小鼠肺微血管周细胞的培养操作及应用研究！

                  小鼠肺微血管周细胞的培养操作及应用研究！

一、背景

小鼠肺微血管周细胞是一种在肺部微血管周围分布的细胞，也称为肺微血管平滑肌细胞。它们的主要功能是调节肺部微血管的张力和通透性，以维持正常的肺功能。

肺微血管周细胞是一种围绕在肺微血管内皮细胞周围的细胞，具有收缩功能。这种细胞嵌入毛细血管内皮细胞的基膜中，通过物理接触和旁分泌信号与内皮细胞进行细胞通讯，监视和稳定内皮细胞的成熟过程。在中枢神经系统中，周细胞包围着内皮细胞。

肺微血管周细胞在肺部疾病中也扮演着重要的角色。例如，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中，肺微血管周细胞会发生增殖和迁移，导致肺部微血管收缩和通透性增加，从而加重疾病的进展。

此外，肺微血管周细胞还参与了肺部炎症和免疫反应的调节。它们可以释放多种细胞因子和趋化因子，吸引和激活其他免疫细胞，参与炎症反应的发生和发展。

二、小鼠肺微血管周细胞培养操作

1)复苏小鼠肺微血管周细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠肺微血管周细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠肺微血管周细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

小鼠肺微血管周细胞可以用于周细胞凋亡在肝肺综合征肺微血管扩张中的作用研究：

通过培养肺周细胞，观察CBDL大鼠血清对肺周细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡和caspase-3表达的影响；观察CBDL大鼠肺细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡、caspase-3表达情况和周细胞的主要标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、神经元胶质抗原2(neuron-glial antigen2,NG2)、desmin的蛋白水平及其阳性细胞率的变化；抑制caspase-3后检测肺细胞凋亡，α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化，以及肺微血管扩张和血氧交换情况，证明如下假设：CBDL产生的血清因子变化，通过血液循环作用于肺微血管，致caspase-3激活，肺周细胞凋亡，进而引起肺微血管扩张、血氧交换异常和低氧血症，最终揭示肺周细胞凋亡在HPS实验模型肺微血管扩张中的重要作用。

方法：

1、CBDL大鼠血清对肺周细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡的作用研究1.1肺周细胞的培养和鉴定。1.2采用CBDL法构建HPS大鼠模型，收集CBDL1wk血清。1.3CBDL大鼠血清培养肺周细胞后，分别用TUNEL和western blot检测其凋亡和caspase-3表达情况。

2、CBDL大鼠中肺周细胞的变化研究2.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型。2.2分别用TUNEL和western blot检测CBDL大鼠肺细胞的凋亡和caspase-3的表达。2.3分别用western blot和免疫组化法检测CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。

3、抑制caspase-3对CBDL大鼠肺周细胞的影响及HPS的作用研究3.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型，手术后第一天起每天给模型大鼠腹腔注射caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK，连续2wk。3.2用TUNEL法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺细胞的凋亡情况。3.3分别用western blot和免疫组化法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。3.4分别用血气分析和HE染色法观察抑制caspase-3后CBDL大鼠血氧交换和肺微血管扩张情况。

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