微生物实验室冷冻干燥的原理与过程及操作步骤！ 冷冻真空干燥（以下简称冻干）是一个稳定化的物质干燥过程。是将含水的物质，先冻结成固态，而后使其中的水分从固态直接升华变成气态排除，以除去水分而保存物质的方法。溶液状态的产品经冷冻处理后，先后经过升华和解吸作用，使产品中的溶剂减少到一定程度，从而阻止微生物的生成或溶质与溶剂间的化学反应，使产品得以长时间保存并保持原有的性质。 真空冷冻干燥法是液态→固态→气态的过程。在冻干过程中，溶质颗粒之间的“液态桥”已被冻成“固态桥”，两颗粒间的相对位置已经被固定下来，并且两颗粒之间不存在气液界面的表面张力。随着溶剂的不断升华，“固桥”不断减少，但两颗粒之间的相对位置已不再发生变化，直至“固态桥”完全消失。 水和溶液的性质 水有三态，固态、液态、气态。三种状态可以相互转化。对应 0 ℃ 、 610Pa 以下所有过程，只要符合一定的条件都可成为升华过程 。物质有固、液、汽三态。物质的状态与其温度和压力有关。水 (H2O ）的状态。三条曲线分别表示冰和水、水和水蒸汽、冰和水蒸汽两相共存时其压力和温度之间的关系。分别称为溶化线、沸腾线、升华线。此三条曲线分成 I 、 II 、 III 三个区域，分别称为固相区、液相区和气相区。箭头 1 、 2 、 3 分别表示冰溶化成水，水汽化成水蒸汽和冰升华成水蒸汽的过程。曲线 OB 的顶端有一点 K ，其温度为 374 ℃ ，称为临界点。若水蒸汽的温度高于其临界温度 374 ℃ 时，无论怎样加大压力，水蒸汽也不能变成水。三曲线的交点 为固、液、 汽三相共存的状态，称为三相点，其温度为 0.01 ℃ ，压力为 610Pa 。在三相点以下，不存在液相。若将冰面的压力保持低于 610Pa ，且给冰加热，冰就会不经液相直接变成气相，这一过程称为升华。 溶液的冷冻干燥过程 冻干溶液一般都是配置成含固体物质4%-25%的稀溶液。溶液里水的组成： 1、大部分水是以水分子的形式存在于溶液中的自由水。 2、少部分是吸附于固体物质晶格间隙中或以氢键方式结合在一些极性基因团上的结合水。 3、固定于生物体和细胞中的水，大部分也是可以冻结和升华的自由水。也含有一些不能冻结、很难去除的结合水。 冻干的目的就是在低温、真空环境中除去物质中的自由水和一部分吸附于固体晶格间隙中的吸附水。 冻干过程及操作步骤 预冻结：预冻是将溶液中的自由水固化，赋予干后产品与干燥前有相同的形态，防止抽空干燥时起泡、浓缩、收缩和溶质移动等不可逆变化发生。 溶液在冻结过程中，需过冷到冰点以下，其内产生晶核以后，自由水才开始以纯冰的形式结晶，同时放出结晶热，使其温度上升到冰点，随着晶体的生长，溶液浓度增加，当浓度到达共晶浓度，温度下降到共晶点以下时，溶液就全部冻结。 冷却速度愈快，过冷温度越低，所形成的晶核数量越多，晶体来不及生长就被冻结，形成的晶粒数量越多，晶粒也细。冷却速度慢，形成的晶粒数量越少，晶粒也粗大。冻干制品升华前，必须冻结到一定的温度，这个温度应设在制品的共熔点以下10至20℃左右，如不经过预冻直接抽真空，当压力降到一定程度时，液体就会被抽去。这种情况也叫蒸发，这种蒸汽叫做不饱和蒸汽，如果制品冻结不实而抽真空，液体中的气体迅速逸出而引起“沸腾”的现象。制品如在“沸腾”中冻结，有部分可能逸出瓶外，引起药物损失或使制品表面凹凸不平。由此可见，共熔点的温度是保证产品正常干燥的最安全的温度，只能比它低，不能高于共溶点温度。 升华干燥（一次干燥） 将冻结后的产品置于一闭的真空容器中加热，其冰晶就会升华成水蒸气逸出而使产品脱水干燥。干燥是从外表面开始逐步向内推移的，冰晶升华后残留的空隙变成尔后升华水蒸气的逸出通道。升华所需的热量由以下几种途径得到：固体的传导，辐射，气体的对流。 产品升华时受以下几个温度限制：产品冻结部分的温度应低于产品共溶点的温度。产品干燥部分的温度要低于其崩解温度或容许的最高温度（不烧焦或性变）。最高搁板温度。 解析干燥（二次干燥） 第一阶段干燥是将水以冰晶的形式除去，因此其温度和压力都必须控制在产品共溶点以下，才不使冰晶溶化。对于吸附水，由于其吸附能量高，如果不提供足够的能量，水就不可能从吸附中解析出来。为了使解析出来的水蒸气有足够的推动力逸出产品，必须使产品内外形成较大的蒸汽压差，所以箱体内要保持高真空。第二阶段干燥后，产品残余水分的含量一般可以控制在0.4%-4%之间。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有Biolog微生物鉴定系统，超低温冰箱，生物安全柜等仪器设备可进行对微生物分离、鉴定等常规的分子实验研究。对我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展的需求进行积极的面对社会乃至国外收集保藏提供微生物菌种资源。在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供微生物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。 除此之外，我们还拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                   小鼠心脏微血管周细胞的分离方法与质量检测！ 一、产品信息平台编号：Bio-132624 规格：5×10⁵Cells/T25培养瓶细胞信息：原代细胞 细胞名称：小鼠心脏微血管周细胞组织来源：心脏组织用途：研究产品规格：5×105cells/T25细胞培养瓶注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、细胞简介小鼠心脏微血管周细胞分离自心脏组织；心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官，主要功能是为血液流动提供压力，把血液运行至身体各个部分。心脏由心肌构成，左心房、左心室、右心房、右心室四个腔组成。左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开，故互不相通，心房与心室之间有瓣膜（房室瓣），这些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心脏的作用是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。心脏微血管内皮细胞是组成心脏微血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力、调节血压、抗血栓形成等有重要作用，在心脏血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。近年来大量研究表明，心肌微血管周细胞的功能和病理改变直接影响心肌细胞功能，也是诸多毒素、炎症因子及病毒等重要靶位，其作为体外研究的细胞模型在心肌缺血-再灌注发病机制和细胞间旁分泌细胞生长因子研究中起着重要作用。 三、方法简介小鼠心脏微血管周细胞采用胶原酶消化法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。 四、质量检测小鼠心脏微血管周细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 五、培养信息包被条件 PLL（0.1mg/ml） 培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等 换液频率 每2-3天换液一次 生长特性 贴壁 细胞形态 成纤维细胞样 传代特性 可传1-3代左右 消化液 0.25%胰蛋白酶 培养条件 气相：空气，95%；CO2，5% 小鼠心脏微血管周细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                    嗜酸乳杆菌：益生菌类保健食品的生产和研究 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中，释放乳酸，乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，但是抑菌作用比较弱。嗜酸乳杆菌不仅在胃中，它还是人体小肠内的主要益生菌。 一、菌种简介平台编号：Bio-67162 提供形式：冻干物拉丁属名：Lactobacillus Acidophilus 中文名称：嗜酸乳杆菌属名：Lactobacillus种名加词：acidophilus其它中心编号：=JCM 11047来源历史：←JCM←T．Itoh LA67收藏时间：2007.01.00资源归类编码：15131319101模式菌株：非模式菌株主要用途：研究；生产具体用途：用于益生菌类保健食品的生产。生物危害程度：四类致病对象：无分离基物：人的排泄物培养基：酪蛋白胨(胰酶消化) 10g，肉汤提取物 10g，酵母粉 5g，葡萄糖 20g，吐温80 1g，K2HPO4 2g，醋酸钠 5g，柠檬酸二铵 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，pH6.2～6.5。培养温度：37℃资源保藏类型：培养物保存方法：-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法实物状态：有实物共享方式：公益性共享；资源纯交易性共享；合作研究共享；资源交换性共享用途：研究；生产；用于益生菌类保健食品的生产。 注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、培养基MRS 培养基酪蛋白胨 10 克 牛肉浸取物 10 克酵母提取液 5.0 克 葡萄糖 20 克乙酸钠 5.0 克 柠檬酸二胺 2.0 克吐温 80 1.0 克 磷酸氢二钾 2.0 克七水硫酸镁 0.2 克 七水硫酸锰 0.05 克碳酸钙 20.0 克 琼脂 20.0 克蒸馏水 1.0 升 PH 6.8如果要配制液体培养基，则不用加入碳酸钙和琼脂 三、培养方法1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。 四、实验内容1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、保藏条件斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。西林瓶菌种请置于-20℃冷冻。  六、注意事项1）乳酸菌需要在比较厌氧的环境下培养首次活化，干粉要全部用完，不能保留，干粉用尽量少的腹水液溶解，接种在 5ml 的液体培养基中，静止培养；因冻干菌种处于休眠状态，请勿接种多支液体培养基，以免因接种量不足而导致复苏不成功。如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；二次接种量要多，固体斜面培养基水分要少才能让菌体长得比较明显，液体培养要静止培养；2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。 七、单层冻干管打管说明书1、安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。2、注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在 4-10℃的环境下，某些菌种经过冷冻干燥并抽真空保存的，开启后必须一次使用完，不能留菌粉下次使用；另外，安瓿管里大部分是用牛奶作为保护剂，里面菌体为少数，复苏时要全部菌悬液接在新鲜培养基上，否则可能造成复苏不成功；3、冻干菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，有时延滞期较长，如在说明书建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成；有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种稳定后才能用于您的后续实验。4、暂不启开的安瓿管应于 4℃中保藏（特殊除外）。5、冻干管打开后需一次用完，不能留存。6、打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                    小鼠结肠癌细胞的背景与应用及培养操作规程！ 一、背景 小鼠结肠癌细胞是一种常用于结肠癌研究的实验模型。这些细胞来源于小鼠的结肠癌组织，具有肿瘤细胞的特性，如快速增殖、侵袭和转移等。 小鼠结肠癌细胞可以用于研究结肠癌的发生、发展机制，以及探索新的治疗手段。通过研究这些细胞在体外和体内的行为，可以帮助科学家们更好地理解结肠癌的生物学特征，以及开发更有效的治疗策略。 此外，小鼠结肠癌细胞系也常被用于制作肿瘤模型，以模拟人类结肠癌的生长和转移。这些模型对于研究肿瘤的生物学、测试药物疗效以及研究肿瘤与宿主之间的相互作用都具有重要的意义。 二、小鼠结肠癌细胞培养步骤 1、小鼠结肠癌细胞培养基及培养冻存条件准备： 1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。 2）小鼠结肠癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。 3）小鼠结肠癌细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。 2、小鼠结肠癌细胞处理： 1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2）小鼠结肠癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 对于贴壁细胞，传代可参考以下方法： 1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。 2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。 4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 3）小鼠结肠癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。 三、应用 小鼠结肠癌细胞可以用于胡桃醌对小鼠结肠癌CT-26体内抑制作用及机制研究： 研究胡桃醌对结肠癌CT-26细胞在小鼠体内增殖、凋亡及转移的影响,以及胡桃醌促进CT-26肿瘤细胞凋亡和抑制其转移的相关可能作用机制。同时,探究了胡桃醌治疗结肠癌期间对荷瘤小鼠的机体免疫功能的影响。 选取健康的Balb/c小鼠皮下荷瘤,随机分为6组,分别为模型组(2%乙醇生理盐水溶液)、阳性对照组(20mg/kg 5-FU)、胡桃醌高剂量组(2.5mg/kg)、胡桃醌中剂量组(1.25mg/kg)、胡桃醌低剂量组(0.625mg/kg)、联合用药组(胡桃醌2.5mg/kg+5-FU20mg/kg),按体重每日腹腔注射给药一次,连续给药10天。末次给药结束24h后,称重记录并准备收集血液、胸腺、脾脏、肿瘤组织样本。血液静置离心分离得血清,应用Elisa方法检测ICAM-1、VEGF、GSH、IL-8在小鼠血清中的含量;胸腺和脾脏称重计算胸腺指数与脾脏指数;肿瘤组织测量长径与短径计算瘤体积,称重记录瘤重;将肿瘤组织切割为两部分,一部分置于生理盐水用于流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡,另一部分固定于4%甲醛溶液,用于HE染色病理观察以及免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、β-链蛋白的表达水平。 实验结果表明,胡桃醌高剂量2.5mg/kg和中剂量1.25mg/kg均可有效抑制结肠癌CT-26细胞在小鼠体内的生长,抑瘤率分别为46.2%和42.4%;胡桃醌与5-FU联合应用抑瘤率为74.8%,比胡桃醌与5-FU单独应用的抑瘤效果好;5-FU治疗肿瘤时,小鼠的胸腺指数、脾脏指数、体重与模型组相比均显著性下降,而胡桃醌治疗后,小鼠的胸腺指数、脾脏指数、体重均无显著性下降,胡桃醌可使CT-26肿瘤细胞阻滞于G2/M期,并下调肿瘤细胞中Bcl-2蛋白、β-链蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达,上调Bax与Caspase-3蛋白表达;胡桃醌高剂量2.5mg/kg可显著降低荷瘤小鼠血清中ICAM-1、VEGF和GSH的含量。 根据结果可知胡桃醌在抗肿瘤过程中,与5-FU相比可维持机体的体重和免疫功能;胡桃醌的抗肿瘤作用机制可能是阻滞CT-26肿瘤细胞周期于G2/M期影响其增殖,介导线粒体依赖的Caspase-3凋亡途径促进肿瘤细胞凋亡,下调血管生成因子、β-链蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白的表达抑制肿瘤细胞浸润与转移。本研究为胡桃醌成为可能的抗结肠癌药物提供新的理论和实验依据。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                 小鼠原代视网膜色素上皮细胞的运输和保存及使用！ 一、细胞简介平台编号：Bio-137129 规格：5×10⁵Cells/T25培养瓶 产品信息：原代细胞细胞信息：小鼠原代视网膜色素上皮细胞 用途：研究注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、细胞详述视网膜色素上皮位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道。视网膜色素上皮参与视黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。 三、细胞特性1)组织来源于实验动物的正常眼组织。2)细胞鉴定：细胞角蛋白-8(CK-8)免疫荧光染色为阳性。3)经鉴定细胞纯度高于90%。4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。 四、产品的运输和保存视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。 五、产品使用1)本产品仅能用于科研2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核3)本产品未通过用于活体诊断的审核 六、细胞培养1、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。2、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。3、冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 七、原代细胞分离凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。1、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。2、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                  小鼠肺微血管周细胞的培养操作及应用研究！  一、背景 小鼠肺微血管周细胞是一种在肺部微血管周围分布的细胞，也称为肺微血管平滑肌细胞。它们的主要功能是调节肺部微血管的张力和通透性，以维持正常的肺功能。 肺微血管周细胞是一种围绕在肺微血管内皮细胞周围的细胞，具有收缩功能。这种细胞嵌入毛细血管内皮细胞的基膜中，通过物理接触和旁分泌信号与内皮细胞进行细胞通讯，监视和稳定内皮细胞的成熟过程。在中枢神经系统中，周细胞包围着内皮细胞。 肺微血管周细胞在肺部疾病中也扮演着重要的角色。例如，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中，肺微血管周细胞会发生增殖和迁移，导致肺部微血管收缩和通透性增加，从而加重疾病的进展。 此外，肺微血管周细胞还参与了肺部炎症和免疫反应的调节。它们可以释放多种细胞因子和趋化因子，吸引和激活其他免疫细胞，参与炎症反应的发生和发展。 二、小鼠肺微血管周细胞培养操作 1)复苏小鼠肺微血管周细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。 将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2)小鼠肺微血管周细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。 b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。 d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。 3)小鼠肺微血管周细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。 下面T25瓶为例； a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。 b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。 c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。 三、应用 小鼠肺微血管周细胞可以用于周细胞凋亡在肝肺综合征肺微血管扩张中的作用研究： 通过培养肺周细胞，观察CBDL大鼠血清对肺周细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡和caspase-3表达的影响；观察CBDL大鼠肺细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡、caspase-3表达情况和周细胞的主要标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、神经元胶质抗原2(neuron-glial antigen2,NG2)、desmin的蛋白水平及其阳性细胞率的变化；抑制caspase-3后检测肺细胞凋亡，α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化，以及肺微血管扩张和血氧交换情况，证明如下假设：CBDL产生的血清因子变化，通过血液循环作用于肺微血管，致caspase-3激活，肺周细胞凋亡，进而引起肺微血管扩张、血氧交换异常和低氧血症，最终揭示肺周细胞凋亡在HPS实验模型肺微血管扩张中的重要作用。 方法： 1、CBDL大鼠血清对肺周细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡的作用研究1.1肺周细胞的培养和鉴定。1.2采用CBDL法构建HPS大鼠模型，收集CBDL1wk血清。1.3CBDL大鼠血清培养肺周细胞后，分别用TUNEL和western blot检测其凋亡和caspase-3表达情况。 2、CBDL大鼠中肺周细胞的变化研究2.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型。2.2分别用TUNEL和western blot检测CBDL大鼠肺细胞的凋亡和caspase-3的表达。2.3分别用western blot和免疫组化法检测CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。 3、抑制caspase-3对CBDL大鼠肺周细胞的影响及HPS的作用研究3.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型，手术后第一天起每天给模型大鼠腹腔注射caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK，连续2wk。3.2用TUNEL法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺细胞的凋亡情况。3.3分别用western blot和免疫组化法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。3.4分别用血气分析和HE染色法观察抑制caspase-3后CBDL大鼠血氧交换和肺微血管扩张情况。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

