多肽标记FAM方法 Reagent:5-carboxyfluorescein (5-FAM)Use standard coupling method to couple 5-carboxyfluorescein to the amino group of the peptide. For cost saving purposes, use 2x excess compared to the mmol of resin, instead of the standard 4x excess used for Fmoc-amino acids. For 0.1 mmol synthesis, use 75 mg 5-carboxyfluorescein, 76 mg HBTU, and 70 mL DIEA.

多肽标记FITC方法Reagents:FITC Fmoc-e-Ahx-OHCouple Fmoc-e-Ahx-OH to the amino terminal of the peptide-resin using standard coupling conditions."De-Fmoc" with piperidine using the standard 20% piperidine procedure.Wash resin with DMF (3-4x).Swell resin with DCM and drain.Prepare solution of 1.1 equivalent of FITC in pyridine/DMF/DCM (12:7:5). Use just enough solution to form a slurry with the resin. Do not use too much solution since the rate of the reaction is proportionate to the concentration of the solution.Add the solution prepared in step 2 to the resin.Let mix overnight.Check the completion of the reaction using ninhydrin test.If the coupling of FITC to the amino group is not complete, ninhydrin test will give a blue color. Repeat the coupling with FITC (steps 5-7) if necessary.Wash resin with DMF (2x), isopropanol (2x), and DCM (2x).

ELISA试剂盒酶的底物酶的底物 1.3.3.1 HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。2.在ELISA试剂盒中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产品，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联(3,3",5,5tetramethylbenzidine, TM和ABTS[2,2"-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)]。3.OPD氧化后的产品呈橙红色，用酸中止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色便当，是HRP结合物最常用的底物。OPD自身难溶于水，OPD?2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予留心。OPD见光易蜕变，与过氧化氢混组成底物运用液后更不安稳，须现装备现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分红二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂方法，片剂中含有发泡助溶剂，运用更为便当。4.过氧化氢则配入底物缓冲液中，ELISA试剂盒有制成易保存的浓缩液，运用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的作业浓度为0.02% H2O2的运用液,只需参与OPD后即可作为底物运用液。TMB经HRP作用***产品显蓝色，目视对比明显。5.TMB性质较安稳，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成运用液，可直接作底物运用。其他，TMB又有无致癌性等利益，因此在ELISA中运用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4中止后，TMB产品由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。6.ABTS虽不如OPD和TMB灵敏，但空白值极低，也为一些试剂盒所选用。另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经HRP作用后，产品显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的利益为可加宽定量测定的线性规划。7.HRP对氢受体的专一性很高，ELISA试剂盒仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2运用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2便当、安稳。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可安稳1年。

                                试剂盒五大检测方法1、有些客户会用OVA（卵清蛋白）做一些哮喘，eilsa试剂盒过敏性肠炎的模型，后来会检测粘膜特异性的sIgA以及血清里边IgG，IgE等目标。当客户向我咨询购买这几个目标的盒子的时分，我很必定地说这些目标的检测要你自己特制，不会有商品化的盒子出售的。2、关于一些小分子的检测，比如前列腺素、糖皮质激素的检测，我的了解是要用竞争法ELISA去检测，也要购买选用这个办法的盒子。一般细胞因子的检测，都是选用惯例的夹心法ELISA检测，由于因子分子量比较大，一般10几个KD左右，很简单找到两个或许多个抗原表位。而小分子很难找到两个不同的表位，也就决定了包被抗体和检测抗体无法一起结合小分子并固相化。解决方案就是酶标板上包被二抗，每个孔参加一定量的酶标的小分子，然后加样品，再加不带符号的检测抗体，显色底物。样品的意图小分子的含量越高，吸光度越低。3、eilsa试剂盒关于胰岛素的检测，我仍是引荐millpore 旗下LInco公司的检测试剂盒，不管是放免仍是ELISA，听说专利权在他们手中。4、做试验面向的ELISA试剂盒种属首要是人，大鼠和小鼠，现在市面上鸡、牛、马、羊、兔各种目标的盒子都有售，真不知道这些抗体是怎样来的，。据我所了解，这些炎症目标仍是有很大种属特异性的。5、很多客户有个误区，拿来一个目标就想当然地尝试用eilsa试剂盒去检测，其实应该多动脑，该检测活性的检测活性，该做western的做。

