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新技术有助于开发更好的药物2013年07月06日 来源: 中国科技网 作者: 陈丹 科技日报讯 据物理学家组织网7月5日(北京时间)报道,瑞典卡罗林斯卡医学院的研究人员开发出一种方法,首次能够直接测量药物抵达其位于细胞中的目标蛋白的效果。《科学》杂志上描述的这项新技术,对于开发新的、改良型的原料药将是一个重大贡献。 大多数药物都是通过与一种或多种蛋白质结合并影响其功能来发挥效力的,但药物开发也因此面临两个常见问题:认定正确的目标蛋白,并设计能够有效地找出和绑定它们的药物分子。此前没有任何一种手段可用于直接测量药物分子定位和绑定其靶蛋白的效率,这使得药物开发过程的很多阶段都存在一定程度的不确定性。在某些情况下,候选药物在人体临床试验中没有达到预期效果,经证实正是由于药物分子没有与正确的蛋白质结合造成的。 而卡罗林斯卡医学院研究人员利用靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定的观念,开发出了这个被称为CETSA(细胞热转移分析)的新技术。他们认为,这项技术可作为药物开发过程中一个重要的控制阶段,也可作为对其他方法的一个补充。“我们已经证明,该方法适用于多种靶蛋白,使我们能够直接测量药物分子是否抵达了其位于细胞或动物模型中的目标。”该医学院医学生物化学与生物物理学系首席研究员帕尔·诺德隆德说,“我们相信,CETSA技术最终将帮助提高许多药物的效率,并有助于开发更好的药物分子和更有效的治疗方案。” 研究人员还对可能导致细胞耐药性的工序进行了仔细检查,并表示,这一技术能够确定现有药物是否适合个别患者,因此其具有应用于个性化治疗的潜在价值。 “我们认为,该方法可以为癌症治疗提供一个重要的诊断工具,比如,从原则上来说,CETSA技术让我们能够确定哪种药物针对肿瘤中的蛋白质最有效,临床医生也可以在早期治疗阶段确定肿瘤是否已经具备了某种抵抗力、哪种治疗方案对病人更合适。”诺德隆德的同事丹尼尔·马丁内兹·莫利纳说,他带领的团队正在开展一个旨在将CETSA技术用于病患研究的项目。(记者陈丹) 总编辑圈点 体温可以测量,骨密度可以测量,就连药物绑定靶蛋白的效果也可以直接测量,让人不得不慨叹医学技术发展的速度之快。文中提到的细胞热转移分析技术,就好比狙击手的瞄准镜,能帮助狙击手调整位置以便更准确地击中目标。这样一来,不仅可以更好地提高药效,还尽可能地减少副作用,其实际应用价值非同一般。那种“杀敌一千,自损八百”的诊疗方法或将成为过去,那些原本被认为的绝症或将“绝”处逢生。 《科技日报》(2013-07-06 一版)
[font='times new roman'][size=14px]药物靶蛋白鉴定方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]非蛋白质组学鉴定方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]非蛋白质组学的传统药物靶蛋白鉴定方法,如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的迁徙分析等方法,通常耗时、耗力且不适合进行高流通量的筛选。目前,所使用的技术包括:第一,蛋白鉴定的图象分析,利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量,未被修饰的小蛋白错误率大约[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]30%[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],而翻译后修饰蛋白错误率更高,故需联合其他技术完成鉴定;第二,微量测序,首先使经凝胶分离的蛋白直接印迹在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]PVDF [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]膜,经过一系列操作后将其置于测序仪中进行蛋白质鉴定,但该方法仍然存在一些缺点,如由于酸性水解或者部分降解而产生氨基酸的变异,故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]化学蛋白质组学方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]化学蛋白质组学方法一般先将小分子化合物通过与蛋白质溶液反应,使化学探针或小分子化合物与固相联接,得到被修饰的固相微球,然后利用合适的分离技术将这些蛋白质纯化,结合[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]分析,得到靶蛋白的信息。[/size][/font][font='宋体']亲和色谱法[/font][font='times new roman'][size=14px]亲和色谱法是化学蛋白质组学策略中较为经典的方法之一,它主要应用于研究蛋[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]白质与生物活性小分子或蛋白质与蛋白质的相互作用[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px][17][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]。该方法通过官能团将配体结合在固相基质中,然后与蛋白质孵育,此时与配体结合的蛋白会留在基质上,最后通[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]过变性或与自由配体竞争将结合蛋白洗脱下来,再通过凝胶电泳或者[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]进行分[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]析。该方法的缺陷在于所研究分子衍生物活性不确定、材料配体结合力差异性以及非特异性吸附都将会干扰研究结果。[/size][/font][font='宋体']基于活性的化学蛋白质组学技术[/font][font='times new roman'][size=14px]基于活性的化学蛋白质组学技术([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])是广泛使用的技术之一。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]是由美国的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Cravatt[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]课题组在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]2002 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]年首次提出,最早用于酶谱分析,之后被应用于药物靶蛋白筛选。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]技术的关键是合成同时带有反应基团和标记物的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]探针,可进一步与待测的蛋白质发生相互反应。药物靶点筛选领域设计的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]探针通常包括三[/size][/font][align=center][font='times new roman'][size=14px]3[/size][/font][/align][align=center][/align][font='times new roman'][size=14px]个功能部分:反应基团、连接基团和报告基团。与二维凝胶电泳法([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]2-DE[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])、同位素编码亲和标签([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ICAT[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])等技术相比,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]技术着重研究蛋白质的表达和功能,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]可从天然蛋白质组样品中直接筛选出与小分子特异性结合的蛋白质,从而能更直接快速地明确小分子和蛋白质之间的相互作用,确定小分子的作用靶点,这对于筛选具有低亲和力的靶蛋白极为有利。另外,根据富集和鉴定策略的不同,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]技术可分为竞争性标记方法和生物正交的探针模拟物标记方法。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]1.%2.%3 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]非化学修饰的蛋白质组学方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]1.1.%3.%4 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]细胞热位移测定[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]在过去[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]20 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]年中,热位移分析([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])已成为最广泛使用的无修饰药物靶点发现方法之一。这种方法简单直接,但探针无法区分不同的蛋白质,因此[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TSA [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]仅适用于纯化蛋白质的实验。为了规避这个问题,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Molina [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]等人开发了一种概念上相似的技术,称为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]细胞热位移测定[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]C[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],用于直接研究细胞环境中的药物[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]靶标相互作用。