              人原代膀胱癌相关成纤维细胞的处理方法与培养步骤！ 一、细胞简介平台编号：Bio-135574 产品信息：原代细胞规格：5×10⁵Cells/T25培养瓶 细胞名称：人原代膀胱癌相关成纤维细胞用途：原代细胞 注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、细胞详述膀胱癌是一种泌尿生殖系统肿瘤，发病率和死亡率较高，膀胱癌分为非肌浸润性膀胱癌与肌肉浸润性膀胱癌。肿瘤微环境理论认为，肿瘤微环境与细胞外基质是肿瘤对化疗反应的重要决定因素。肿瘤微环境包括免疫和非免疫细胞，以及细胞外成分，在肿瘤复发和转移中起着重要的作用。其中，非免疫细胞主要由肿瘤相关成纤维细胞构成。成纤维细胞是实体瘤中最主要的细胞，它们结合结缔组织的细胞外基质，是组织结构完整性的基础。已有研究表明，肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤演进的重要促进剂，它们可通过分泌一种或多种可溶性因子如细胞因子、生长因子、趋化因子和基质降解酶等，肿瘤细胞响应这些可溶性因子作用，进而改变肿瘤细胞的生长方式机器发展演进过程。 三、细胞特性1)细胞来源于手术切除的膀胱癌组织。2)细胞鉴定：纤维连接蛋白（Fibronectin）或波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色为阳性。3)经鉴定细胞纯度高于90%。4)不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。5)细胞生长方式：成纤维样细胞，贴壁培养。 四、产品的运输和保存视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。 五、产品使用1)本产品仅能用于科研2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核3)本产品未通过用于活体诊断的审核 六、细胞收到后处理方法细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置2-4小时。镜下观察：未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入6ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；超过80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松） 七、细胞培养步骤1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO 对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。PS：若客户收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过80%，可直接进行传代（方法同上）。 下面T25瓶为例；1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。 八、注意事项1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。2、收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于7天。4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。5、客户在细胞培养过程中，有任何技术问题可以拨打技术售后服务电话，我们随时给予解答。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                  KACC 11589 土壤伯克氏菌的菌株培养及打管说明！ 一、菌种简介平台编号：Bio-52842 规格：冻干物拉丁属名：Burkholderia Soli 菌株名称：土壤伯克氏菌其他编号：KACC11589、DSMZ18235培养基编号：33,88培养温度：30-37℃用途：研究注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、菌种的培养1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。 三、实验内容1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 四、使用范围（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。 （2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。 （3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。 五、培养及打管说明1、安瓿瓶开封：用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。2、菌株恢复培养：用无菌吸管吸取0.3--0.5ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，移植于1-2支建议的培养基试管中，并在建议的条件下培养。3、注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在6-10℃的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需要连续两次继代培养才能正常生长4、复苏后的菌种在传1-2代后使用。5、暂不启开的安瓿及复苏后需保藏的斜面应于4℃中保藏。 六、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、菌种恢复培养前，建议将收到的菌种安瓿保存在 6-10°C 的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，如在说明建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成，有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种培养稳定后才能用于您的后续实验。3、初次使用时请严格按照本说明书推荐条件和操作步骤进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、恢复培养厌氧菌时，在操作过程中应严格控制厌氧条件：制作培养基时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养基中的氧气，使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站(www.biobw.org）。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                     鼠伤寒沙门氏菌（带红色荧光）百欧博伟生物 鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）属多价O抗血清的B群，也是一种临床较常见的沙门菌。鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患病原菌，其感染发病率居沙门菌感染的首位，约占人源沙门菌感染的40%～80%。多见于婴幼儿，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高。 一、产品信息平台编号：Bio-108998 规格：2ml甘油管 基因型：未知，请查阅相关文献菌株名称：鼠伤寒沙门氏菌SL1344-mCherry抗性：卡那培养基：LB 菌株类别：鼠伤寒沙门氏菌培养条件：30℃，有氧，LB保存方式：20%甘油，-20℃可冻存1年，1年后取出重新活化保种注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、菌株简介 鼠伤寒沙门氏菌SL1344-mCherry应带有质粒使其对Kan产生抗性，因此，在活化培养过程中应加入抗性防止染菌和因传代造成的质粒丢失（通常情况下不加抗性质粒也不容易丢失），在进行菌株荧光验证时，挑取单菌落至10mL LB培养基中，置于30℃，200rpm培养24小时（无需诱导），可见菌液变色，离心后肉眼可见。 三、形态与染色革兰阴性细长杆菌  四、生化特征发酵葡萄糖，不发酵乳糖，TSI为K/A,动力阳性，H2S试验强阳性，脲酶试验阴性。 五、病理病因鼠伤寒沙门菌经胃入肠，在肠道内增殖，粘附于肠黏膜上皮细胞，进而侵入固有层，释放毒素，导致其充血、水肿、点状出血等急性炎症反应。病理特点主要是消化道呈现不同程度的充血、水肿、出血及灶性坏死，甚至形成较为广泛的浅表性溃疡，炎性细胞浸润。 六、治疗及预防鼠伤寒沙门菌感染的患儿一般都需要住院治疗。对胃肠炎型者，液体疗法是治疗的关键，并加强对症支持治疗。对呕吐、腹泻频繁的患儿要给予禁食，及时静脉补液以纠正脱水、酸中毒和电解质紊乱，可试用肠道微生态制剂，调节肠道正常菌群，一般无需抗菌治疗。但对于全身中毒症状较重，有持续高热及粘液血便的患者，可酌情给予抗菌药物。对败血症型及内脏损害型的患者，应在对症治疗的基础上，加强抗感染治疗。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                生物安全柜的操作步骤与使用注意事项及维护与保养！ 生物安全柜是能防止实验操作处理过程中某些含有危险性或未知性生物微粒发生气溶胶散逸的箱型空气净化负压安全装置。是实验室生物安全中一级防护屏障中最基本的安全防护设备。 为规范生物安全柜的操作，本文从人员、使用环境、设备操作流程及注意事项等几个方面进行阐述，使操作人员能够正确使用生物安全柜。 一、使用人员与环境 1、首先，微生物检测人员需进行生物安全柜的使用培训才能进行操作，未经正规培训人员不能使用。 2、其次，使用环境条件建议安置在10,000洁净度以上环境安置，环境在温度0～40℃、相对湿度不超过80％、无腐蚀性气体和通风良好的室内，远离高速尘源和震源。安全柜附近不得有超过安全柜正面吸入风速（>0.5m/s）的气流。禁止在有人员频繁进出的场所、门和通道口处及空调送风口附近安装使用安全柜，以免空气干扰操作口及排气口气流。在安全柜周围应留有保养检修空间（至少应在两侧留出25cm，背面留出30cm）。 二、使用注意事项 1、生物安全柜前窗玻璃手拉式开启，可任意定位，以保证断电时能及时关门防护。正常工作时玻璃门的开启高度到红点标注位置，如果超出或低于高度时，声光报警系统启动，提醒用户玻璃门异常。（注：当玻璃门开启时，紫外灯无法开启。）生物安全柜电源为220V、50Hz，接通电源后，通电进入待命状态。 2、在实验开始前要用70%酒精擦拭生物安全柜内表面，进行消毒除去污染，再用无菌水擦拭一遍清除残余的氯，减少实验时的交叉感染。然后将这次需要用到的所有物品移入生物安全柜内，避免双手频繁的穿过气幕破坏气流，污染样品，导致实验失败等等。 3、打开风机5分钟，等柜内空气净化并且气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操作。 4、安全柜内不放和实验无关的物品，生物安全柜内部物品排放要做到物品取用方便，物品尽量靠后放置，不能挡住气道口，以免干扰气流正常流动。 5、生物安全柜操作期间，严禁使用酒精灯等明火，避免产生的热量产生气流，干扰生物安全柜内的气流稳定。 6、在实验操作时，不可打开玻璃视窗，保证操作者脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作要轻柔、舒缓，防止影响生物安全柜内部气流。 三、操作步骤 1、首次使用按下[紫外灯控制键]，开启紫外灯消毒30分钟后将紫外灯关闭。（注：此时玻璃门应是关闭状态） 2、打开玻璃门到标识处。（小红标） 3、按下[风机启动键]，开启风机约5分钟左右，使操作区达到规定的洁净度。 4、按下[照明控制键]，开启照明灯，操作人员方可进行作业。 5、作业结束关机 当操作人员作业结束后，首先将实验使用的所有材料和其他物品从设备中取出。维持气流循环一段时间，然后关闭前窗玻璃门、风机，打开紫外灯消毒，以杀灭残留在安全柜内部的病菌。 生物安全柜特点：设备采用高效空气过滤装置，通过过滤器过滤及吸附方式将各种颗粒吸附住，其目的是保护操作者、环境和样品。同时由于其集多种专利技术于一体，使用更为安全可靠，细致入微的设计极具人性化。 控制软件系统自主研发，获得国家软件著作权证书，LCD液晶屏显示可显示工作区温度、气流流速、可调节各项参数设定，蓝屏数字指示各项参数示值，密码修改程序设置，防止误操作。 紫外灯预约功能：可预约紫外灯灭菌（a实验后灭菌机器自动关闭，人员无需等待。b人员可预约下次使用时间，下次使用时不需再次灭菌可直接实验） 前窗设计：前窗玻璃手拉式开启，可任意定位，以保证断电时能及时关门防护。 连锁保护设计：对误操作均设置联锁保护，即使误操作，也不会造成伤害； 安全柜风机与玻璃门互锁：当安全柜玻璃门完全关闭时，安全柜风机自动关闭进入待机模式，保护安全柜的使用，增加安全柜的使用寿命； 玻璃门与紫外灯互锁，玻璃门开启状态时无法打开紫外灯，保护人员安全。 四、维护与保养 1、日常维护： 运行安全柜，检查安全柜各部分功能是否正常运行。 用70%酒精擦拭设备表面和操作区表面； 用玻璃专用清洁剂清洁生物安全柜玻璃； 对操作室进行消毒灭菌处理。 2、定期维护： 每三个月对设备进行全面检查一次，认真维护保养。 全面清洗设备，并消毒灭菌； 检查各部件是否启闭灵活，各部分功能是否正常； 3、现场检测： 生物安全柜的现场检测有下列情况之一时，应对生物安全柜进行现场检测； 生物安全柜安装完毕，即将使用前； 生物安全柜被移动位置后； 对生物安全柜检修后； 对生物安全柜更换高效过滤器后； 生物安全柜一年一度的常规检测。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有Biolog微生物鉴定系统，超低温冰箱，生物安全柜等仪器设备可进行对微生物分离、鉴定等常规的分子实验研究。对我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展的需求进行积极的面对社会乃至国外收集保藏提供微生物菌种资源。在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供微生物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。 除此之外，我们还拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                微生态活菌制品的基本要求与生产工艺及制备方法！ 微生态活菌制品系由人体正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌，经培养、收集菌体、干燥成菌粉后，加入适宜辅料混合制成。用于预防和治疗因菌群失调引起的相关症状和疾病。 微生态活菌制品必须由非致病的活菌组成，无论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳定的活菌状态。它可由一株、多株或几种细菌制成单价或多价联合制剂。根据其不同的使用途径和方法可制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂等多种剂型。 一、基本要求 微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证成品含有足够的活菌数量，保持其稳定性，同时应防止外源因子的污染。 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 二、制造 （一）生产用菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规定”的有关规定。 1、名称及来源 选用的生产用菌种应来自人体内正常菌群，或对人体无毒无害、具有促进正常菌群生长和活性作用的外籍细菌。细菌的分离过程和传代背景应清晰，应具备稳定的生物学和遗传学特性，并能保持稳定的活菌状态，经实验室和临床试验证明安全、有效。 2、种子批的建立 菌种的属、种型分类鉴定，应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册（Bergry’s Manual of Systematic Bacteriology）和伯杰氏细菌命名手册（Bergry’s Manual of Determinative Bacteriology）的有关规定进行，包括形态、生长代谢特性检查。原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素敏感性等检查。 三级种子批常规检查包括以下3项： （1）培养特性及染色镜检     将菌种接种于适宜培养基，置有氧或厌氧环境中培养，观察其生长情况，确定菌种为需氧性细菌或厌氧性细菌；以划线法观察在琼脂平皿上生长的单个菌落的形状、大小、表面、边缘、透明度、色泽等特征；也可观察菌种在不同温度、pH或不同浓度的氯化钠溶液等条件下的生长特性等。 取菌种的新鲜培养物涂片做革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的染色反应、形态、大小和排列等，有芽孢的细菌应同时观察芽孢的形状、大小和位置（也可增做芽孢染色）。检查结果均应符合原始菌种的特性。 （2）生化反应     按附录ⅪⅤ“细菌生化反应培养基”选择相应的培养基或其他适宜的方法进行，结果应符合原始菌种的特性。 （3）毒性试验     毒性试验是通过动物试验检查菌种是否存在不安全因素，以保证人体使用安全。 用体重18～22g小鼠5只，每只腹腔注射0.3ml新鲜菌液（不少于1.0×109CFU/0.3ml）,连续观察3天，小鼠均应健康存活、体重增加；或每只小鼠经口灌胃0.5ml新鲜菌液（不少于1.0×109CFU/0.5ml），每天1次，连续3天，从第1天灌胃起连续观察至第7天，小鼠均应健康存活、体重增加。 除另有规定外，原始种子或主种子批还需进行以下检查： （1）细菌代谢产物——脂肪酸测定     照气相色谱法（附录Ⅲ Ｃ）或其他适宜的方法进行，应符合该菌种的特性。 （2）遗传特性分析     可采用细菌DNA的G+Cmol%的含量测定或其他适宜方法进行，应符合该菌种的遗传特性。 （3）抗生素敏感性试验    采用琼脂扩散纸片法或其他适宜方法进行菌株的抗生素敏感性检查，应符合该菌种的特性。 （4）稳定性试验     菌种在适宜培养基中，连续传代30代次后，将第30代培养物作种子批检定，全部检查结果应与原始菌种的特性一致。 4、种子批的保存 原始种子和主种子应冻干保存于8℃以下，工作种子应置于适宜温度保存。 （二）菌粉制造 应包括种子液制备、大罐培养、收获菌体（或芽孢）和菌体干燥制成菌粉。如生产多价制品时，应每种菌分别培养，制备单价菌粉。 1、生产用种子 启开工作种子批菌种，接种于适宜培养基进行多级种子扩增，应涂片做革兰氏染色，在显微镜下观察5～10个视野，细菌的染色反应、形态应一致并符合原始菌种的特征。制备过程应防止污染，菌种传代次数应符合规定。 2、生产用培养基 采用经批准的培养基用于生产。 3、培养 采用液体培养。将种子液置适宜条件下培养（包括厌氧或需氧、温度、时间等），培养过程中取样涂片做革兰氏染色镜检、pH值检测等，芽孢菌需进行芽孢形成率的检测，均应符合规定。培养结束后取样做纯菌检查，如发现污染应予废弃。 生产多价制品的单价菌粉时，应分别培养。 4、收获菌体和制成菌粉 培养结束后离心收获湿菌体，与适宜的分散剂、稳定剂混合。采用真空冷冻干燥法干燥菌体，芽孢菌可采用加热干燥方法，再经粉碎、过筛制成粉末状菌粉。 5、菌粉的保存及有效期 应通过活菌稳定性试验确定保存温度和有效期。 6、菌粉检定 按“菌粉检定”项进行，符合规定后方可进行半成品配制。 （三）半成品 1、配制 同一工作种子批菌种生产的最多2批单价菌粉可按批准的比例与辅料混合均匀后制成半成品。配制多价制品时，应将各单价菌粉、辅料按配方比例和配制程序混合均匀，配制过程应防止污染。 2、半成品检定 按“半成品检定”项进行，应符合规定。 （四）成品 1、剂型制备 根据制品的用途、使用对象和用药途径等因素确定剂型。制备过程应符合附录Ⅰ“制剂通则”项下相关剂型的规定。 2、分批 成品批号应在半成品配制后确定，配制日期即为生产日期。同一批号的制品，应来源一致、质量均一，按规定要求抽样检验后，能对整批制品作出评定。应根据验证结果，规定半成品的分装时间，如超过24小时，应分为不同的亚批。 3、分装、规格和包装 制品的分装应符合附录Ⅰ“制剂通则”的有关规定。包装应符合“生物制品包装规程”的有关规定。规格应符合批准的规格要求。 三、检定 微生态活菌制品质量检定应包括菌粉检定、半成品检定和成品检定。 （一）菌粉检定 1、外观 应为白色、灰白色或灰黄色粉末。 2、目的菌检查 取少量菌粉加入适量，灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜稀释液后，涂布在适宜琼脂平皿上，在适宜条件下培养，其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征。 3、杂菌检查 方法和结果判断见本总论附录3。如不符合规定应废弃。 4、干燥失重 菌粉中残余水分的含量会直接影响活菌的生存，须进行菌粉干燥失重的检查。应按附录Ⅶ Ｌ或仪器方法测定。 5、活菌数测定 测定每克菌粉中含有的活菌数量。方法见本总论附录2。 （二）半成品检定 半成品须做杂菌检查，根据用药途径确定杂菌检查的质控指标。方法和结果判断见本总论附录3。 （三）成品检定 1、鉴别试验 检查成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述“种子批的检定”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查，应符合规定。对于多价制品，则须逐一检查单价菌特性。 2、理化检查 （1）外观   根据剂型，观察制品的外观、色泽。 片剂外观应完整、光洁，呈白色或类白色，间有菌粉色斑；颗粒剂、散剂和胶囊剂内粉末的粒子大小、色泽应均匀，间有菌粉色斑。 （2）干燥失重   按附录Ⅶ Ｌ或仪器方法测定，减失重量应不得超过5.0%，芽孢菌制品应不得超过7.0%。 （3）粒度   散剂和颗粒剂应进行粒度检查。 按附录ⅤＧ第二法，采用单筛分法或双筛分法检查，应符合规定。 （4）装量（重量）差异   各剂型按附录Ⅰ“制剂通则”的相应规定进行，应符合规定。 （5）崩解时限   胶囊剂、片剂按附录ⅤＣ进行，应符合规定。 3、活菌数测定 按本总论附录2方法测定每克制品中的活菌数，应符合规定。多价制品应分别测定各单价活菌数。 4、杂菌检查 目的是检查成品中外源微生物的污染情况，以保证人体使用安全。 方法和结果判断与半成品的“杂菌检查”项相同。 5、安全试验 安全试验是通过动物试验进行的非特异性毒性检查，应根据制品的使用途径和人用剂量确定试验方法。 （1）肠道微生态活菌制品检查  称取2g制品，加入8ml生理氯化钠溶液中，混合均匀。用5只体重18～22g小鼠，每只小鼠经口灌胃0.5ml，每天1次，连续3天。自第1天灌胃起，连续观察7天，小鼠应健康存活、体重增加，判为合格。如不合格，可另选10只小鼠复试1次，判定标准同前。 （2）阴道微生态活菌制品检查  用24～26g雌性小鼠5只，，每只小鼠阴道内置入10mg制品，每天1次，连续3天。自给药第一天起，连续观察7天，小鼠应健康存活、体重增加，阴道局部无红肿、分泌物等症状，判为合格。 四、保存、运输及有效期 按批准的温度保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                    用于生产软骨素裂解酶的：解肝磷脂土地杆菌 一、菌种简介平台编号：Bio-53090 规格：冻干物拉丁属名：Pedobacter Heparinus＝Flavobacterium Heparinum 菌株名称：解肝磷脂土地杆菌其他编号：DSM2366=ATCC13125 =NBRC12017 =NCIB9290培养基编号：2培养温度：30用途：模式菌株，降低肝素，生产软骨素裂解酶，抑癌用途：模式菌株，降低肝素，生产软骨素裂解酶，抑癌注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、培养方法1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。 三、实验内容1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 四、使用范围（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。 （2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。 （3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。  五、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、菌种恢复培养前，建议将收到的菌种安瓿保存在 6-10°C 的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，如在说明建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成，有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种培养稳定后才能用于您的后续实验。3、初次使用时请严格按照本说明书推荐条件和操作步骤进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、恢复培养厌氧菌时，在操作过程中应严格控制厌氧条件：制作培养基时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养基中的氧气，使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站(www.biobw.org）。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                     哈尔滨产乙酸菌的特点与优势及培养与保存！ 哈尔滨产乙酸菌是Ethanoligenens属的微生物，原产地为中国。梭菌纲，厌氧菌。主要用途为分类学研究，具体用途为模式菌株。  一、菌种简介平台编号：Bio-04032 提供形式：冻干物拉丁属名：Ethanoligenens Harbinense 中文译名：哈尔滨产乙酸菌拉丁学名：Ethanoligenens harbinense原始编号：YUAN-3菌株来源：←哈尔滨工业大学保藏人：邢德峰直接来源国家：中国保藏时间：7/11/2005其他保藏编号：=JCM 12961生物危害：四类模式菌株：模式菌株菌株用途：模式菌株培养温度：35℃培养基：1004    其他培养条件：厌氧分离源：厌氧活性污泥采集地点：黑龙江省哈尔滨市采集国家：中国Genbank（保藏人）：AY 295777用途：模式菌株 注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、产品特点1、菌种功能明确、品种稳定、应用;2、产品仅限用于科研本品芽孢含量高,稳定性好、耐高温和挤压;3、繁殖能力快、定植能力强、易存活、耐受低pH值环境;4、复活迅速,可在短期内成为优势种群;5、本品安全高效、无抗药性、不污染环境;6、对多数抗生素不敏感,可与低浓度抗革兰氏阴性菌抗生素同时使用。 三、产品优势1、产品质量稳定,是为科研和提供微生物菌种资源共享服务的专业平台。2、国内首创封闭管包装,冻干后的菌株使用时添加配套的复苏培养基后迅速而完全溶解。针对不同的菌株提供八种不同的培养方法,保证菌种的复苏质量。3、严格的质检程序,确保产品质量的稳定性。4、该类产品广泛使用到食品、药品、化妆品、水产品、化工等行业,疾控中心、质检局、出入境、药检局等等,得到广泛好评。 四、微生物菌种培养方法1、孢子制备⑴ 放线菌孢子的制备一般采用琼脂斜面培养基,培养基中含有一些适合产孢子的营养成分,如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1%,氮源不超过0.5%),碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境,不利于放线菌孢子的形成,氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下,干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28 ℃,少数为37 ℃,培养时间为5~14天。⑵ 产品仅限用于科研霉菌孢子的制备霉菌的孢子培养,一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖,而且这类培养基的表面积较大,可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25~28 ℃,培养时间为4~14天。2、种子制备⑴ 摇瓶种子制备摇瓶种子进罐,常采用母瓶、子瓶两级培养,有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基要求比较丰富和完全,并易被菌体分解利用,氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓,子瓶培养基浓度比母瓶略高,更接近种子罐的培养基配方。⑵ 种子罐种子制备种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中,经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子,把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内,经过培养形成更多的菌丝,这样制备的种子称为二级种子,将二级种子转入发酵罐内发酵,称为三级发酵。同样道理,使用三级种子的发酵,称为四级发酵。 五、保存方法1、传代保存法：培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙。2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。3、悬液保存法：①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。②糖液保存法:适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。4、载体保存法：①土壤保存法;②砂土保存法;③硅胶保存法;④磁珠保存法;⑤麸皮保存法;⑥纸片(滤纸)保存法。5、常用的冷冻保存法：①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的。②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。③液氮保存法(-196℃):是适用范围最广的微生物保存法。 微生物菌种查询网作为中国微生物菌种中心引航者，单位代为引进美国ATCC微生物菌种保藏中心，德国DSMZ菌种保藏中心，荷兰CBS菌种保藏中心，日本JCM微生物菌种保藏中心，包括其中的ATCC微生物细菌与噬菌体（18382）；细胞系和杂交瘤（4997）；真菌和酵母（58183）；原代细胞（146）；原生动物和藻类（2428）；干细胞（102）；载体，克隆与分子（18006）；病毒（3594）；核酸 - DNA / RNA（1350），引进进口微生物菌种货期短，质量保证，UPS国际快递运输。

                     食品中金黄葡萄球菌的检测方法及操作步骤！ 金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。这种菌广泛分布于自然界，如空气、土壤、水及其它环境中。在人类和动物的皮肤及外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。据报导，在正常人群中的带菌率可达30%~80%，其中皮肤带菌率为8~22%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的带菌率在40~50%以上，因此其可通过各种途径和方式，尤其是经工作人员的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黄葡萄球菌能产生肠毒素，故一旦细菌污染食品，并在合适的温度环境下，细菌可以大量繁殖并产生肠毒素，从而引起消费者食物中毒。   由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，在世界各国都极为普遍。特别是在北美及欧洲等地区的发病率更高。在上述这些国家中，每年有金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例，仅次于沙门氏菌，而在细菌性食物中毒病例排到第2~3位，因此而造成的经济损失也相当惨重，在我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例也时有报导，所以目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。    目前我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准GB.4789-10-84及检验检疫系统行业标准SN.0172-92作为依据。整个检测过程获得最终结果须时5天左右，既费时又费力，并造成货物积压，也影响货物的及时出运，并使货主的仓储成本提高，造成较大的经济损失。  多年来很多食品微生物实验室都在探索和寻找一些准确性高，并快速的检测方法，最近我们分别从美国3M公司和法国生物梅里埃公司获得两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的培养基，其名称为：  ①Petrifilm RSA. Count Plate（由美国3M公司研制生产），是一种薄膜型快速检测金黄色葡萄球菌的计数平板。  ②Baird-parker + RPF Agar.（由法国生物梅里埃公司研制生产的用Baird-Parker琼脂加免血浆纤维蛋白原的金黄色葡萄球菌检测计数平板）。  原理：Petrifilm. RSA. 测试薄膜是由二部分组成。第一部分是由黄金色葡萄球菌培养基片，此培养基中含有经修正的Barid-Parker，营养成分加上以冷水可溶解的胶质。第二部分是一种耐热核酸酶（TNase）反应片，含有DNA及甲苯胺兰 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示剂 (Tetraeolium)。此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。 耐热去氧核糖核酸（deoxyribonulcas Dnase）为产毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐热，在100℃加热30min，不易丧失活性，在130℃之下，其D值为16.6min，此酶之分子量为16800，等电点PH为9.6,耐热去氧核糖酸与检测血浆凝固酶相似，是一种鉴定金黄色葡萄球菌的方法，在Petrifilm. RSA 检测片上，耐热DNA酶反应看起来，呈粉红色环带包围着一个红色或兰色的菌落。  Petrifilm.RSA检测片，必须与Peyrifilm耐热核酸酶反应片一起使用，单独使用将不会显示菌落，因为具有辅助计数菌落的指示剂是在反应片上，而不是在Petrifilm.RSA检测片上。 Baird-parker + RPF agar，这一培养基中含有丰富的营养成分，其中以氯化锂代替亚碲酸钾，使菌落颜色呈黑色，RPF补充有兔血浆和牛纤维蛋白原，以便检测凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分围绕凝固酶阳性菌落周围沉淀晕环纤维蛋白的溶解，因此凡存在血浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，将在培养基中呈现有晕环的黑色菌落，即可确认，并作计数。  实验操作步骤 材料和方法：  本次实验采用以下3种试剂：  1.美国3M公司提供的Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate.  2.法国生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker + RPF agar 。  3.实验室自配Baird-Park琼脂（英国Oxoid）及新鲜兔血浆。  菌种来自美国菌种保存中心（America TyP Culture Collection）。金黄色葡萄球菌共10株菌株，其菌号分别为：  ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704  ATCC(K) 12600 ATCC(R) 65389 ATCC 25923 ATCC 29213  ATCC 8095 ATCC 12598  非金黄色葡萄球菌菌种5株，其菌号分别为： ATCC 51813 （大肠杆菌）、ATCC 624 （无乳链球菌）、ATCC 51816 （阴沟肠杆菌）、ATCC 6051 （枯草杆菌）、ATCC 49214 （肠炎沙门氏菌）、自然食品检样，任意购自市场。  本次实验是以同一测试样品经均质并通过无菌生理盐水作10倍递增稀释后取1至2个稀释度同时接种上述三种培养基作平行实验，在取得最终结果后相互进行比对。  上述三种培养基的接种方法是按生产商所提供的使用说明进行操作，另外Baird-Parker Agar 培养基是按SN0172-92标准进行操作。  A、本次实验共测试已知标准菌种共15株，其中葡萄球菌10株，其他菌种5株（包括大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肠炎沙门氏菌、枯草杆菌和无乳链球菌）。  B、测试自然食品检样共101只（其中包括肉11只、肉类14只、水产品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只）。  结果：  A、被检菌种10株，金黄色葡萄球菌在三种培养基上都能检出生长情况良好，同一稀释度的菌液，除个别菌株外在3种培养基计数检测结果基本都在一个数量级上，无显著差异。而5株非金黄色葡萄球菌的菌株在三种培养基上全部不能生长。  B、自然食品检样共接种101只，每一检样同一稀释浓度分别同时种三种培养基，最终共检出金黄色葡萄球菌45只，占全部检样的44.5％，其中Petrifilm RSA 检出阳性结果为42只，占全部阳性检样的93.3％，Baird-Parker＋RPF Agar. 检出阳性结果26只，占全部阳性检样的57.7％。Baird-Parker. Agar 检出阳性结果32只，占全部阳性检样的71.1％。  讨论  1.用15株标准菌在3种培养基中的检测，10株金黄色葡萄球菌以同一浓度接种，结果生长良好，其最终计数基本一致，定位在同一数量级，5株非金黄色葡萄球菌接种上述三种培养基全部不长，说明上述三种培养基对金黄色葡萄球菌选择良好。  2.以101只自然样品同一均质稀释液，同时接种三种培养基，从最终结果来看，对金黄色葡萄球菌的阳性检出率为44.5％。 3.从检测程序来年，Petrifilm. RSA及Baird-Parker＋RPF. Agar. 都在样品接种后28~30h观察结果，并不必再做证实试验，而如以Baird-Parker Agar检测，须在接种后48h观察平板，并挑取可疑菌落转种到营养肉汤中，在经18-24h后做血浆凝固酶或耐热DNA酶试验进行证实，最终计数，前后约须80h。  4.从本次试验中观察，使用上述三种培养基对食品中金黄色葡萄球菌含量的直接计数检测，其样品接种液的含量拟控制在100个/ml以内，比较容易分清并计数，如菌量过浓，则将会影响最后的读数，因此对新送的被检样品，如在不了解污染的情况下一般必须要做2个以上的稀释度，同时分别接种，才能获得较为满意的结果。  