ELISA实验质量控制问题常见分析5.1 基本概念5.1.1 质量控制（Quaility Control,Q.C）　　质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。　　1）确定控制的对象；　　2）规定控制对象的标准（预期值）；　　3）制定或选择控制方法和手段；　　3）测量实际数据；　　4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预　　　　定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。　　5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。　　质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的"控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查"性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍（见5.3.室内质控程序）。5.1.2 误差　　实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。　　系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。　　随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。　　过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免的。5.1.3 正态分布及标准差　　ELISA试验中，检验同一样本达20次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光值）分布在均值两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为中心对称分布，这就是正态分布。 　　正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数（X）和标准差（SD）来表示，其计算方法均值、标准差和概率的关系如下：　　X±1SD，概率0.68　　　　X±2SD，概率0.95　　　　X±3SD，概率0.99　　换言之，当ELSIA检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的±1SD范围内的数据，占该组数据的68%，在X±2SD范围内分布的数据占总体的95%，在X±3SD范围内分布的数据占总体的99%。当我们要求检验结果在X±2SD范围内为合格时，将有95%的数据可能合格。5.1.4 真值　　用确切的、*理想的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来表示真值的大小。5.1.5 准确度（accuracy）　　是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它表示该项检验的不准确度。　　绝对偏差=检验的均值-真值（或靶值）　　相对偏差=绝对偏差真值÷（或靶值）×100%5.1.6 精密度（Precision）　　是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间的符合程度。5.1.7 标准品1、国际标准品 由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法　　测定的定值材料。2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材　　料。3、参考标准血清 国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和　　鉴定方法准确性。 5.1.8 临床决定性水平（clinical decision leuel）　　当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度称为临床决定性水平。5.2质量控制血清　　质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。5.2.1 质控血清的使用　　卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。5.2.2 临界值质控血清　　质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。 临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。5.2.3 质控血清的制备每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。1） 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。2） 56℃加热10小时来活。3） 离心或过滤除去沉淀。4） 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如　　能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。5） 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。　　被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要　　求，则应加所要求浓度的质控物。6） 标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对　　比测定。5.3 室内质量控制程序　　临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。1） *佳条件下的测定误差。2） 已知值的血清在常规检验条件下的误差。3） 未知值的血清在常规检验条件下的误差。4） 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。5.3.1 *佳条件下已知值质控血清变异（optimal conditions variance,简称OCV）的测定　　在本实验室*佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的*佳工作质量。　　现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质、操作*熟练的技术员进行认真地专门测定，选用*佳的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等，即在*佳、*理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出2个吸光值（A值），求出X。连续作20次，求出20个X，即X1……X20。从这20个数据中，求出OCV的X和SD。5.3.2常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称　　RCVK）的测定。　　做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小，说明OCV不是*佳条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。5.3.3常规条件下,未知值质控血清变异（routine conditions variancl-unknown value 简称　　RCVU）的测定　　有时为了避免主观性,再作RCVU测定。　　测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。5.3.4质控图　　通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。 　　质控血清的S/CO值低于-2SD的范围,属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。　　ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为"告警"，二次超出2SD为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。一般认为：①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；　　　　　④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。5.3.5统计学计算方法－－"即刻性"质控　　以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但ELISA有其特殊性，*合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA试剂盒效期短，用一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。"即刻法"的建立具体计算方法如下：1）先将测定值从小到大排列2）计算X和SD。3）计算SDI上限和SDI下限值。4）将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表　示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限　有 一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于"告警"状态；当　SDI上限和SDI下限有一值＞n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属"失控"。数值处　于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控　的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。　　即刻性质控统计方法，适于ELISA测定的质控。　　当检测的数值超过20次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第21次的数值，依次点入即可。5.4室间质量评价（external quality assessment,简称EQA）　　室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。 5.4.1室间质评的方法1、 发质控物进行调查　　这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。 　　这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。2、 派观察员到实验室进行试剂调查　　这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。　　这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。