如图[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]A[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])所示,细胞裂解物或完整细胞的多个等分试样首先用药物或载体处理,加热到不同的温度并冷却,然后通过离心分离出可溶性部分。随着温度的升高,蛋白质逐渐展开以暴露疏水核,导致蛋白质在高温下沉淀。蛋白质越稳定,蛋白质对热诱导沉淀的抵抗力越高,因此,可以测定可溶性蛋白质随温度变化的稳定性曲线。例如,该[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/antifolate][font='times new roman'][size=14px]方法通过叶酸[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]抗癌药物[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/methotrexate][font='times new roman'][size=14px]甲氨蝶呤[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]与[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/dihydrofolates][font='times new roman'][size=14px]二氢叶酸[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]还原酶的结合、雷替曲塞与胸苷酸合成酶的结合进行了药物靶标的验证。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]CETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]是一种允许研究活细胞中药物靶点的方法。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]CETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]结合小分子库可用于筛选潜在抑制剂、评估靶标参与效率和监测靶标特异性。此外,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]CETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]还可用于筛选[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]新药和表型化合物的靶点,解决脱靶蛋白、结合机制、药物疗效和完整细胞耐药性等[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]问题。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]1.2.%3.%4 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]热蛋白组学分析[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]热蛋白组学分析([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TPP[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])首先将蛋白在有或无活性小分子情况下孵育,并加热到不同的温度以诱导蛋白变性,剩余的可溶性蛋白用缓冲液提取。如图所示,在每个温度下,可溶性蛋白通过高分辨质谱进行量化,画出变性曲线,进一步测[/size][/font][align=center][font='times new roman'][size=14px]4[/size][/font][/align][align=center][/align][font='times new roman'][size=14px]定热稳定性和识别配体引起的变化。其中,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]50% [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]蛋白发生聚沉时的温度为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Tm[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]melting temp[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]e[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]r[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]a[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]tur[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]e[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],通过对比加药前后[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]T[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]m[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的变化,确定活性分子的靶蛋白。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TPP[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]可以[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]通过定量[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MS [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]分析,在蛋白质组水平评估活细胞中活性分子与蛋白结合的情况。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]图[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]A[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]细胞热位移测定和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]B[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]热蛋白组学分析简要工作流程[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][14][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]药物亲和反应的靶点稳定性技术[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]药物亲和反应的靶点稳定性技术([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]DARTS[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])是一种鉴定药物靶标的新方法。药物[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]与靶蛋白结合后,靶蛋白对蛋白酶的敏感性降低,与对照组相比,药物结合蛋白更不[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/protein-hydrolysis][font='times new roman'][size=14px]易水解[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]。这种差异可通过蛋白凝胶电泳和质谱等技术对差异蛋白进行鉴定,可以确定[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]药物直接作用的靶点蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],最大优势是不需要对药物进行任何化学修饰,即可以确定药物的直接结合蛋白。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]DARTS[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]在天然小分子靶点的鉴定中发挥了重要的作用,例如[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]对[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ecumicin[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、白藜芦醇[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]resveratrol [/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]等多种天然产物蛋白靶点的鉴定[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]。但[/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]DARTS[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]也存在局限性,例如细胞裂解液中的低丰度蛋白的鉴定和非特异性结合会导致[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]蛋白对蛋白酶的敏感性升高增加。利用这一特性,研究者还开发了药物亲和力响应靶稳定性的方法用于药物靶点筛选。[/size][/font]
药物和蛋白的结合过程是可逆的还是不可逆的呢?