而在Baird-Parker＋RPF Agar及Baird-Parker. Agar接种时必须将1ml样液作三只平板涂布（0.3、0.3、0.4ml）这样就会造成手续繁琐试剂消耗较大，但Baird-Parker. RPF. 培养基也可以1ml样液作倾注培养，并作计数。  5.在整个测试过程中，我们发现，按使用说明对Petrifilm. RSA. 及Barid-Parker＋RPF. Agar，操作规定在接种24h后观察结果，此时往往由于菌落长得经较小，特征瓜不明显，但如果继续放置一夜以后金葡萄菌落特征明显，并可能会经第一天观察数量有所增加，这样可以提高检测结果的可信度。  6.由于对上述两种培养基的试用期间我们尚未获得供应商的报价，故无法测算每一样品的测试成本价格。但可以予计上述两面种快速检测培养基的耗材费用要高于常规经典方法（Baird-Parker Agar）的费用。  7.通过本次实验，我们感到使用美国3M公司生产的Petrifilm. RSA Plate培养基和法国生物－梅利埃公司生产的Baird-Parker RPF. Agar培养基检测中的金黄色葡萄球菌。可以比目前常规检测方法时间可缩短一半。并可以明显节省大量人力。这完全符合实验室快速检测的要求，尤其是对基层较简陋的实验室条件中，更显其使用方便的优越性。   可以通过本次试验了解一下步骤，培养基可以选用青岛海博生物技术有限公司的，效果相当不错。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                      果生链核盘菌的形态特征与主要价值及应用！ 果生链核盘菌是Monilinia属的微生物，原产地为中国。用于柠檬酸的生产，并具有糖化酶、果胶酶、淀粉酶和乳糖酶等酶活性。 一、菌种简介平台编号：Bio-20951 规格：培养物 拉丁属名：Monilinia Fructigena 中文名称：果生链核盘菌拉丁属名：Monilinia种名加词：fructigena Honey收藏时间*：2008-9-27来源历史：北京林业大学转原产国：日本资源归类编码：15151521102模式菌株：非模式菌株主要用途：其他具体用途：生产代谢产物特征特性：果生核盘菌Monilinia fructcola (Winter) Honey ，子囊盘初呈棍棒状，后呈漏斗形。成熟的子囊盘紫褐色，盘径为1～1.5㎝，具柄，柄长20～30㎝，暗褐色。子囊盘上生有子囊层。子囊为长棍棒状至圆筒形，顶端圆，基部稍细，大小为102～215µm×6～13µm。子囊之间有侧丝，侧丝丝状，单生或有分枝，具有数个隔膜，几乎和子囊等长，但宽为2～3µm。子囊内生8个子囊孢子，斜行排列。子囊孢子无色，单胞，柠檬行至椭圆行或球形，大小6～15µ生物危害程度：四类寄主中文名称：梨致病对象：植物致病名称：梨实腐传播途径：空气分离基物：果实采集地区：日本青森采集具体地点：果园培养基信息：培养基编号: 14 培养基名称: PDA培养温度：25资源保护类型：培养物保藏方法：定期移植法共享方式：公益性共享提供形式：斜面培养物实物状态：有实物用途：生产代谢产物 注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、形态特征菌落在查氏琼脂培养基上生长迅速，25℃培养7天直径50-70mm；少数菌株生长局限；菌落平坦或中心凸起，有规则或不规则的辐射状沟纹；质地丝绒状或稍呈絮状；分生孢子结构大量，表面呈炭黑色；有的菌株产生菌核；菌落反面无色或呈不同程度的黄色或黄褐色。分生孢子头初为球形至辐射形，老后分为几个圆柱状结构；分生孢子梗发生于基质；顶囊球形或近球形，表面全面可育；产孢结构双层；分生孢子球形，壁粗糙或具不规则疣状。 三、主要用途用于柠檬酸的生产，并具有糖化酶、果胶酶、淀粉酶和乳糖酶等酶活性。 四、菌种的培养1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。 五、实验内容1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 六、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、菌种恢复培养前，建议将收到的菌种安瓿保存在 6-10°C 的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，如在说明建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成，有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种培养稳定后才能用于您的后续实验。3、初次使用时请严格按照本说明书推荐条件和操作步骤进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、恢复培养厌氧菌时，在操作过程中应严格控制厌氧条件：制作培养基时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养基中的氧气，使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站(www.biobw.org）。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                分离基物为人体腹腔脓肿的：昂氏别样杆菌 昂氏别样杆菌，菌落直径为0.5-1mm，形状不规则，边缘整齐，半透明，正面灰白色，中间凸起，表面光滑，质地黏稠，G－（红），杆菌。主要用于教学，研究。 一、菌种简介平台编号：Bio-102986 规格：冻干物 拉丁属名：Alistipes Onderdonkii Subsp. Onderdonkii 菌株名称：昂氏别样杆菌培养基：特殊蛋白胨：23.0，可溶性淀粉：1.0，氯化钠：5.0，琼脂：10.0，pH：7.3±0.2（25℃）生长条件：37°C；3-5天；厌氧存储条件：-80℃安全等级：1分离基物：人体腹腔脓肿模式菌株：yes用途：研究注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、形态特征菌落直径为0.5-1mm，形状不规则，边缘整齐，半透明，正面灰白色，中间凸起，表面光滑，质地黏稠，G－（红），杆菌。 三、微生物培养方法1、平板划线分离法:把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环圈在平板培养基表面,通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞,经培养后生长繁殖成单菌落。2、稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养,在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个菌落。上述两种方法虽然都可以实现观察菌落特征的目的,但平板划线分离法不能对菌落计数,而稀释涂布平板法培养过程复杂,对平板的要求比较高,可参照以下步骤:a、制备平板培养基将氯化钠蔗糖琼脂培养基加热溶化并冷却至65℃,向氯化钠蔗糖琼脂培养基中加入克林霉素溶液3~5ml并混合均匀,然后取20ml混合均匀的培养基溶液倒入培养皿,轻轻摇动培养皿,使培养基溶液均匀分布在培养皿底部,待培养基溶液凝固后即得平板培养基。b、制备活性污泥混合液称取活性污泥土样15g,放入盛100ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振摇15~20min混合均匀,用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀,制成活性污泥混合液。c、培养基涂布从活性污泥混合液中吸取0.2ml,滴在平板培养基表面的中央位置,用无菌玻璃涂棒将活性污泥混合液沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。 四、操作步骤①准备上述平板 1-2 块（提前置于厌氧环境除氧 24h）；②安全柜中打开，用酒精灯灼烧顶部，后迅速滴上无菌水使之破裂，随后用镊子将其敲碎；③吸取 0.5mL 无菌水打入冻干管，充分溶解菌粉后，打入平板中 200μL/个，涂布均匀；④将平板置于上述培养条件下培养，菌种长出即可使用。 五、保存方法1、传代保存法：培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙。2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。3、悬液保存法：①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。②糖液保存法:适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。4、载体保存法：①土壤保存法;②砂土保存法;③硅胶保存法;④磁珠保存法;⑤麸皮保存法;⑥纸片(滤纸)保存法。5、常用的冷冻保存法：①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的。②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。③液氮保存法(-196℃):是适用范围最广的微生物保存法。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                耐冷嗜冷芽孢杆菌的菌株培养与实验内容及保存方法！ 耐冷嗜冷芽孢杆菌是Psychrobacillus属的微生物，原产地为北冰洋，在中国分离。主要用途为研究，具体用途为极地细菌。 一、菌种简介平台编号：Bio-120915 规格：冻干物拉丁属名：Psychrobacillus Psychrodurans 中文名称：耐冷嗜冷芽孢杆菌拉丁名称：Psychrobacillus psychrodurans来源历史：MCCC原产国：中国模式菌株：否生物安全级别：一级其它保藏中心编号：MCCC 1A09458培养基编号：102.0培养基成分：2216.0培养温度：15℃培养时间：24-48h需氧类型：好氧分离基物：土壤/河边水草根际土保存方法：冷冻干燥管保藏用途：研究注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、形态特征耐冷嗜冷芽孢杆菌，与模式菌株Psychrobacillus psychrodurans DSM 11713(T) AJ277984相似性为99.744%(Diff/Total nt 2/780)；在M2培养基上25℃生长7天，菌落呈圆形，奶油色不透明，表面光滑不湿润，边缘规则，无晕环，中央微凸起，直径约1mm；在15℃海水LB培养基上生长3天，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶（三丁酸甘油酯法）阴性；在2216E培养基上25℃生长5天,不产嗜铁素。  三、菌种的培养1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)三级。工业发酵的有用菌种,其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种,也称种子制备,是指菌种在一定条件下,经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯 菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的菌种,用无菌手续挑取少许,接入琼脂斜面培养基上,在25℃(或较高温度)下培养5~7天(或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子(对于霉菌类孢子制备,多数采用大米、小米之类的天然培养基)。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液,接种到扁瓶固体培养基上,于25~28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干,使水分降至10%以下,并放入4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在 上延续使用半年左右。6、如果有些菌种不产孢子,如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体,作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源(如葡萄糖)和氮源(如玉米浆),及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%~20%。 四、实验内容1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、保存方法1、传代保存法：培养基的浓度不宜过高,营养成分不宜过于丰富,尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种,则应在培养基中添加少量碳酸钙。2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长,适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。3、悬液保存法：①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌,将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。②糖液保存法:适用于酵母菌,如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗处保存,可长达10年。除此之外,也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。4、载体保存法：①土壤保存法;②砂土保存法;③硅胶保存法;④磁珠保存法;⑤麸皮保存法;⑥纸片(滤纸)保存法。5、常用的冷冻保存法：①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的。②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。③液氮保存法(-196℃):是适用范围最广的微生物保存法。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                   大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法与培养技术！ 骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。 1、选取 SPF 级，体重 100~150g 左右的SD 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为 75%的乙醇中浸泡 5 min。 2、工作台紫外消毒后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。 3、无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、全骨髓提取 1、眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。 2、假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。 3、用无菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM 完全培养液的无菌培养皿中，取出 1mL 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。 三、细胞制备 吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于 15 mL 离心管中，1000 r/min 室温离心5 min。 四、接种培养 1、离心后去上清，用 6mL 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至 25 cm。 2、饱和湿度培养箱中培养。 3、24 小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞， 以后每两三天换液 1 次，直到增殖达到融合。4. 约 7 天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达 80%~90%，可进行细胞传代。 五、细胞传代 待细胞融合至 80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的 PBS 轻轻冲洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA 浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。　　 本实验以 1：2 进行传代。　 六、细胞观察　 细胞传代到第 3 代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达 95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34 阴性，CD44 阳性。　　从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。 七、注意事项 1、缓慢冲洗骨髓腔：　　冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。 2、严格无菌：　　 取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作。 3、培养基中血清浓度：　　过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培养。 4、原代细胞静置培养：　　原代细胞置于培养箱 24～48h 内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