抗坏血酸含量测定使用说明书抗坏血酸参加体内的氨基酸代谢，能够增加肌体对抗病的能力，降低毛细血管的通透性，加速血液凝固，促进铁在肠内的吸收，促进胆固醇的转化，使血脂下降。一、目的学习维生素 C 的生理功能和性质，掌握用 2 ， 6 一二氯酚靛酚法测定维生素 C 的原理和方法。二、原理维生素 C 是一种水溶性维生素，是人类营养中*重要的维生素之一，人体缺乏维生素 C 时会出现坏血病，因此它又被称为抗坏血酸。此外维生素 C 还具有预防和治疗感冒以及抑制致癌物质产生的作用。维生素 C 的分布很广，尤其在水果（如弥猴桃、橘子、柠檬、山楂、袖子、草莓等）和蔬菜（苋菜、芹菜、青椒、菠菜、黄瓜、番茄等）中的含量更为丰富。不同栽培条件、不同成熟度和不同的加工贮藏方法，都可以影响水果、蔬菜的抗坏血酸含量。测定抗坏血酸含量是了解果蔬品质高低及其加工工艺成效的重要指标。维生素 C 在金属铜和抗坏血酸氧化酶存在下极易氧化，因此，在用铜制品做食品时，维生素 C 易丢失。此外在碱性溶液中，维生素 C 也易被破坏，而在酸性溶液中比较稳定。利用它具有的还原性质可测定其含量。还原型抗坏血酸能被染料 2 ， 6- 二氯酚靛酚氧化为脱氢型，该染料在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后变为无色。因此用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定含有维生素 C 的酸性溶液时，维生素 C 尚未全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色，当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴入的 2 ， 6 一二氯酚靛酚立即使溶液呈现淡红色。用这种染料滴定抗坏血酸至溶液呈淡红色为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。三、仪器、试剂和材料1 .仪器（ 1 ）天平（ 2 ）组织捣碎机（ 3 ）微量滴定管（ 5ml）（ 4 ）容量瓶（ 50ml）（ 5 ）刻度吸管（ 5 ml, 10 ml ）（ 6 ）锥形瓶（ 100ml）2 .试剂（ 1 ） 1% 草酸溶液：草酸 1g 溶于 l00ml 蒸馏水中（ 2 ） 2 ％草酸溶液：草酸 2g 溶于 l00ml 蒸馏水中（ 3 ）坏血酸标准溶液（ 0. 1 mg/ ml） : 精确称取 l0mg 纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）用 1 ％草酸溶液溶解并定容至 l00ml 。此溶液应贮存于棕色瓶中，临用前配制。（ 4 ） 0 . 05 ％ 2,6 一二氯酚靛酚溶液：称取 500mg 2, 6- 二氯酚靛酚溶于 300ml 含 104 mg 碳酸氢钠（ A. R ）的热水中，冷却后用蒸馏水稀释至 1000ml ，滤去不溶物，贮存于棕色瓶中， 4＇＇C 冷藏可稳定一周，临用前以标准抗坏血酸标定。3 .材料新鲜水果或蔬菜四、操作步骤1 .提取抗坏血酸取新鲜水果或蔬菜 50g, 加入 50ml2 ％草酸溶液，用组织捣碎机打成匀浆。过滤取得滤液，滤饼可用少量 2 ％的草酸洗几次，合并滤液，记录滤液体积。2 . 2 ， 6 一二氯酚靛酚溶液的标定准确吸取 4 . Oml 抗坏血酸标准液（含 0 . 4g 抗坏血酸）于 l00ml 锥形瓶中，加 16ml 1 ％草酸溶液，用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定至淡红色（ 15 秒内不褪色即为终点）。记录所用染料溶液的体积，计算出 l ml 染料溶液所能氧化抗坏血酸的量。3 .样品滴定准确吸取样品提取液两份，各 20ml ，分别放入两个 100ml 锥形瓶中，滴定方法同 2 中的操作，另取 20ml 1 ％草酸作空白对照滴定。五、结果处理取两份样品滴定所耗用染料体积的平均值，代入下式计算 100g 样品中还原型抗坏血酸的含量：式中， V 1 为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；V 2 为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；V 为样品提取液的总体积；V 3 为滴定时所取的样品提取液的毫升数；M 为 l ml 染料所能氧化抗坏血酸的量（ mg ）（可由操作 2 计算得到）；W 为待测样品的重量（ g ）。六、注意事项（ 1 ）用本法测定抗坏血酸含量虽简便易行，但有下述缺点：，本法只能测定还原型抗坏血酸，不能测出具有同样生理功能的氧化型抗坏血酸和结合型抗坏血酸。第二，样品中的色素经常干扰对终点的判断，虽可预先用自陶土脱色，或加入 2-3 ml 二氯乙烷，以二氯乙烷层变红为终点，但实际上仍难兔产生误差。（ 2 ）用 2 ％草酸制备提取液，可有效地抑制抗坏血酸氧化酶，以免抗坏血酸变为氧化型而无法滴定，而 1 ％的草酸无此作用。（ 3 ）如样品中有较多亚铁离子（ Fe 2+ ）时，也可使染料还原而影响测定，这时应改用 8 ％乙酸代替草酸制备样品提取液，此时 Fe 2 ＋ 不会很快与染料起作用。（ 4 ）如样品浆状物泡沫过多，可加几滴辛醇或丁醇消泡。（ 5 ）市售的 2 ， 6 一二氯酚靛酚质量不一，以标定 0.4mg 抗坏血酸消耗 2ml 左右的染料为宜，可根据标定结果调整染料溶液浓度。（ 6 ）样品提取制备和滴定过程中，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免破坏抗坏血酸。（ 7 ）滴定过程宜迅速，一般不超过 2min ，样品滴定消耗染料 1 - 4 ml 为宜，如超出此范围，应增加或减少样品提取液的用量。（ 8 ）提取的浆状物如不易过滤，亦可进行离心收集上清液。抗坏血酸 - 【作用与用途】  参加体内的氨基酸代谢，能够增加肌体对抗病的能力，降低毛细血管的通透性，加速血液凝固，促进铁在肠内的吸收，促进胆固醇的转化，使血脂下降。常用于各种急、慢性感染性疾病，如过敏性皮肤病、紫癜、湿疹、寻麻疹、带状疱疹，急慢性肝炎、肝硬化等肝功能损坏，还可促进伤口的愈合以及高血脂、癌症、感冒的辅助治疗。 

