下肢畸形、短缩问题，丁焕文教授带领树蚁智能数字精准外科研究团队开始紧锣密鼓的进行手术三维规划，由于右下肢存在不同程度的短缩、外翻畸形和股骨远端关节面后倾造成膝关节不能伸直等问题，丁焕文教授团队在左下肢矫正基础上再次对右下肢进行个性化手术三维设计，依次从右股骨头对齐、确定右股骨髁上截骨位置,将股骨进行矫形（图8-9），包括恢复了股骨远端的前倾角和后倾角，同时对远端内翻畸形等进行进行全方位精准矫正。完成右股骨矫形之后，进一步对右胫骨进行三维精准截骨矫形设计，包括截骨位置的选择，矫正恢复下肢力线（图10），再利用CAD软件进行外固定架置钉与截骨导板的设计与3D打印制作（图11）。最后华南理工大学医学院虚拟解剖应用研究团队进行了双下肢畸形三维精准矫形手术虚拟仿真，优化和完善了手术方案。VR科技术前引热议所有术前准备妥当之后在手术当日交班现场，丁焕文教授还拿出了一项吸引眼球的新兴科技，那就是虚拟仿真技术，丁焕文教授与树蚁精准外科云辅助系统、广州联睿智能科技有限公司联合攻关建立了医学3D模型XR显示系统，一排VR眼镜摆在交班室的会议桌上，各位医生护士争相观看，在该系统辅助下VR远程显示病变状态、手术方案和手术效果等。在VR眼镜系统里镶嵌了钱小姐完整的手术设计过程，借助VR眼镜进行了一次完美的术前讨论。（图12）白光扫描术中放异彩术中为了将设计的置钉定位导板安装妥帖，丁教授使用先临三维白光三维扫描技术——EinScan Pro 2X Plus多功能手持三维扫描仪对患者腿部进行扫描（图13），EinScan Pro 2X Plus采用非接触式白光扫描技术，扫描幅面大，细节精度高，因此可以无创、快速高效的获取患者腿部表面高精数据（图14），形成相应的文件。然后利用3D数据在电脑上进行畸形状态评估、术中辅助手术导板快速匹配和精准安放，评估术后畸形矫形手术效果和引导术后矫形过程。术中AR配准引导手术导板精准定位为了进一步验证术中导板与体表的贴合位置，丁焕文教授术中放置手术导板后将正侧位外观照片网上传送给华南理工大学自动化学院李彬教授实验室，进行手术导板术中AR即时配准（图15），通过这种跨越空间的远程交流，进一步体现了创新科技的优越性，进行了远程医疗创新形式的探索，也成功让手术导板能够更准确的贴合患肢，提高了外固定置钉精准度，防止截骨位置发生偏差。个性化手术导板引导完成微创截骨与三维精准矫形手术在王迎军院士领衔的国家人体组织重建工程技术研究中心赵娜如教授、刁静静博士等辅助下，完成了个性化磷酸钙可再生修复体、手术导板和个性化外固定架的CAD设计和3D打印。借助这一系列新兴科技手段，钱小姐的手术按时顺利完成，导板引导外固定螺针（图16）准确打入股骨与胫骨，截骨位置选择十分准确，通过短于2cm的小切口完成微创截骨，安装外固定架后完成矫形。遗留部分畸形采用个性化外固定架非手术矫正（图17）。术后三维评估针对左下肢术后残留的外”八“字畸形和轻微小腿向内成角畸形（图18），CAD设计和3D打印个性化外固定进行非手术矫正，使患者避免了再次手术（图19）。就这样一台复杂疑难下肢畸形矫正手术得以精准、安全和轻松解决。外固定架矫形成功，下肢延长未来可期在手术完成的第二天钱小姐精神状态良好，还在麻醉中的双下肢也没有丝毫不适。进行术后的X线片与CT扫面以及三维重建评估，都提示下肢矫形效果很好。为了下肢功能更好康复，指导、鼓励其积极进行床边、床旁运动。身高148cm的患者术后摇身一变成为160cm的窈窕淑女。术后三维评估患者双下肢解剖参数完全恢复（图20）。END文章源自于广州市第一人民医院 丁焕文教授团队