               嗜热耐碱链霉菌的形态特征与功效作用及使用方法！ 嗜热耐碱链霉菌是streptomyces属的微生物，原产地为中国。主要用途为研究。 一、菌种简介平台编号：Bio-134352 提供形式：冻干物 拉丁属名：Streptomyces Thermoalcalitolerans 中文译名：嗜热耐碱链霉菌 拉丁学名：streptomyces thermoalcalitolerans 原始编号：X47 菌株来源：←中国科学院微生物研究所 保藏人：宋磊 直接来源国家：中国 保藏时间：6/29/2011 生物危害：四类 模式菌株：非模式菌株 培养温度：30℃ 培养基：0038     其他培养条件  分离源：猪场垫料 采集地点：厦门 采集国家：中国 用途：研究：注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、形态特征嗜热耐碱链霉菌，革兰氏阳性，形成高度分枝的基丝和气丝，菌丝通常无横隔，不断裂。多数种产生成链的孢子。孢子不游动，多有颜色，质地光滑或多刺或有疣、凸起等。孢子链直或柔曲或螺旋或兼而有之。主要甲基萘醌为MK-9（H6）/MK-9（H8），一些种也含有MK-9（H4）。  三、菌种特性细胞圆球状，在直角两个平面交替分裂形成四联状，一般细胞成对生,单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性,不运动,兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。接触酶阴性，不产细胞色素。 四、功效作用产酸，菌群，维持肠道微生态平衡。在动物体内对病原微生物有颉颃作用，可竞争性地抑制病原微生物，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的，防止有害物质产生。 五、使用方法直接加入配合饲料中或先按一定倍数稀释后,再加入饲料中混匀。也可预先活化后再发酵饲料或直接供动物饮用。具体用量参考产品使用说明。 六、培养方法1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)三级。工业发酵的有用菌种,其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种,也称种子制备，是指菌种在一定条件下,经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯 菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的菌种,用无菌手续挑取少许,接入琼脂斜面培养基上,在25℃(或较高温度)下培养5~7天(或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子(对于霉菌类孢子制备,多数采用大米、小米之类的天然培养基)。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液,接种到扁瓶固体培养基上,于25~28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干,使水分降至10%以下,并放入4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在 上延续使用半年左右。6、如果有些菌种不产孢子,如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体,作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源(如葡萄糖)和氮源(如玉米浆),及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%~20%。 七、注意事项储存时，提高水分含量则菌群活力。高温制粒时,必须对产品进行包被处理。不饱和脂肪酸对乳酸片球菌具有颉颃作用,配合日粮中添加乳酸片球菌，应尽量避免与添加的油脂直接接触。饲料中的钙也会明显影响乳酸片球菌的活性。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                   假单胞菌属：肠道有害菌属，多变且适应性强！ 假单胞菌属 假单胞菌属（Pseudomonas）是最多样化和普遍存在的细菌属之一，其物种存在于沉积物、临床样本、植物（或植物根际）、患病动物、水、土壤、海洋、沙漠等，这反映在它们多变的代谢能力和广泛的适应环境的潜力上。 假单胞菌属是一类革兰氏阴性的好氧或微需氧的细菌，属于 Proteobacteria（变形菌门），代表种包括： Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌） Pseudomonas putida （恶臭假单胞菌） 假单胞菌属是机会性病原体，是全世界医院获得性感染的主要原因。它可以侵入多个器官系统，包括血液、肺、软组织（皮肤、肌肉和肌腱）、身体的其他部位。症状取决于感染部位。 与假单胞菌属感染相关包括免疫系统受损患者的感染和医疗器械相关感染等，如刚接受过手术的人和免疫功能低下的人，艾滋病或糖尿病患者。 假单胞菌属与人体健康相关，其中一些菌株可以引起感染和疾病，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），可以引起呼吸道、肠道、泌尿道和皮肤感染。 免疫抑制个体和住院患者的铜绿假单胞菌肠道携带率显着升高，因此感染和抗生素相关性腹泻的风险增加。 假单胞菌属与其他菌属如葡萄球菌、普雷沃氏菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属等菌属有互作关系。 假单胞菌不被认为是肠道微生物组的典型成员，并且假单胞菌在肠道定植与发生肺部感染和死亡率的风险增加有关。 研究表明，假单胞菌与肠道屏障功能障碍和感染有关，可能导致败血症和多器官功能障碍综合征。此外，假单胞菌与炎症性肠病的发生也有关系，它在IBD患者的肠道中检测到丰度更高，而且它参与引起其他菌群的失衡会影响疾病的进展。 细菌有可能在人体内的不同部位之间转移，防止肠道定植或肠道到其它器官尤其肺部的传播，可能是预防重症患者假单胞菌感染的有效策略。 本文主要分享假单胞菌属（Pseudomonas）的生态，分类，致病因素以及与人体相关健康特性和可能的生活干预措施。 一、认识假单胞菌属 假单胞菌属（Pseudomonas），是革兰氏阴性、好氧菌属，于 1894 年被描述，是最多样化和普遍存在的细菌属之一。有些物种对人类、动物或植物具有致病性。 1、生理特性  假单胞菌属（Pseudomonas）属于假单胞菌科，包含200多个有效描述的物种。该属的成员表现出大量的代谢多样性，因此能够在广泛的生态位中定居。 它们易于体外培养，并且越来越多的假单胞菌菌株基因组序列可供使用，这使得该属成为科学研究的绝佳焦点。 研究最好的物种包括铜绿假单胞菌。直的或略微弯曲的棒状但非螺旋状，0.5–1.0 × 1.5–5.0 µm。由一根或数根极鞭毛运动；很少不动。在某些物种中，也可能形成短波长的侧鞭毛。有氧，具有严格的呼吸型代谢，以氧为末端电子受体；在某些情况下，硝酸盐可用作替代电子受体，从而允许厌氧生长。 大多数物种（不是全部）无法在酸性条件（pH 4.5 或更低）下生长。大多数物种不需要有机生长因子。氧化酶阳性或阴性。过氧化氢酶阳性。化学有机营养的。 2、无处不在的多样性 （1）分布广 假单胞菌属是变形菌门的一个庞大而多样的属。从北极苔原到热带雨林，从干旱的土壤到雨云，几乎在地球的每个角落都可以找到该属的成员。这种令人难以置信的环境适应性归功于假单胞菌非凡的新陈代谢多样性。 （2）野蛮生长 假单胞菌可以在 0 至 42 °C 的温度范围内生长，甚至可以在更极端的温度下存活。它们对营养的需求很少，可以利用多种碳源。尽管假单胞菌在有氧环境中生长最佳，但它们也可以利用氮进行厌氧呼吸。 它们可以作为自由生活的浮游细胞或作为生物膜群落的成员生活，并且具有将微生物信号和环境线索转化为特定生态位过程的非凡能力。 基因组分析表明，许多其他因素有助于假单胞菌属的多样性和适应性。除了赋予调节和代谢灵活性的常见基因的大量等位基因差异外，水平基因转移影响了致病性假单胞菌属的能力。 3、基因组和分类 第一个假单胞菌基因组测序于 2000 年，有 630 万个碱基对，是当时最大的细菌基因组测序。基因组包含大量参与分解代谢、运输、流出、运动和信号响应调节的基因。 事实上，铜绿假单胞菌基因组中超过 8% 的基因被认为参与了调控，这远远超过了在任何其他细菌基因组中观察到的百分比。很明显，假单胞菌成功的关键在于它可以表达其基因的可塑性，这是由多层监管复杂性提供的。 自 2000 年以来，已测序的 1000 多个假单胞菌基因组中的绝大多数都是铜绿假单胞菌的临床菌株。 总的来说，铜绿假单胞菌基因组的主要部分（约 4000 个基因）在所有菌株中都是保守的，代表了“核心基因组”。多达另外 20% 的基因驻留在共同代表“附属基因组”的基因组岛上。正是这个附属基因组赋予了铜绿假单胞菌的可塑性，并包含许多参与代谢、毒力和抗生素抗性的基因。 由于已在测序分离株的附属区域鉴定出大约 10 000 个独特基因，因此估计铜绿假单胞菌泛基因组可以接近甚至超过 100 000 个基因，这意味着假单胞菌这一物种的遗传库将远远超过人类。 该属的分类学多年来一直存在争议，因为许多最初包含在假单胞菌属中的细菌类群已被重新归类为其他属或来自不同类别的变形杆菌的物种。 可以根据16S rRNA、gyrB、rpoB和rpoD基因的序列分为三个谱系和13个群。 临床常见菌种主要包括： 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina) 产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) 假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes) 二、假单胞菌感染的常见症状 一般症状  一般非特异性症状（许多疾病中常见的症状）包括： 发烧，出汗，发冷，咳嗽，疲劳； 假单胞菌感染的症状取决于它们发生在身体的哪个部位。 假单胞菌（Pseudomonas）可引起以下器官感染： 耳朵（外耳炎或游泳者的耳朵）： 疼痛、水肿（肿胀）、压痛和分泌物 皮肤： 假单胞菌通过压疮、烧伤和手术伤口或从血流进入菌血症患者的皮肤，还可能引起毛囊炎等。 具体可表现为：脓肿（感染肿块）、皮疹、脓液、皮肤溃疡、坏死组织（皮肤变黑，表明组织正在死亡）。 骨骼或关节： 受影响区域行动不便、关节或背部疼痛、肿胀、疼痛或发热。 这些通常是由于静脉内 (IV) 药物使用或感染的手术伤口或受伤造成的伤口细菌传播到皮肤、骨骼和关节的结果。 伤口： 伤口有分泌物或结痂（通常是黄绿色），可能有甜味或难闻的气味。 消化道： 阑尾炎（由于治疗导致白细胞低的人发生肠道感染）腹痛、腹胀和腹泻的症状。 肺： 假单胞菌可能会导致严重的肺炎，通常发生在住院、已经生病和免疫功能低下的人身上。它可引起囊性纤维化患者的慢性肺部感染（遗传病），支气管扩张（气道永久性扩张），或慢性阻塞性肺病。 具体可表现为：呼吸急促、胸痛、咳痰（伴有白色、黄色或绿色粘液）和充血。 泌尿道： 排尿疼痛、尿液难闻或有甜味、尿急、尿液浑浊。 因此，假单胞菌感染的特征在于广泛的症状。 三、与人体健康有什么关系 假单胞菌属与人体健康相关，其中一些菌株可以引起感染和疾病，如Pseudomonas aeruginosa 绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌，可以引起呼吸道、泌尿道、皮肤感染。虽然不是正常口腔菌群的成员，但在口腔疾病和牙齿矫正治疗中可能会富集。 1、假单胞菌属在肠道中的角色 假单胞菌属不被认为是肠道微生物群落的典型成员，肠道定植假单胞菌属与发展肺部感染和死亡风险增加有关。 假单胞菌属的过度生长可能会导致肠道炎症和系统性炎症反应。 假单胞菌属感染会引起机体的Th17细胞反应和系统性炎症反应，因此，干预Th17细胞免疫反应可能是缓解肺炎的有效方法。此外，假单胞菌属也可以通过产生GABA来影响蛋白质代谢和细胞稳态，从而影响宿主的摄食行为。 2、假单胞菌属与其他肠道菌属的互作 假单胞菌属与其他菌属如大肠杆菌、沙门氏菌等有关，与肠道微生物群的平衡和健康密切相关。 假单胞菌属与其他菌属如葡萄球菌属和普雷沃氏菌属等，共同存在于囊性纤维化患者的肺部感染中。 假单胞菌属与其他菌属如不动杆菌属（Acinetobacter）等一起被发现在冷鲜乳中，产生脂肪酶和蛋白酶，参与乳制品和肉类的变质。 假单胞菌属与其他菌属如Bacillus、Enterobacter、Enterococcus等一起参与了肠-肺轴的微生物和免疫调节，影响呼吸道疾病的发生和发展。 3、假单胞菌属与疾病的关联 与假单胞菌属相关的疾病包括：免疫系统受损患者的感染和医疗器械相关感染等。免疫抑制个体和住院患者的铜绿假单胞菌肠道携带率显著升高，因此感染和抗生素相关性腹泻的风险增加。 研究表明，假单胞菌属与肠道屏障功能障碍和感染有关，可能导致败血症和多器官功能障碍综合征。假单胞菌属与肺部疾病也有关联，如支气管扩张症。 4、肺部疾病 研究发现，肺部假单胞菌属感染会影响肠道菌群，而通过调节肠道菌群可以影响肺部疾病的治疗效果。 肠道定植通常先于肺部感染，并且相同菌株经常在肠道和肺部中发现，表明肠道充当了假单胞菌属的储存库，可以传播到肺部和其他感染部位。 肠道微生物群的免疫调节对呼吸道疾病的发生有影响，肠道共生菌通过屏障效应提供菌群抵抗力，从而保护肠道生态环境不被改变。 以肺部假单胞菌、肠道拟杆菌和肠道酵母菌为特征的高肠-肺相互作用集群，与加重的恶化，整体支气管扩张严重相关。 5、炎症性肠病（IBD） 假单胞菌属与炎症性肠病的发生也有关系。 研究表明，IBD患者肠道中假单胞菌属的种类和数量与非IBD患者存在显著差异。 其中，克罗恩患者中假单胞菌属的检出率明显高于非IBD患者。此外，假单胞菌属的多样性在活动性IBD患者中也明显降低。这些结果表明假单胞菌属可能与IBD的发病机制有关。具体而言，假单胞菌属可能通过影响肠道菌群的平衡和多样性，导致肠道免疫系统的异常反应，从而引发IBD的发生。 因此，调节肠道菌群可能是预防和治疗肠道疾病的一种新策略。 四、假单胞菌属致病机理 1、产生毒力因子 铜绿假单胞菌等的特殊能力引起如此多样化感染的假单胞菌属是因为它们能够产生名副其实的毒力因子库，包括毒素、生物膜、蛋白酶和溶血素。 考虑到铜绿假单胞菌的医学重要性，假单胞菌领域的大部分研究工作都致力于了解影响这些毒力因子释放的调节、生物合成和环境因素。 此外，它们还可以获得赋予进一步抗菌素耐药性的移动遗传元件；因此，可以鉴定出泛耐药菌株。 超强适应环境的能力：杀死竞争者的同时，破坏生态平衡 假单胞菌感知和适应环境的能力导致了一系列活动，例如许多酶和其他生物分子的分泌。虽然这些毒素、降解酶和抗菌剂可以将假单胞菌的环境转变为理想的微生物生态位，但它们可能对植物和动物宿主造成严重后果。例如，绿脓素是一种蓝/绿色色素毒素，它赋予铜绿假单胞菌培养物特有的颜色，并作为一种抗菌剂可以杀死竞争性微生物。然而，它也会破坏真核细胞过程，这会对人类细胞产生不利影响。 群体感应：促进其生长、分化、生物膜形成，增强致病性 过去几年的工作提供的证据表明，群体感应是一种通用的调节机制，它允许细菌以种群密度依赖的方式发起统一、协调的反应，以完成即使不是不可能，也很难完成的任务。 群体感应系统广泛存在于假单胞菌中，人类机会性病原体铜绿假单胞菌，属于研究最广泛的细胞间通讯系统。在这种生物体中，群体感应非常复杂，由两个相互关联的 N-酰基高丝氨酸内酯 (AHL) 依赖性调节回路组成，这些调节回路由非 AHL 相关信号分子和许多调节剂进一步调制，这些调节剂在转录过程中起作用和转录后水平。这种遗传复杂性可能是导致铜绿假单胞菌具有巨大环境多样性的关键因素之一。 过去几年的工作表明，群体感应对于一系列毒力因子的表达以及铜绿假单胞菌中生物膜的形成至关重要，因此代表了设计用于治疗铜绿假单胞菌的新型药物的有吸引力的目标感染。 此外，细胞间通讯能力也在许多额外的假单胞菌中得到证实。铜绿假单胞菌，因此可以用于设计新型药物来治疗铜绿假单胞菌感染。 五、如何调整和干预 1、肠道中的假单胞菌属 长时间住院、创伤ICU住院、消毒干预等与肠道假单胞菌过度生长有关，而TAP暴露与抗菌剂干预则与肠道假单胞菌过度生长有负相关。 注：TAP的暴露是指肠道上皮细胞上的TAP暴露在肠道腔中，从而使肠道内的微生物可以通过TAP进入肠道上皮细胞内部。一些研究表明，TAP的暴露与肠道微生物群失调和某些疾病（如炎症性肠病）有关。而抗菌剂干预可以抑制肠道内细菌的生长，从而减少TAP的暴露，因此与假单胞菌肠道过度生长有负相关。 对于免疫功能低下的患者，应特别注意水的纯度，有些水中可能含有假单胞菌等细菌。 研究发现用海洋益生元岩藻依聚糖补充饮食可以通过抑制分泌性毒力因子 (TpsA/CdiA) 与粘蛋白的相互作用并促进有益种群的生长，从而介导铜绿假单胞菌从肠道菌群失调和去定植中的早期恢复。 芪归饮是一种用于治疗铜绿假单胞菌感染的中药。在门和属水平上显著抑制脱铁杆菌和粘孢子菌的过度积累。鉴定了11种潜在的代谢产物，这些代谢产物在铜绿假单胞菌感染中异常表达，服用芪归饮显著逆转。 此外，部分研究表明以下物质也可以抑制肠道内的假单胞菌属。 假单胞菌属相比于其它细菌引起人们广泛的研究兴趣，该属不仅包括人类病原体铜绿假单胞菌，还包括一系列与植物致病性、生物修复和环境微生物学相关的其他重要物种。 假单胞菌被广泛用作模型原型细菌，用于研究宿主-病原体相互作用、细胞-细胞通讯系统、进化生物学、基因调控和代谢网络、分泌系统、抗生素（耐药性）、生物修复、生物膜、细菌基因组学以及与微生物学和分子生物学广泛相关的许多其他主题。 假单胞菌属因其复杂的信号和调节系统，特别是细胞密度依赖性群体感应而被广泛研究。未来只有了解复杂调节回路中涉及的机制，才能确定新型抗菌方法的可能目标。铜绿假单胞菌中的锌、铁稳态是替代抗菌策略的一个有希望的目标。 由于其复杂性和适应性，它存在于无数的环境和临床生态位中，以及它在不同层面（种内、种间和与其宿主）相互作用的能力，假单胞菌属很可能在未来许多年内吸引更多研究人员。我们期待未来有更好的解决假单胞菌属，尤其人类病原体铜绿假单胞菌的抗菌策略。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                  微生物药品生产企业无菌检验实验室调研报告！ 百欧博伟生物：无菌检验是无菌药品出厂检验项目中关键项目之一，无菌检验方法的应用可全面掌握测定方法，准确检测方法的有效性，并适用于试验样品的检验，有利于企业对药品的质量控制，确保药品安全。 而检验涉及的操作人员、设施、设备、菌种、培养基等因素会直接影响无菌检验结果的可靠性。系统的、大范围的对制药企业的无菌检验实验室进行调研，旨在了解制药企业无菌检验实验室的日常运行情况和当前存在的实际问题，对于促进制药企业加强质量管理、改进质量检验工作、降低被污染产品投放市场的风险、确保公众用药安全具有十分重要的现实意义。调研结果对于管理部门制定相关法规、起草检查指南以及检查员的现场检查等也具有参考意义。 国家食品药品监督管理总局食品药品审核查验中心于2014年组织上海市食品药品监督管理局认证审评中心、北京市药品监督管理局药品认证管理中心、河北省食品药品监督管理局药品审评认证中心、辽宁省药品认证中心、江苏省食品药品监督管理局认证审评中心、安徽省食品药品审评认证中心、河南省药品审评认证中心、广东省食品药品监督管理局审评认证中心8个省级药品认证检查机构，对辖区内95家无菌药品生产企业的无菌检验实验室运行情况进行调研。调研的牵头单位为上海市食品药品监督管理局认证审评中心，调研内容涉及人员和培训、培养基的管理、菌种的管理、实验室的布局和运行、主要设备、文件、实验操作等7个方面，全面了解企业无菌检查用实验室的实际工作情况和运行现状。 一、调研基本情况 北京、河北、辽宁、上海、江苏、河南省(市）认证中心按照企业的生产规模各选取10家企业；安徽省认证中心对省内26家无菌药品生产企业全部进行了调研；广东省认证中心是通过随机抽取的方式从广州、深圳、珠海三市的药品生产企业数据库中抽取9家参研企业。95家无菌药品生产企业的企业性质包括国有、民营、外商独资、合资、股份制等，覆盖生物制品、疫苗、粉针剂、冻干粉针剂、小容量注射剂、大容量注射剂、无菌原料药、滴眼剂。调研采取现场检查配合书面汇总的形式，各调研参加单位抽调富有经验的药品GMP检查员1〜3名和微生物学专家组成调研小组，对每家企业调研1〜2天。现场检查采用事先通知或不通知的方式进行，采集的数据真实可信，调研结果能够反映我国无菌药品生产企业无菌检验实验室日常运行的现状。 二、结果和讨论 1、人员和培训 95家参研企业中各企业的实验室人员总数占其所有直接从事药品生产人员总数（含生产、质保、物流等非销售岗位）的比例为0.3%〜21%，从事无菌检验的人员人数为2〜29人，从事无菌检验工作0.5〜30年。多数从事无菌检验的人员具有大专或本科学历，并具备微生物学或相近专业的知识背景。 从事无菌检验的人员经过相关培训和考核，包括各地药品检验所、药监部门、制药行业相关团体组织、公司内部等举行的培训，培训内容包括微生物检测技术、无菌检查法、菌种管理及操作、培养基配制及灭菌、药典、药品GMP等内容。检验人员、实验室管理人员和质量保证人员对实验数据审批分工明确，职责清楚。 调研结果也显示，个别企业的质量保证人员对于无菌检测知识掌握不全面，实验管理人员对于偏差调查分析的能力不够；部分企业个别上岗时间较短的操作人员检验操作不规范；部分企业对培训效果未进行考核。 2、培养基的管理 有93家参研企业无菌检查用培养基为硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基等，符合《中国药典》要求。有2家外资企业用硫乙醇酸盐流体培养基检查细菌，根据《美国药典》或《欧洲药典》的要求用大豆酪蛋白消化肉汤或肉汤营养培养液(TSB)检查霉菌，与我国药典要求不同，但与《中国药典》规定方法进行过比较试验。 95家参研企业中，有3家企业对培养基供应商进行了质量评估，5家企业对培养基供应商的书面材料进行审查或核对培养基检验报告。绝大多数参研企业未对培养基供应商进行质量评估。 培养基配制和灭菌能按培养基使用说明书要求进行并有记录，但只有部分企业对培养基的灭菌程序进行了验证；近半数企业在培养基配制灭菌后未按药典要求测pH值；10%的企业每次配制培养基都做灵敏度检查，半数企业只对脱水培养基做灵敏度检查，部分企业不做培养基灵敏度检查；有1家企业未按规定条件贮藏培养基；部分企业配制灭菌后的培养基外包装的标记信息不全面。 3、菌种的管理 参研企业无菌检验使用的标准菌株包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、生胞梭菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，符合《中国药典》要求,标准菌株主要来源于认可的国内或国外菌种保藏机构如中国食品药品检定研究院、中国医学细菌菌种保藏管理中心、ATCC等。 90%的企业工作菌株的传代次数和贮存方法、条件（斜面、甘油管等）基本符合要求。每支菌种均标注有名称、标准号、接种日期、传代数。有10%的企业在菌种传代过程中做菌落表面形态特征观察及革兰氏染色镜检观察，有1家企业每年用细菌鉴定仪（vitek)对标准菌株进行鉴定。 40%的企业不能提供菌种的来源证明；90%的企业在菌株定期转种、传代过程中未对纯度、特性等关键指标进行确认，也未制定相关程序；20%的企业菌种管理内容不够全面，无法追溯；1家企业从标准菌株传代至工作菌株的操作过程未严格按照相应标准操作规程（SOP)进行操作和记录，代次划分不正确；1家生物制品企业无标准菌株。 4、实验室的布局和运行 实验室包括有检验（无菌检查）用洁净室或隔离系统及阳性菌实验室、培养区、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和储存区、菌种贮存区。 无菌检验实验室和阳性菌实验室的设置一般采用3种方式： （1)无菌检验实验室、微生物限度检查室和阳性菌实验室三室分开，各自采用专用的空气净化系统和独立的人、物流，均在万级背景下的超净工作台或生物安全柜中进行相关操作； （2)无菌检验实验室、微生物限度检查室和阳性对照室三室分开，共用一套空气净化系统、人流，阳性菌实验室空气直排，均在万级背景下的超净台下或生物安全柜进行相关操作； （3)无菌检验实验室与微生物限度检查室二室分开，共用一套空气净化系统，在1万级背景下的超净台或生物安全柜中进行相关操作，阳性菌实验室为在非洁净区内单独实验室的生物安全柜内进行。 1家企业无菌检验试验室单独用一套隔离器系统，4家企业的无菌检验试验室为B级背景下局部百级，1家企业无菌检验试验室为10万级背景下局部百级。50%的企业无菌检查用洁净区空调净化系统连续开启。企业参照生产用洁净区的要求完成了有关的验证和确认工作，无菌检查用洁净区符合药品GMP的要求。 90%的企业无菌检验室的人流、物流通道能够严格区分，并制定相应控制程序。无菌检验人员经二次更衣后进入无菌检验实验室，试验样品均经消毒剂擦拭或紫外灯照射或两者并用后进人无菌检查实验室。 少数企业存在无菌实验室面积偏小、设施不能完全满足要求、设备摆放不合理等现象。 5、主要设备 参研企业无菌培养基的配制、培养等设施与检验工作量基本相匹配；均对培养基、器具灭菌设备、培养箱相关的计量器具按规定进行了校准并有标识。80%的企业对培养基的灭菌设备进行确认和验证，其中，有10%的企业对灭菌设备进行验证时只使用了生物指示剂，但没有连续监测温度。80%的培养基灭菌设备有自动温度控制探头但无自动记录温度的装置。80%的企业培养箱（室）有温度自动控制装置，近半数企业进行培养箱温度分布均匀性验证；90%的企业培养温度每天定时观测和记录，10%的企业培养箱（室）有连续监测温度的装置。 6、文件 80%的企业能按无菌产品品种的无菌检验方法进行验证，并根据验证结果制定无菌检验的操作规程。80%的企业无菌检验记录内容能包含关键的实验细节，数据基本完整。10%的企业无菌检验记录不及时，无菌检验原始记录未包括偏差记录、设备编号、检验规程的编号、培养基信息、阳性菌的配制等。 文件记录以及实验室数据对于无菌检验实验室的质量管理具有重要的意义。通过对实验室原始数据及实验规程、方法和设备（包括其维护和校准）以及方法验证数据的考察，可以对实验室运作的全面情况、实验人员的技术能力和全面质量控制的过程有一个整体的评价。 7、实验操作 参研企业均制定了进人无菌检查实验室的人员的更衣程序；物料、样品经擦拭消毒后进人传递窗，并在传递窗内经紫外消毒后传人无菌室；无菌检验的样品量符合药典的要求；部分企业建立了无菌检查试验超标结果的调查处理标准操作规程，对无菌检验结果若出现阳性后所进行的相关调查、复试的依据、产品的无菌性评价以及成品的放行等均进行了规定。 个别企业上岗时间较短的操作人员，检验操作存在不规范之处；1家企业未按品种进行无菌检验方法学验证；1家企业虽进行了产品无菌检验方法学验证，但验证中的样品取样量不正确；3家企业未按药典要求做阳性菌对照试验和阴性对照试验；约10%的企业只做阴性对照而不做阳性对照试验，这多为生物制品生产企业；约20%的企业对超标结果未进行系统的分析和记录；个别企业出现阳性结果后未做调查分析就进行复试；近半数企业空气净化系统不连续开启，也未对自净时间进行确认；个别企业在进行无菌试验时未对试验环境进行动态监测，20%的企业只对超净工作台或生物安全柜进行动态监测而不对1万级背景区进行动态监测。 三、调研结论及建议 参研企业无菌检查实验室的布局与设计充分考虑到了防止微生物污染和生物安全的要求，检验用试验菌来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，从事无菌检查的人员基本具备微生物学或相近的专业知识教育背景，能按照药品GMP及相关法规的要求对无菌药品进行无菌检验，产品的无菌检验记录包含了关键的实验细节。部分被调研企业在人员的专业知识及操作技能、菌种及培养基的管理、设施设备验证、对无菌检验环境监测等方面存在缺陷，个别企业在菌种传代、无菌试验复试、阳性对照试验等方面还存在问题。综上，提出建议如下： 1、由于部分参研企业对员工的培训还流于形式，培训效果不理想，质量保证人员对无菌检验知识掌握不全面，个别管理人员对于偏差调查分析的能力不足。因此，药品生产企业应组织实验室全体人员进行理论学习，明确无菌实验室工作原理、环境要求，设置严格的工作流程，明确分工并强化责任技师有效的合作配合意识。同时，应制定不同岗位人员的有针对性的培训计划并组织实施和考核，考核不合格者不得上岗。检查机构在对药品生产企业进行检查时，除了核对人员的资质外，应注重对无菌检查人员的专业知识、实际操作技能及分析和解决问题的能力进行检查。 2、针对部分企业在菌种及培养基采购、管理及使用过程中存在不规范之处，大部分企业不知道在菌株定期转种、传代过程中对其纯度、特性等关键指标进行确认的必要性，个别企业甚至出现菌种传代代次划分不正确的情况，建议制定药品无菌检验、菌种管理、培养基管理的指导原则，指导制药企业加强和规范对菌种、培养基的管理，使无菌检验更规范。应强化监管力度，尽快实行培养基的准人制度。对生产培养基的厂家进行认证，尤其对生产无菌试验培养基的厂家实行生产许可证制度，避免市场混乱无序。 3、部分企业在出现无菌试验结果超标时，未严格按《中国药典》和药品GMP的要求进行必要的调查和分析就进行复试，存在风险。多数企业在发现无菌产品被污染时，缺乏对污染菌进行鉴别的条件和经验。建议企业配置必要的设施和人员，对无菌检验检出的污染菌及检验环境中的检出菌进行分析和记录，不断积累数据，了解环境中微生物的分布状况。 4、不同地区制药企业无菌检验实验室、微生物限度检查实验室、阳性菌实验室的设置和布局存在较大差异，且对检测环境监测的频次、取样时间、取样点布置等方面各企业都不尽相同。多数企业只动态检测沉降菌，对浮游菌、操作人员手指、工作服表面、工作台面不做监测。企业应根据药品GMP(2010年修订）及《中国药典》（2010年版)的要求，改进无菌实验室布局，制定适合的环境监测计划。针对多数生物制品企业在无菌检验时没有进行阳性对照实验的情况，企业应根据《中国药典》（2010年版)的要求设置阳性对照实验室并按要求进行阳性对照实验。建议在对生物制品企业进行监督检查时，将阳性对照实验作为重点检查的内容。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                微生物奇兵：胶质芽孢杆菌在环境修复中的神奇应用！ 百欧博伟生物：如今，面临着日益严峻的环境问题，我们迫切需要寻找更可持续和生态友好的方式来修复受损的生态系统。在近年来的研究中，胶质芽孢杆菌作为一种潜在的环境修复工具引起了广泛的关注。 一、胶质芽孢杆菌的特性 胶质芽孢杆菌是一种常见的土壤中的细菌，具有多样性和适应性强的特点。 二、胶质芽孢杆菌的主要功能 （一）生物降解能力 胶质芽孢杆菌可以降解多种有机污染物，包括石油类化合物、农药、重金属等，将其转化为无害的物质。 （二）土壤修复中的应用 1、污染土壤的修复：胶质芽孢杆菌能够降解和吸收土壤中的有毒物质，提高土壤质量，恢复土壤的肥力和生物多样性。 2、重金属污染的治理：胶质芽孢杆菌对重金属具有很高的耐受性，可以吸附和沉淀重金属离子，减少其对生态系统的危害。 （三）水体修复中的应用 1、水体富营养化治理：胶质芽孢杆菌可以分解水体中的有机废物和营养盐，降低水体富营养化的风险，改善水质。 2、水中有毒物质的降解：胶质芽孢杆菌可以降解水中的有毒物质，如农药和工业废水中的有机化合物，减少它们对水环境和生物的影响。 （四）植被恢复和土壤保持 胶质芽孢杆菌在植被恢复项目中扮演重要角色。它能够与植物根系形成共生关系，提供营养物质和促进植物生长。这对于受损植被的恢复以及土壤保持至关重要。胶质芽孢杆菌能够增加土壤有机质含量，改善土壤结构，并提供有利于植物生长的土壤微环境。 （五）塑料降解的潜力 近年来，塑料污染已成为世界范围内的一大问题。胶质芽孢杆菌被发现具有降解塑料的潜力。研究人员发现，胶质芽孢杆菌能够降解聚合物类塑料，如聚乙烯、聚丙烯等。这为解决塑料污染问题提供了希望，但需要进一步的研究来优化该过程，并解决应用上的挑战。 三、胶质芽孢杆菌的优势和挑战 胶质芽孢杆菌作为环境修复的工具具有以下优势： 1、生态友好：胶质芽孢杆菌是自然存在的微生物，不会对环境产生新的污染。 2、适应性强：胶质芽孢杆菌对不同环境条件具有适应性，能够在不同的环境中生存和繁殖。 然而，胶质芽孢杆菌的应用还面临一些挑战，如其生存和繁殖的竞争力、合理的应用方式等，需要更多的研究和实践来解决。 胶质芽孢杆菌作为一种有潜力的环境修复工具，在环境修复中具有广阔的应用前景。它的降解能力、共生关系形成能力以及对生态系统的积极影响，使其成为一种有潜力的环境修复工具。然而，胶质芽孢杆菌的应用还需要进一步的研究和实践，以解决挑战并优化其应用效果。我们对胶质芽孢杆菌的不断深入了解，将为环境修复提供更可持续和生态友好的解决方案，为我们的地球保护和可持续发展做出贡献。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞的培养操作及应用！ 一、背景 RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）是一种源自小鼠的白血病细胞系，常用于生物学和医学研究。这种细胞系是从患有单核细胞白血病的雄性小鼠的脾脏中分离出来的，并经过连续传代培养而形成的。RAW 264.7细胞具有巨噬细胞的特性，如吞噬作用、抗原提呈和产生细胞因子等。 由于RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞易于培养和操作，且表现出与原发性巨噬细胞相似的功能，因此被广泛用作研究巨噬细胞功能和生物学特性的模型。这些细胞常被用于研究炎症、感染、免疫应答、细胞信号转导、药物筛选等领域。 在细胞培养方面，RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞通常需要在含有DMEM（杜氏改良Eagle培养基）或RPMI 1640培养基的培养瓶中培养，同时添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的抗生素-抗真菌混合物以维持细胞生长并防止污染。这些细胞通常在37°C、5%CO2的湿润环境中生长。 RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞还可以用于研究各种刺激物（如细菌、病毒、寄生虫、细胞因子等）对巨噬细胞的影响，以及巨噬细胞在免疫反应中的作用。此外，这些细胞也被广泛用于药物筛选和毒理学研究，以评估药物对巨噬细胞功能和生存能力的影响。 二、RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）培养操作 1)复苏RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。 将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2)RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。 b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。 d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。 3)RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。 下面T25瓶为例； a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。 b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。 c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。 三、应用 RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）可以用于酿酒酵母β-葡聚糖对RAW264.7细胞氧化应激、炎症和凋亡的缓解作用及机制： 利用LPS诱导RAW264.7细胞建立氧化应激和炎症反应模型,初步证实酿酒酵母β-葡聚糖的抗氧化作用。然后,在氧化应激模型基础上,探究酿酒酵母β-葡聚糖对RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞抗氧化、抗炎及抗凋亡的分子作用机制,为预防和治疗氧化应激相关性疾病提供新的思路。本研究主要从细胞信号通路转导方面对酿酒酵母β-葡聚糖抗氧化、抗炎和抗凋亡作用机制进行研究。 结果如下： (1)试验一以LPS为诱导物,氧化应激和促炎细胞因子作为建立氧化应激和炎症模型指标,探究LPS对RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化损伤效果。结果表明:0.1～5μg/m L LPS处理RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞12 h后,细胞内氧化应激指标MDA和ROS产生显著增多,抗氧化指标SOD、CAT和GSH-Px酶活性显著降低;细胞培养上清液中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α释放显著增多,细胞内COX-2和i NOS含量显著升高。综合多项指标,以1μg/m L LPS作为建立细胞氧化应激和炎症模型的最佳浓度。 (2)试验二在试验一基础上,初步探讨酿酒酵母β-葡聚糖对LPS诱导的RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化应激和炎症损伤的缓解作用。 结果表明：酿酒酵母β-葡聚糖增强抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO活性,抑制LPS诱导的MDA和ROS产生而发挥抗氧化作用,降低IL-1β、IL-6和TNF-α的释放以及COX-2和i NOS水平而起到抗炎效果,推测可能是酿酒酵母β-葡聚糖激活抗氧化转录因子从而发挥预保护作用。这些结果充分说明β-葡聚糖具有抗氧化和抗炎的双重调节作用,从而抑制细胞内ROS产生,进而对RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞起到保护作用。但其调控抗氧化和抗炎信号转导机制仍需在氧化应激模型中进一步验证。 (3)试验三以试验二为基础进行深入性研究,本试验旨在探讨β-葡聚糖抑制LPS诱导的RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化应激分子机制。为阐明β-葡聚糖抗氧化的分子机制,我们设计了β-葡聚糖添加试验,结果表明:β-葡聚糖能够激活其受体Dectin-1介导的Nrf2/HO-1信号转导通路。氧化应激模型中,在LPS抑制Nrf2和HO-1表达的条件下,β-葡聚糖能显著上调LPS诱导的Dectin-1、Nrf2和HO-1的表达,抑制ROS产生,但β-葡聚糖这些作用可被Dectin-1抑制剂Laminarin、Nrf2抑制剂ML385和HO-1抑制剂Sn PP逆转。该结果表明β-葡聚糖可以通过Dectin-1/Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化应激。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                 人诱导多能干细胞（IPSC）培养体系常见问题及解答！ 人诱导多能干细胞（iPSC）培养体系是一个为体外培养无滋养层放入人诱导多能干细胞（iPSC）完全培养基方案。本体系是一个无菌的液体混合系统，其化学成分明确，无动物蛋白成分。本体系是一种按固定配方配制的液态培养体系，可以为体外培养的人iPSC提供一个确定适宜的平衡营养环境，并且可以选择性的促进未分化细胞的生长，而分化的细胞的则无法再培养体系中生长；从而选择性的只扩增未分化的人iPSC。 产品信息平台编号：Bio-121972 规格：500mL 细胞名称：人诱导多能干细胞（IPSC）培养体系ips细胞基础培养基规格：500mL储存条件：基础培养基2~8℃，ips细胞培养添加剂规格：20ml储存条件：添加剂-80~-20℃；混匀后2~8℃，2-3周内使用完毕。用途：Ips细胞专用培养基注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 产品简介iPS细胞培养基是一种适用于无饲养层培养、化学成分明确、并且不含动物源蛋白的人多潜能干细胞（hESC/hiPSC）完全培养基。iPS细胞培养基是在James Thomson实验室开发的Essential 8培养基的基础上，由本公司改良研发出的最新型多潜能干细胞完全培养基。hESC/hiPSC在iPS细胞培养基中可以快速增殖，而分化的细胞则无法在该培养基中生长，从而选择性扩增并获得高纯度多潜能干细胞。 试剂准备iPS细胞完全培养基：将iPS细胞添加剂加入iPS细胞基础培养基中形成iPS细胞完全培养基（推荐每2mL添加剂与50mL基础培养基混合）。iPS细胞完全培养基可在2-8℃稳定储存2-3周。 疑难解答1、是否还需要往iPS细胞完全培养基中补充或添加成分？不需要。iPS细胞培养基中各个成分的质量和浓度都经过了最优化实验，完全支持人ESC/iPSC的长期培养，您无需再自行添加。2、培养基中有沉淀状物质是否是质量问题？添加剂在解冻过程中，若有少量沉淀析出，属于正常现象，不影响使用，请充分混匀后与基础培养基混合。但添加剂不能在37℃解冻，否则会析出大量沉淀，影响培养基的效价。如果培养基中出现大量沉淀，请不要使用。3、是否能在37℃反复水浴iPS细胞完全培养基？不能。频繁地在4℃和37℃之间转换会导致iPS细胞完全培养基中含有的因子失活，iPS细胞完全培养基在使用前平衡至室温即可。4、iPS细胞在传代后不贴壁怎么解决？造成iPS传代后不贴壁的最可能的原因：①细胞消化时间不合适；②消化后吹打次数不合适，使得完成传代后细胞集落过大或过小。5、iPS分化怎么处理？①细胞在刚复苏或传代时，小的细胞团不呈现标准的克隆形态，培养几天或传代后可恢复。②如果iPS分化的表现为干细胞克隆形态良好，克隆周边出现散在的分化细胞，可通过高比例传代（≥1:10），使得分化细胞的密度减少，低密度的分化细胞可被iPS培养体系筛选去除，如未完全去除，可用细胞刮或巴斯德管刮除。③如果iPS分化的表现为克隆内部松散，边缘不平滑，在分化比例小或分化不严重的情况下，可通过连续传代2~3次恢复，如果分化严重，建议弃除。6、细胞复苏率低是什么原因？细胞复苏需使用iPS细胞复苏培养基，可大大提高细胞的复苏效率。复苏过程中，转移细胞、吹打混匀和重悬细胞时，吹打力度要轻柔，并尽量减少吹打次数，细胞接种后，即刻在显微镜下观察细胞团块的大小，4~10个细胞的团块为最佳。如果吹打力度过大或次数过多，导致细胞分散成单细胞，细胞复苏率将偏低。 细胞复苏1、首先开启复苏添加剂小瓶上的铝盖，并用酒精棉擦拭其表面，使用注射器吸取5mL复苏基础培养基加入到瓶中，颠倒混匀。2、将复苏添加剂和复苏基础液按照0.5mL：10mL的比例混匀，配置后的复苏CM培养基保存4℃（可保存2周，可根据试剂用量将 添加剂分装保存于-80℃，避免反复冻融）。3、37℃水浴中，迅速解冻细胞，用酒精棉擦拭，转移至无菌操作台中。4、将细胞悬浮液转移至含有5mL复苏CM培养基的15mL离心管中 200g离心5min。5、弃上清，加入适量复苏CM培养基，轻柔重悬细胞，接种到包被 好的培养瓶中。6、水平十字摇匀，室温放置15min.显微镜下观察大部分细胞贴壁后 ，放入5%CO 的37℃培养箱中。7、培养24h后，弃掉复苏CM培养基，加入新鲜的干细胞CM培养基 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                  平板接种方法之平板划线和平板倾注及平板涂布！ 一、平板划线 平板划线的操作是为了将菌稀释从而获得纯培养的单菌落。划线有多种方式。 1、三区平板划线 三区划线中第一区所占的区域大约是平板面积的五分之一到四分之一。第二区搭过第一区的面积使微生物数量得到“稀释”，第三区搭过第二区的面积使微生物数量进一步“稀释”，第三区不可与第一区有重叠的划线。一般适用于可疑菌落的分离，或可疑菌落的二次平板分离。通常划完三区后就可以出现单菌落。 2、四区平板划线 四区平板划线与上面的三区划线类似，只是每一区的划线面积相应减小，同样第三区不可与第一区相重叠，第四区不可与第二区和第一区相重叠，四区划线比三区划线多稀释一次，这样通过增加划线区域，有可能会分离到更多更纯的单菌落。 3、单次连续“之”字平板划线 其实在微生物划线接种中，无论是试管斜面划线接种还是平板划线接种，都会用到“之”字划线。“之”字划线的要领是：往复不间断划线，但是又不与划过的路线重复或重叠。如果菌量比较大，就可以划得更为密集或者增加一块平板继续“之”字划线（即连续划两块板）。“之”字划线一般适用于分离本身在此培养基上单一且黏性较大的菌类或可疑菌落的纯培养。 4、网状平板划线 网状平板花线，其实就是两次方向垂直的“之”字划线重叠在一起，一般用于纯培养，目的是通过增加更多的划线路径来获得更多的纯培养物，特别是针对一些生长较慢或菌落非常细小的菌类。 在以上的这些平板划线的方式中，三区平板划线最常用的是分区划线法，详细操作步骤如下： ①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种还环烧红。 ②在火焰旁冷却接种换环，打开试管塞。 ③将试管口通过火焰，旋转试管口并小幅度来回移动试管，切不可长时间让试管口停滞于火焰上加热。 ④将已冷却的接种环伸入菌液中，挑取一环菌液。 ⑤将试管口通过火焰几次后，塞上试管塞。将试管放回试管架。 ⑥左手拿起培养皿，将培养皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌液的接种环迅速深入平皿内。从平皿边缘开始“之”字划线（基准线也称第一区域），大约划过平皿的五分之一到四分之一左右的面积。关闭培养皿盖，将培养皿调转大约120°。再次灼烧接种环，将接种环在空气中或靠在培养皿盖内侧冷却后从第一区域末端开始往第二区内划线。两个区域划线的交角大约是120°。重复以上动作，完成第三区（甚至第四区）划线操作。注意：当前操作的划线只能与相邻前一区域相交，绝不能与其他区域的划线有重叠。 一般三区划线就能分离出单菌落，理想的三区分区划线平板培养后的结果见下图。第一区和第二区前部的细菌生长成“直线”，第二区后部的细菌生长呈“虚线”。第三区呈“虚线”和离散的“小点”（即单菌落）。 二、平板倾注 平板倾注接种的步骤具体操作如下： 1、先在酒精灯火焰旁打开无菌空平皿，注意开启幅度不宜过大，加入一定量的样液。 2、按“倒平板”的步骤加入培养基（注意培养基要水浴保温在46°左右，温度太低，培养基容易凝固，温度太高容易烫伤细菌）。 3、将平皿盖上盖。在桌面划圆圈滑动，幅度不要太大以免培养基洒漏或溅到平皿皿盖。混合均匀后，将平皿置于桌面，待平皿凝固后，翻转平皿堆叠放于培养箱中培养。有时还会在凝固的培养基表面再倒一层培养基，防止蔓延菌落的出现。 三、平板涂布 平板涂布是将少量（通常0.2mL~0.5mL）系列稀释的菌液涂布在预先倾注好的固体培养基上，靠涂布棒在琼脂表面均匀铺开，培养后获得菌落个数的一种计数技术。 平板涂布的操作如下： 1、无菌移取一定量样液于平皿固体培养基中央。 2、玻璃涂布棒蘸取酒精。注意始终保持涂布棒的涂布一端向下，并且涂布棒上的酒精既要覆盖全部即将深入平皿的部位又不能滴淌。 3、通过酒精灯火焰点燃。一定注意防止酒精倒流或溅溢引燃物品或烧到手。 4、左手将皿盖在酒精灯火焰旁边打开一个缝隙，右手将灼烧过的涂布棒涂布一端靠在皿盖上冷却。冷却后将平皿盖开大一些，用涂布棒刮样液在培养基表面均匀涂布开。涂布的时候，涂布棒不能触碰平皿内侧边缘。如果有条件，涂布过程应将平皿置于旋转的涂布台上。 5、涂布棒再次蘸取酒精，通过火焰点燃灭菌。 6、待平皿表面液体晾干后，翻转平皿，置于培养箱培养。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有Biolog微生物鉴定系统，超低温冰箱，生物安全柜等仪器设备可进行对微生物分离、鉴定等常规的分子实验研究。对我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展的需求进行积极的面对社会乃至国外收集保藏提供微生物菌种资源。在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供微生物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。 除此之外，我们还拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                    柱孢绿僵菌的培养特性与繁殖方式及主要用途！ 柱孢绿僵菌(Metarhizium cylindrosporae)是蝉成虫流行病的主要病原。该菌是一种虫生真菌，有望成为无公害的杀虫农药。 一、菌种简介平台编号：Bio-33052 规格：培养物拉丁属名：Metarhizium Cylindrosporae 中文名称：柱孢绿僵菌拉丁属名：Metarhizium种名加词：cylindrosporae Q. T. Chen & H. L. Guo收藏时间*：2006-6-23来源历史：日本森林综合研究所转福建省林业科学研究院原产国：日本资源归类编码：15151916103模式菌株：非模式菌株主要用途：研究；教学具体用途：生物防治生物危害程度：四类致病对象：动物分离基物：大褐蜩采集地区：口永良部岛培养基信息：培养基编号: -- 培养基名称: SDAY培养温度：25资源保护类型：培养物保藏方法：定期移植法共享方式：资源交换性共享提供形式：斜面培养物实物状态：有实物用途：生物防治 注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、菌属特征菌落初期白色，茸状。产孢阶段菌落中间呈一丛丛具不同程度绿色的分生孢子堆。菌落颜色由绿色变灰绿直至黑色或保持其原来绿色，或者呈翡翠绿色。基质反面色泽呈淡褐色，少数菌种可呈赭色。分生孢子梗单生或聚集，呈分生孢子梗座，紧密排列，帚状分枝或轮生体。帚状枝层次不复杂，1-2层，其顶端分枝，末端为瓶状小梗，以向基式产生分生孢子。分生孢子单细胞，链状连接。分生孢子以粘液粘成平行排列的柱状孢子链柱，老培养体柱状孢子链柱溃散为菱形或其他不规则形状的分生孢子团块。分生孢子长形互长椭圆形，无色，成雄时呈淡绿色至橄榄绿色，形体一般较青霉属孢子为大。本属系昆虫寄生菌。 本属菌应同时具有下列五方面特征：（1）菌落初期白色，产孢子阶段呈不同程度绿色；（2）分生孢子梗单生或者聚集，呈分生孢子梗座；（3）分生孢子以粘液粘成平行排列的柱状孢子团块；（4）分生孢子长形至长椭圆形；（5）属于昆虫寄生菌。  三、培养特性发育的最适温度约24℃-26℃之间，在10℃-30℃之间仍可正常发育；分生孢子一般在60℃左右即能很快丧失发芽能力。此菌在pH4.7-10之间可以正常发育，但最适pH为6.9-7.4。虽然绿僵菌可以在无机培养基上生长，但培养基中含有机氮源比含无机氨源对它的生长更为适宜；绿僵菌对碳源则无特殊需要。在干燥情况下绿菌的分生孢子可以保存3年以上。  四、繁殖方式虫菌体以裂殖和芽殖繁殖。  五、分布区域大多分布在热带和亚热带地区。 金龟子绿僵菌为世界分布的广谱性虫生真菌。  六、下属品种2009年Bischoff等对绿僵菌分类地位进行了研究，绿僵菌属共含12个种，分别为金龟子绿僵菌（M. anisopliae）、黄绿绿僵（M. flavoviride）、白色绿僵菌（M. ablum）、棕色绿僵菌（M. brunneum）、贵州绿僵菌（M. guizhouense）、平沙绿僵菌（M. pingshaense）、柱孢绿僵菌（M. cylindrosporum）、蝗绿僵菌（M. acridum）、大孢绿僵菌（M. majus）、耐寒绿僵菌（M. frigidum）、鳞翅目绿僵菌（M. lepidiotae）和球孢绿僵菌（M. globosum）。其中黄绿绿僵菌又包括4个变种，即黄绿绿僵菌小孢变种（M. f. minus）、黄绿绿僵菌大孢变种（M. f. flavoviride）、黄绿绿僵菌新西兰变种（M. f. novazealandicum）和黄绿绿僵菌瘿绵蚜变种（M. f. pemphogum）。 1、白色绿僵菌白色绿僵菌（Metarhizium ablum Petch）分生孢子拟卵形或椭圆形，菌落产孢前形成菌丝段（菌体）而不是由菌丝体组成的膨大团块，孢子灰棕色。该菌是叶蝉的专性寄生菌。 2、金龟子绿僵菌金龟子绿僵菌（ Metarhizium anisopliae Sorokin）在PDA培养基及察氏培养基上菌落绒毛状至棉絮状，初为白色，产孢时橄榄绿色。菌丝具分隔和分枝，透明，直径为15-20μm，分生孢子梗很难与菌丝区别，直径约2pm，其末端产生瓶形小梗，（8-16）μm×（1.5-2.2）μm。从瓶梗的末端以向基式连续形成长串链的分生孢子。分生孢子单细胞，长椭圆形到圆柱形，两端钝截形或钝圆，大小变化较大，（5-9）μm×（2-4.5）μm。单个存在时色亮，成堆时成橄榄绿色，脱落的孢子常聚成菱形孢子团状或壳状结构。 Tulloch将该菌分为两个变种，即小孢变种和大孢变种。小孢变种即原变种分生孢子小，（5-8）μm×（3-4）pm，世界性分布，寄主广泛，至少寄生8个目200余种昆虫及一些螨类和线虫。在生物防治中具有重要价值，已开发为真菌杀虫剂，并已在巴西等国家注册。大孢变种分生孢子大，（10-16）rm×（3-4）μm，较少见，寄主范围较窄。 3、黄绿绿僵菌黄绿绿僵菌（ Metarhizium flavoviride）在察氏培养基上，菌落呈黄绿色，培养2周菌落直径达55mm。分生孢子梗疏松轮状分枝，其上着生1-2个瓶梗，瓶梗杆状，顶部尖，大小为（7.2-12.5）μm×（1.8-3.0）μm。分生孢子单胞，卵圆形，具不同的端部，大小为（7.2-9.3）μm×（3-4）μm，在瓶梗上形成向基性的链。  七、感染过程绿僵菌对寄主昆虫的感染与其它虫菌基本上相同。绿僵菌的分生孢子很容易附着于寄主昆虫皮肤的节间处，当遇到适宜的温湿度，分生孢子即行萌发，产生芽管，并形成菌丝。菌丝可分泌能够溶解几丁质的酶，溶解昆虫体壁。并借助菌对寄主侵入产生的压力，使菌丝侵入寄主的表皮，进而逐步向内侵染，侵入昆虫的脂肪组织和肌肉。菌丝在昆虫体内繁殖，进而导致昆虫死亡。当寄主昆虫被绿僵菌初感时，在体壁可见到黄褐色的斑点，由于受到绿僵菌毒素的作用，昆虫开始表现神经系统障碍的现象。幼虫取食停止，对刺激的反应降低，最终死亡。死亡后的尸体僵化，虫体内的菌丝开始向体外伸延，虫尸很快被一层白色菌丝所包被，之后一、二日，在菌丝上形成分生孢子梗和分生孢子，则变为绿色或暗绿色。  八、主要用途绿僵菌寄主范围广，可寄生8目30科200余种害虫。主要用于防治金龟子、象甲、金针虫、蛾蝶幼虫、蝽和蚜虫等害虫。绿僵菌有金龟绿僵菌和黄绿绿僵菌等变种，生产上主要用金龟绿僵菌变种的制剂来防治害虫，如地下害虫、蛀干害虫、桃小食心虫、椰心叶甲、飞蝗、甘蓝小菜蛾、菜青虫和番茄棉铃虫，以及小水体中的蚊幼虫孑孓等卫生性害虫。生产上常用剂型有粉剂（每克含孢量23亿-28亿个或50亿以上）、10%颗粒剂和20%杀蝗绿僵菌油悬浮剂。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

                  活泼微球菌的培养条件与培养方法及注意事项！ 活泼微球菌为革兰氏染色阳性、接触酶阳性、好氧或兼性厌氧的球状细菌。具呼吸的化能异养菌，从糖常产少量酸或不产酸。通常生长在简单的培养基上。 一、菌种简介平台编号：Bio-34382 规格：培养物 拉丁属名：Arthrobacter Agilis 中文名称：活泼微球菌拉丁属名：Arthrobacter种名加词：agilis (Ali-Cohen ) Koch et al.收藏时间*：2011-5-5原产国：中国资源归类编码：15131128102模式菌株：非模式菌株主要用途：研究；教学生物危害程度：四类致病对象：无分离基物：杨树干树皮采集地区：河南濮阳清丰采集具体地点：107、中林47杨混交林    培养基信息：培养基编号: 2 培养基名称: 营养肉汁琼脂培养温度：30资源保护类型：培养物保藏方法：液氮超低温冻结法；真空冷冻干燥法共享方式：公益性共享提供形式：斜面培养物实物状态：有实物用途：研究注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、产品优势1、产品质量稳定，是为科研和生产提供微生物菌种资源共享服务的专业平台。2、国内首创封闭管包装，冻干后的菌株使用时添加配套的复苏培养基后迅速而完全溶解。针对不同的菌株提供八种不同的培养方法，保证菌种的复苏质量。3、严格的质检程序，确保产品质量的稳定性。4、该类产品广泛使用到食品、药品、化妆品、水产品、化工等行业，疾控中心、质检局、出入境、药检局等等，得到广泛好评。 三、培养条件 1、培养基：MRS培养基 2、培养基成分：酪白蛋白胨 10g 牛肉浸取物 10g 酵母提取液 5g葡萄糖20g 乙酸钠5g 柠檬酸二胺 2g 吐温80  1g 磷酸氢二钾 2g 七水硫酸镁 0.2g 七水硫酸锰0.05g 碳酸钙 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1L  pH 6.8  如果要配置液体培养基，则不用加入碳酸钙和琼脂。3、培养温度：37℃4、培养时间：48h 四、菌种的培养1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。 五、注意事项1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，参照“开管说明”，用无菌吸管吸取 0.3ml的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支平板或者斜面）；2）经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间； 若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；3）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；4）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；5）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；6）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。7）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理；8）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                 ATCC 28485巴斯德驹形氏酵母的培养与使用方法！ 巴斯德驹形氏酵母是Komagataella属的微生物，原产地为法国。曾用名Zygosaccharomyces pastoris，子囊菌门，酵母菌纲，酵母目。主要用途为分类学研究，具体用途为模式菌株。 一、菌种简介平台编号：Bio-07258 提供形式：冻干物拉丁属名：Komagataella Pastoris 中文译名：巴斯德驹形氏酵母拉丁学名：Komagataella pastoris原始编号：CBS 704菌株来源：←CBS保藏人：白逢彦直接来源国家：荷兰保藏时间：9/21/2004其他保藏编号：=ATCC 28485 =BCRC 21531 =JCM 3650 =NCYC 175 =DSM 70382生物危害：四类模式菌株：模式菌株菌株用途：模式菌株培养温度：25℃培养基：0013    分离源：栗树分泌液采集国家：法国用途：模式菌株 注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 二、储存条件冻干菌种和试管斜面请置于 6-10冷藏。 三、培养条件0013 麦芽汁琼脂 I12Brix.麦芽汁 1.0 L 琼脂 15.0 g 自然 PH13 号培养基或用下列培养基代替葡萄糖 1% 蛋白胨 1% 酵母提取物 0.5% 琼脂 2% 四、使用范围（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，酿酒酵母菌组成成分，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，以常被采用。（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。 五、注意事项1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。2、菌种恢复培养前，建议将收到的菌种安瓿保存在 6-10°C 的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，如在说明建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成，有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种培养稳定后才能用于您的后续实验。3、初次使用时请严格按照本说明书推荐条件和操作步骤进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。4、恢复培养厌氧菌时，在操作过程中应严格控制厌氧条件：制作培养基时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养基中的氧气，使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。5、与菌种相关的其它信息请参阅微生物菌种查询网网站。 六、冻干管打管说明书1、安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂（应避免过多水蒸气影响菌种的复苏），用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。2、用无菌吸管吸取 0.3ml（建议勿超过 0.5ml）适宜的液体培养基(不添加琼脂)，滴入管内，轻轻振荡，待安瓿管内的菌体溶解呈悬浮状，在用无菌吸管吸取全部菌悬液接在 1-2 支建议的培养基试管中（不超过 2 支，中国微生物菌种查询网提供的培养基配方中有琼脂，请务必做成试管斜面，配方中没有琼脂，试管中液体培养基不超过 5ml），并在建议的条件下静止培养。3、冻干管打开后需一次用完，不能留存。另外，安瓿管内大部分是用牛奶做保护剂，里面菌体为少数，复苏时要全部菌悬液接在新鲜培养基上，否则可能造成复苏不成功。4、打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。5、打管操作应在烧杯或托盘上方进行，用完冻干管应灭菌处理后丢弃。6、菌种复苏时，请务必记录好菌种的编号和制备批号，否则不予售后。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

                     培养基原材料的生物学检验方法及检验指标！ 百欧博伟生物：生物学指标检验是营养类原材料最主要和最关键的指标,直接关系培养基的质量好坏。原材料生产厂家和培养基生产厂家都应重点进行检测。主要检测的指标有可发酵糖试验、H2S试验、靛基质(吲哚)试验、V-Р试验、生长试验、色素试验、菌落总数检测和耐热芽孢杆菌总数等。 1、可发酵糖试验  称取样品2.0g、氯化钠0.5g、酚红0.002g、蒸馏水或去离子水100mL,配制成溶液，调节其pH值至7.2～7.4,分装于含有小倒管的试管中,每管6.0mL,115℃高压灭菌15min后，接种大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌18h~24h的新鲜培养物，35℃±2℃培养18h～24h,观察结果。阴性结果：培养基颜色为橙红色或红色,不产气。阳性结果：培养基颜色变成黄色,产气或不产气。 2、H2S试验 称取样品1.0g、氯化钠0.5g、蒸馏水或去离子水100mL，配制成溶液，调节其pH值至7.2～7.6,分装于试管中,每管6.0mL,121℃高压灭菌15min后,接种鼠伤寒沙门氏菌的18h～24h的新鲜培养物,将醋酸铅(PbAc)试纸插人试管中,试纸下端距离液面2cm～3cm,盖好试管盖30℃～35℃培养24h~48h,观察结果。阳性结果:醋酸铅试纸条变黑，且黑色域不得小于0.5cm。阴性结果:醋酸铅试纸条不变黑或黑色域小于0.5cm。 3、靛基质(吲哚)试验 称取样品2.0g、氯化钠0.5g,蒸馏水或去离子水100mL,配制成溶液，调节其pH值至7.2～7.6,分装于试管中,每管6.0mL,121℃高压灭菌15min高压灭菌后,分别接种大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的18h～24h 的新鲜培养物,35℃±2℃培养18h～24h。观察结果时每管加入2～4滴靛基质试剂。10s内液面上出现玫瑰红色环者为阳性,出现黄色者为阴性。大肠埃希氏菌应为阳性,鼠伤寒沙门氏菌呈阴性。 4、V-P试验 称取样品0.7g、葡萄糖0.5g、氯化钠0.5g,加100mL的蒸馏水或去离子水配制成溶液,调节其pH值7.2～7.4,以每管6.0mL分装115℃高压灭菌15min后,分别接种产气肠杆菌,大肠埃希氏菌的18h~24h新鲜培养物,35℃±2℃培养18h～24h。观察结果时，除去试管帽,依次加入VP试剂甲、乙液，甲液6滴,乙液2滴,混合均匀,放置36℃培养箱孵育30min,溶液变红色为阳性,不变色为阴性。产气肠杆菌呈阳性反应,大肠埃希氏菌呈阴性反应。 5、色素试验 称取样品2.0g、氯化钠0.5、琼脂1.2g,加入100mL的蒸馏水或去离子水中,加热完全溶解,调节pH值7.2～7.4,121℃高压灭菌15min高压灭菌后,待温度降到50℃左右时倾注平板﹐充分凝固后﹐四区划线接种金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的新鲜培养物,35℃±2℃培养18h~24h,观察结果,应生长良好,金黄色葡萄球菌有黄色色素生成﹐铜绿假单胞菌有绿色色素生成。 6、生长试验 (1)质控菌株  大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺氏菌、乙型溶血性链球菌。 (2)液体培养基生长试验(九管法）  1)培养基配制:2.0g样品、0.5g氯化钠,加入到100ml的蒸馏水或去离子水中,加热完全溶解，调节 pH值至7.2～7.4,分装试管，每管9ml，121℃高压灭菌15min后,冷却备用。  2)操作方法:将质控菌株18h～24h新鲜培养物用无菌水制成108标准菌悬液(与标准比浊管比较),10倍梯度稀释至10-7,依次接种10-5,10-6,10-7菌悬液于液体培养基管中,每个浓度重复3管,35℃±2℃培养18h～24h。同时用合格品做对照品,样品应与对照品结果基本一样或优于对照品时，判为合格。 (3)固体培养基生长试验(平皿定量滴加法）  1)培养基配制:2.0g样品、0.5g氯化钠、1.2g琼脂，加入到100ml的蒸馏水或去离子水中,加热完全溶解,调节 pH值7.2～7.4,121℃高压灭菌15min后,倒平板,待充分凝固后并倒置于37℃培养箱1h~2h后，备用。  2)操作方法:制备好的固体培养基，用记号笔成90°交叉划线分成四份，依次滴加10mL，浓度为104CFU/mL、105CFU/ml、106CFU/ml、107CFU/ml的质控菌株菌液，轻轻摇动，待菌液吸干后倒置于35℃±2℃培养18h～24h。同时用合格品做对照品，样品应与对照品结果基本一样或优于对照品时，判为合格。 (4)生长试验结果评判  1)九管法和平皿定量滴加法都合格时，此原材料适合绝大部分培养基使用。 2)九管法合格，而平皿定量滴加法不合格时，此原材料适合于大部分液体培养基使用。  3)九管法不合格，而平皿定量滴加法合格时，此原材料适合于大部分含琼脂培养基使用。  4)两种都不合格时，此原材料为不合格，最好不要用于配制培养基。 7、菌落总是检测 称取25g样品溶解于225mL无菌蒸馏水或去离子水后，制成10倍系列稀释液，选取两三个适宜稀释度，吸取1mL样品液涂布于平板计数琼脂(PCA)平板上,36℃±1℃培养48h±2h计数结果,需做2个重复。 8、耐热芽孢杆菌检测 称取25g样品溶解于225mL无菌蒸馏水或去离子水后,制成10倍系列稀释液，选取两三个适宜稀释度，吸取lmL样品液涂布于葡萄糖胰蛋白豚琼脂平板上,55℃±1℃培养48h±2h计数结果﹐需做⒉个重复。  主要营养类原材料的生物学检验指标见表4-5-2。 北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！

                  生物标志物在微生物鉴定和检测中的应用领域！ 生物标志物(Biomarker)是微生物中含有的一些化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关，能够标志某一类或某种特定微生物的存在。这些具有分类学意义的化学物质的种类和含量可以作为鉴定微生物的指标。传统的微生物分离培养、生化鉴定和血清学鉴定的方法越来越难以适应环境、食品、临床标本中微生物的快速、准确检测的要求。PCR、特异性核酸探针杂交、基因芯片、生物传感器、免疫学技术等都是利用微生物生物学特性的检测鉴定技术。随着分析化学技术日新月异，很多仪器分析手段如高效液相色谱(High一performanceliquidc hromatography,H PLC) ，气相色谱(Gasc hromatography,GC ) ，气相色谱一质谱联用(Gaschromatography一masssp ectrometry,GC -MS)，液相色谱一质谱联用(LC-MS/MS)等，逐渐显示了在微生物检测中的潜力。这些分析化学的手段有别于依赖生物学特性的检测方法，主要通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径。 生物标志物的种类很多，包括不饱和脂肪酸、蛋白质、核酸、类脂、磷脂、多糖和醌类等，此外还有一些特殊的化学物质仅存在于一些特定的微生物中，如芽抱中含有毗吮二狡酸(Dipicolinic acidy DAP)，分枝杆菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属和红球菌属等都含有的分枝菌酸，也是鉴定细菌的重要物质。已有商品化的用于细菌检测的分析化学系统，如美国MIDI公司的细菌脂肪酸GC鉴定系统、细菌分枝菌酸HPLC鉴定系统等。多数方法利用生物标记物在不同细菌中的分布谱不同鉴定细菌，在检测这些生物标记物的过程当中，许多分析化学技术和手段相继被建立，本文将就生物标志物的种类、应用和发展状况做一概述。 一、脂类 脂类是最常见的生物标志物，在这方面有大量的文献报道和多种分析技术的应用，作为标志物用于细菌鉴定早在60年代就开始了。1987年，有人用快原子轰击质谱(Fast atom bombardment massspectrometry,FA B-MS)检测细菌提取物中的脂类成分，并成功地鉴定了细菌〔1,2)。脂类易于被提取和浓缩，其结构的变化与病原菌的营养和生理状况相关，在某些情况下还可以指示细菌的传染性，如霍乱弧菌脂类结构的变化可以指示细菌由可培养到非可培养的转换，而非可培养菌的感染性也大大降低(3)。结核分枝杆菌表面蜡样结构中的微蜡样酸和次级醇与抗药性有关。极性脂类的结构也与培养特性有关，G一菌受氧化型生物杀灭剂作用后产生氧化型脂肪酸，氧化型脂肪酸的存在表明了细菌的非可培养性。 大多数 G +菌中支链C15 :。脂肪酸丰度很高，而在大多数G一菌中C16:。丰度较高(4)。一些细菌如考克斯氏体属，土拉弗朗西丝菌属，军团菌属和结核分枝杆菌属细菌有其特殊的脂类，可经PLFA(Phospholipid fatty acid)分析实现鉴定。另外，在葡萄球菌属，鞘氨醇单胞菌属，假单胞菌属和梭菌属中存在属特异性的脂类，通过分析不同菌种脂类结构的特点还可进一步提高脂类分析的特异性 Sm ith 等用ESI-MS( El ectorsprayio nizationm assspectrometry)检测细菌中的甘油磷酸脂。MS/MS分析得到的有意义的信息主要是酞基(R-CO:一)的种类及其强度，该报道分析了三种芽抱杆菌属细菌和大肠杆菌的氯仿一甲醇提取物，发现它们的甘油磷酸脂成分有明显的区别，同时作者也提到必需将细菌在标准的条件下培养才能用这种方法鉴定细菌(9lo B orrett等用ESI-MS的检测方法研究大肠杆菌和炭疽杆菌的脂肪酸成分经乙醇或次氯酸盐消毒处理后的变化，表明这种方法可以对已消毒的细菌进行鉴定。 目前，已有一种商业化的细菌脂肪酸甲醋(FAME)G C分析系统，称Sherlock系统(美国MIDI公司)。细菌在标准的培养条件下培养和收获，经过有机溶剂的萃取和甲醋化，注人GC系统中分析，一个分析周期约2h(细菌培养时间除外)。脂肪酸定性由Sherlock系统根据细菌脂肪酸谱中色谱峰的tR，检索其内置的脂肪酸库而完成(其数据库的范围限于012,0-C20;。的脂肪酸)，经百分归一化处理，给出相对定量数据。本实验室曾利用该系统分析了32个需氧芽胞杆菌的繁殖体和芽胞的脂肪酸成份，并得到一些有意义的分类学结果。 Bas ile 等报道了一种可移动式热裂解质谱(Py-orlysism asssp ectrometry, Py -MS)方法。细菌全细胞(约107-108个)与甲基化试剂混合后经热裂解，由毛细石英管导人EI源，质量分析器为离子阱型。测定了鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西丝菌、布鲁氏菌、炭疽芽胞杆菌的脂肪酸甲醋，与经标准MIDI系统样品处理后的Py-MS质谱图有很好的对应关系。Py-MS采用原位热裂解甲醋化，样品处理只需30 s,分析周期仅为10 min。而且除脂肪酸外，还检测到了芽抱中的特殊成分DPA的甲醋化衍生物。根据四种生物战剂质谱图中峰位和峰强的不同，极易将它们区分开。其缺点是仍免不了细菌的分纯培养过程。 与甲基化试剂混合后经热裂解，由毛细石英管导人EI源，质量分析器为离子阱型。测定了鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西丝菌、布鲁氏菌、炭疽芽胞杆菌的脂肪酸甲醋，与经标准MIDI系统样品处理后的Py-MS质谱图有很好的对应关系。Py-MS采用原位热裂解甲醋化，样品处理只需30 s,分析周期仅为10 min。而且除脂肪酸外，还检测到了芽抱中的特殊成分DPA的甲醋化衍生物。根据四种生物战剂质谱图中峰位和峰强的不同，极易将它们区分开。其缺点是仍免不了细菌的分纯培养过程。 二、醌类 醌类几乎存在于所有生物中，主要包括泛醌和甲基蔡醌类。每种细菌都有一种主要的醌类成分，一个微生物群体中酿类的种类和数量的不同反映了群体组成的多样性，酿类谱已经作为指示细菌群体组成多样性的一个指标在环境微生物学中广泛使用〔13)0醌类在细菌和真核生物中是需氧呼吸链上的电子传递体，其结构中的异戊二烯侧链的长度有重要的分类学意义。真核生物线粒体主要含UQ10,G一菌主要含有UQ4一UQ10，兼性厌氧菌如大肠杆菌还含有蔡醌、甲基禁醌、去甲基蔡酿，而古细菌缺乏泛醌(14)a切de等报道提取细菌细胞中的中性脂类，用LC-MS检测环境中的泛醌，最低检测限为9ppb，相当于1.29 x 10 ，个细菌〔'5)o N ishijima等人用Frit-FAB(Frit-fast atom bombardment)和HPLCMS联用技术检测了15种标准菌株的泛醌、甲基酿及其类似物。该方法利用色谱保留时间、UV检测和MS检测的信息，可以得知醌类的组成和含量。 三、脂多糖和脂寡糖 脂寡糖 (Lipooligosaccharides,LO S)和脂多糖(Li popolysaccharides,LP S)是G一菌细胞表面重要的抗原决定簇，特定的分子组成决定着抗原的结构和宿主与病原之间的相互作用。文献报道用ESI-MS分析流感嗜血杆菌、杜克莱氏嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、伤寒沙门氏菌的LOS和LPS的0一去酸基产物的方法，作者认为在对LOS/LPS结构了解的情况下可以实现这些菌株的鉴定。由于 外 界 环境的刺激会使LOS/LPS有所变化，它不十分适合用来鉴定细菌，但是LOS/LPS是血清型划分的基础，因此分析这些物质的含量能够建立生物学分型和化学分型之间的关系。用MS的手段分析临床分离病原菌的LOS/LPS，还可了解LOS/LPS的结构和致病性之间的关系。 四、分枝菌酸 分枝杆菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属和红球菌属的细菌中含有分枝菌酸，不同种属的细菌所含分枝菌酸的组成恒定，且各不相同，计算HPLC色谱图中色谱峰的相对峰高比和相对保留时间对于鉴定这些细菌有重要意义。Butler等用HPLC鉴别了来自这几个属的细菌，并且就高效液相色谱分析分枝菌酸在鉴定细菌中的应用做了全面综述〔021, K ellogg等用MIDI公司的SMIS(Sherlock mycobacteria identificationsystem)系统分析了370株分枝杆菌属的分离株，正确率为75%，经过计算相对峰高比和相对保留时间校正，原来没有正确鉴定的菌株90%以上都实现了正确鉴定〔2')o C hou等报道了用气相色谱检测分枝杆菌属中10个种的29株细菌的脂肪酸、次级醇和分枝菌酸，正确鉴定了全部60个从痰液中得到的分离株，用在Bactec 7H12 B基质上培养6天的培养物作为分析的样品，大大的缩短了此类细菌的鉴定时间。 五、多糖 细菌的多糖占其干重的0.1%一2%，两以用于种属鉴定和推测细菌的生理状况。附表列举了一些多糖在细菌中特异性的分布, HPLC测定多糖和糖蛋白中分离出的糖已经是比较成熟的方法，全细胞裂解液中多糖成分的测定可以为分类学提供有意义的信息。GC-MS/MS检测环境样品和临床标本中细菌多糖的醇醛酸衍生物具有高灵敏度、高特异性，Fox就GC-MS检测复杂基质中细菌糖类成分做了全面综述。通过水解把细菌全细胞中的多糖释放出来，然后加人衍生化试剂反应生成糖的醇醛酸形式，再进行GC-MS分析。目前这一样品处理方法已经可以实现自动化，为细菌多糖成分全自动分析及其仪器化奠定了基础。蜡样 芽 胞 杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌的表型和基因型非常接近，正确鉴定、区分三者一直是细菌分类鉴定中的一个难题。在多糖成分的GCMs图中，炭疽芽胞多糖成分也有显著的高于其余两者，而枯草芽胞杆菌的甘露糖氨显著低于前三者。它们的芽胞多糖成分也有明显的区别，炭疽芽胞杆菌只含有鼠李糖和3-0一甲基鼠李糖，其它三者还含有海藻糖和2一甲基鼠李糖。 六、胞壁酸 胞壁酸是所有真细菌(除支原体和衣原体外)细胞壁中特有的氨基糖，在自然界其它生物包括动物细胞、体液、真菌中都不存在，占细菌干重的4%，可作为从复杂的生物、环境样本中检测痕量细菌的一个标记分子。胞壁酸(Muramic acid)的检测往往需要衍生化过程，如胞壁酸的丹磺酞衍生物，三氟乙酞化衍生物和三甲基硅烷化衍生物等，检测手段主要是LC-MS,GC-MS等(25)。通过酸水解把胞壁酸释放出来，中和多余的酸，再加人一定量的内标，经MS/MS测定可以给出定性定量结果。类似的其它氨基糖也可以用作化学分类的标志物，如军团杆菌属中的异鼠李糖胺(Quinovosamine)和岩藻聚糖胺(Fu cosamine) ，半乳糖胺的含量不同可区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌〔26)o K ozar(27〕等分析了灰尘和空气样品中的胞壁酸，样品经过分离纯化和卤化衍生化进行GC-MS/MS分析，检测样品为物体表面灰尘和室外空气样品，胞壁酸含量分别为1.66 n 岁ml和1.4/5.9 n留ml, Black等用硫酸裂解细菌全细胞，然后用有机碱性溶剂中和过量的酸，注人ESIMS/MS直接分析未经衍生化的胞壁酸，作者采用了多反应监测扫描(Multiple reaction monitoring)可以提高选择性和灵敏度，避免了繁琐的衍生化步骤。 七、蛋白质 细菌基因组约编码几千个蛋白质，其种类多、分子量覆盖范围广使得以其中某一种蛋白质特异地鉴定某种细菌几乎是不可能的。但是，正是由于蛋白质的多样性和丰富性，利用菌体内的多个蛋白质质量信息的分析方法很有希望成为鉴定细菌更为有效的手段。目前，以蛋白质为靶分子鉴定细菌的报道很多，有以下方面的研究结果。 1、以一组细菌的蛋白质图谱的差异为鉴定指标研究  几种近源菌或相关菌蛋白质图谱的差异，把这些差异做为鉴定细菌的指标。Krishnamurthy等报道用LC/ESI-MS为检测手段，分析了9种不同种属的细菌。用含0-20%乙睛的0.1 % TFA悬浮冷冻干燥的细菌，浓度为0.6V g /闪，涡流2m in，离心2min，上清液用滤膜过滤，注人HPLC系统。LC-MS分析时间仅为12 min。蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌在此分析条件下各有其特异的蛋白质，非常容易区分，此外它们还有种内共有的标志物。Hendrickera等以热裂解质谱为检测手段，以鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、土拉弗朗西丝菌、布鲁氏菌的菌悬液为标本，检测了脂肪酸、DPA,DNA、蛋白质降解物的氢氧化四乙基胺甲醋化产物，用统计学方法判读结果('0),, DNA在此条件下降解为单个碱基，蛋白质降解为非常短的肤，质谱检测范围在400 D以下，对54份样品各分析4次，整个分析的正确率为98%。但是，用这种方法鉴定细菌的能力仅局限于研究范围之内的细菌，对于其它未知菌的鉴定还是无能为力。Conway等将pap操纵子克隆入pACYCl8斗，然后把重组质粒pRHU-845导人大肠杆菌。已知pap编码蛋白的分子量为16554 D,用MALDI-TOF MS分析，重组大肠杆菌(pRHU-845/pap干)比未重组大肠杆菌(pACYC184/pap一)多一个m/z'16 556.9 D的质谱峰，表明单一的蛋白的差别可以通过质谱分析显现出来，为检测可能的基因重组微生物提供了重要手段。 2、根据某科、属的细菌蛋白质图谱做分类学研究 Con wa y等 分析了25种致病性大肠杆菌和9种肠杆菌科其它属的细菌，检测到40一100个质谱峰，分子量最大达到25 kD(3'l。细菌过夜培养、收集后冷冻干燥，制成1 m留m1的菌液，与。一轻基肉桂酸的饱和溶液相混合，用MALDI-TOF MS(Matrix assis-ted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)检测，检测限为1.8 x 1 0，个菌。用溶菌酶处理细菌，质谱图上并没有增加色谱峰;在溶菌酶处理细菌后，用蛋白酶K消化，所有的蛋白质质谱峰都消失了，证明本方法可以检测细胞内的蛋白质。 大肠杆菌不同株的MALDI-TOF质谱图之间既存在特异的峰又有很大的相似性，易与其它肠杆菌科的细菌(包括沙门氏菌和志贺氏菌)相区分。 3、用未知菌的质谱图检索标准菌株的蛋白质指纹图谱库 首先建立标准菌株的蛋白质指纹图谱库，未知菌株经标准程序分析，通过一定的数理统计方法进行数据库检索。该方法对数据库的容量，包括数据库中不同菌种、菌株的覆盖范围有很大的依赖性，要求分析方法在一定的细菌培养和质谱分析条件下重现性好。英国Micromass公司的MALDI-TOF线性飞行时间质谱仪配有60多个属，300多种细菌的指纹图谱数据库，供用户检索使用。该软件还允许用户自定义数据库，用户可以自行标准化从细菌培养到质谱分析的过程，建立由目标菌株构成的数据库，可以大大提高鉴定的准确性和拓展应用范围。 4、用未知菌的质谱图检索蛋白质分子量数据库 微生物基因组学和蛋白质组学的研究提供了日益丰富的蛋白质数据，为MS鉴定细菌开辟了新途径。其基本思路是用未知菌的质谱峰与蛋白质数据库中(如Swiss-Prot)已知菌的蛋白质分子量相匹配，匹配率最高的为未知菌的鉴定结果。利用软件调取细菌某一范围内全部蛋白质的分子量作为参照，将得到的质谱峰与其相对照，通过数理统计软件分析给出鉴定结果。 Dai等用HPLC分离大肠杆菌裂解液中的各个成分，把收集到的流份做MALDITOFMS分析。发现与细菌裂解液直接用MALDI-TOF的质谱图相比较，在2一19 kD范围内多检出300多个蛋白质，尤其是高分子量蛋白质增加了很多，说明细菌裂解液中的某些物质对MALDITOFMS分析可能有离子抑制效应。作者还对比了不同文献中报道的大肠杆菌的质谱峰。由于各文献中样品处理方法和仪器的参数条件各有不同，得到的质谱峰也各不相同，但是几乎所有的分子量都可以在HPLC收集的流份中找到相应的蛋白，而且在实验上论证了上述途径的可行性。随着细菌基因组全序列信息的不断积累，可以利用的蛋白质信息将越来越多。这种方法在病毒鉴定中同样适用，如Yao等用MALDI-TOFMS分析了空气样品中委内瑞拉马脑炎病毒的胰蛋白酶降解物37。利用六个已测序的病毒基因组数据，计算其理论胰蛋白酶降解的肤图谱，构成数据库。经数据库检索，准确的鉴定了该病毒。 高分辨质谱和多级质谱检测具有高选择性和高特异性，如MALDI中的源后延迟技术Post sourcedecay PSD )三重四级杆和离子阱型质量分析器等。这些手段可以从大量的环境物质和背景中检测到特定微生物的生物标志物，还可获得该分子的结构信息，但是这种鉴定手段依赖于对致病菌的生物标志物结构的清晰认识。 八、核酸 在 MA LD I-TOF和ESI-MS方式下，寡核昔酸片段容易带有一个或多个负电荷，以负离子形式被检测。质粒经限制性内切酶消化，得到大小不等的片段，用MS检测片段的分子量可以鉴定某一质粒。Bai等报道将细菌的B6 BLEU5质粒用Alul或Hae1II酶切，质粒大小为4 658坤，得到27个大小22一267by的片段，这些片段以ss-DNA的形式离子化，与预期的片段分子量相符合，但是小于20 nt和大于70nt的片段没有检出。 最近，Wintzingerode等报道了一种用MALDI-TOF分析16 S rRNA碱基特异性片段实现细菌快速鉴定的方法。在PCR反应中，用d-UTP代替d-TTP，以350帅长度的16 S rDNA单链为模板扩增，该片段包括了高度变异区V1和V2o PCR产物经d-UTP糖基化水解酶水解后得到DNA片段，用MALDI-TOF MS分析这些片段的质谱图，与已公布的16S rRNA序列的计算值相比较，可以区分在此片段中仅相差单个碱基的菌株该方法不需细菌培养过程，靶基因也不仅局限于16SrRNA，同样适用于其它基因分型标记分子。这一方法对于非可培养的和难培养细菌具有重要价值。VN RT (V ariablen umberta ndem repeat)技术在个体识别、基因定位及基因诊断方面有较高的应用价值，在细菌鉴定中可以用于细菌的来源追踪。用VNTR技术分析来自佛罗里达州、纽约和华盛顿特区的邮件中的炭疽芽胞杆菌分离株，证实它们是同一来源，这株菌来源于1981年从德克萨斯州死牛中分离出一株菌，该株菌被命名为Ames株。 九、其它 除了上述几种类型的生物标志物外，其它种类的生物标志物相对较少一些。这是因为脂类、多糖、蛋白质、核酸在细菌内含量较高，种类繁多。还有一些小分子的物质也被用来作为鉴定特定微生物的生物标志物。 DPA( 毗 吮-2,6一二梭酸)是所有细菌芽胞中特有的一种成分，是区分细菌芽胞和繁殖体的标志物。Goodacre等用巧-MS和傅立叶变换一红外光谱(FTIR)检测DPA,m /z1 05为DPA的特征碎片峰;144一1439 cm -’代表了比吮环的振动，该方法对26株实验菌株都能正确判定以芽胞还是繁殖体的形式存在(41)o B evaerly等报道用Py-MS检测DPA，分析时间(包括样品制备)仅10 min，灵敏度为2.2 X 107CFU。 用经典的生化反应难以检测和鉴定厌氧菌，有人建议通过检测细菌的代谢终产物鉴定细菌，但是从细菌的代谢终产物中找到稳定的标志物比较困难。Arellano等报道，用毛细管电泳一紫外(Capillaryelectrophoresis-ultrav iolet,CE -UV)检测分析厌氧菌的短链脂肪酸，如唬拍酸、丙酮酸、乳酸、丙酸等，共分析了17个种和亚种的11种短链脂肪酸成分，G`菌和G一菌的色谱图有很大的区别，但是，仅依赖短链脂肪酸成分并不能准确地将目标菌鉴定到种的水平。 二醇、街醇、甘油在评价微生物种群的结构和生理状况方面很有意义。细胞死亡后，在内源性或外源性的磷脂酶的作用下迅速生成甘油二醋〔’〕。这些分子需要经过衍生化，以适合用ESI-MS检测。 十、展望 随着分析技术的进步和分析微生物学的不断发展，利用生物标志物鉴定微生物的方法将会对临床诊断、环境监测、食品检测产生重大的影响。在某些情况下，分析目标微生物中生物标志物的组成不仅可以确定该微生物的属、种，还可以确定其具体来源于哪个保藏种，在生物恐怖和生物战发生时快速鉴定细菌来源对于事件性质的判断具有重要意义。当然，这需要更为精确的分析方法和相应的数据库支持。 尽管以上列举了多种类型的生物标志物，仍然很难找到一种在某种、某类微生物中独有的化合物。 目前，几乎所有通过分析生物标志物而检测和鉴定细菌的方法都是获得某类标志物的分布和含量谱，根据不同的微生物中该标志物的分布不同鉴定目标微生物。建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序，仍然是建立微生物检测系统的主要方向。为了提高鉴定的准确性，还可以集合几种方法同时检测几种生物标志物，综合判断鉴定结果。 另外，一些生物标志物的分析方法比较繁琐，涉及到分离、提取、衍生化等步骤，耗时数小时，随着分析技术的进步和各种标志物数据库的完善，这些方法将会向更加简便、迅速、准确和自动化的方向发展。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！