化学试剂回收操作注意事项在我们日常生活中，化学试剂产品在过期的情况下，一般是处于乱扔乱放的状态，这不但会对环境造成极大的危害，更多的是伤及人类的身体健康！其实很多化学试剂产品都是可以回收利用的，它有专门的回收站点或者公司进行回收处理并提炼出他们所需要的东西。但在回收时，操作需特别的注意，需要有专业的知识和实践培训。下面就以回收硝酸银为例：硝酸银回收密闭操作，加强通风。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程。建议操作人员佩戴头罩型电动送风过滤式防尘呼吸器，穿胶布防毒衣，戴氯丁橡胶手套,切忌将其滴在皮肤上。远离火种、热源，工作场所严禁吸烟。远离易燃、可燃物。避免产生粉尘。避免与还原剂、碱类、醇类接触。硝酸银回收后该储存在什么地方呢？1、存放硝酸银的仓库应具备干燥通风环境，避免潮湿；拒绝水、酸、碱等液体极易挥发有腐蚀性的物质存在，更不宜与这些物质共存同一仓库。2、存取及搬运银焊条时小心不要弄破包装，特别是内包装“热收缩膜”。　3、硝酸银应放在木托盘上，不能将其直接放在地板或紧贴墙壁。4、按照“先进先出”的原则发放硝酸银，尽量减少产品库存时间。5、打开硝酸银包装应尽快将其全部用完（要求在一周以内），一旦焊丝直接暴露在空气中，其防锈时间将大大缩短（特别在潮湿、有腐蚀介质的环境中）。

化学试剂的正确储存及保质期解析日常生活中，我们知道怎样去看去把控我们的日常生活用品，可涉及到化学用品时，我们却不知所措，因为它根本不能像日常生活用品那样随意摆放，裸露在不适当的环境和空气中。以此，现为大家介绍如何去保存我们的化学试剂产品及怎样判定它的保质期限。化学试剂在贮存、运输和销售过程中会受到温度、光辐照、空气和水份等外在因素的影响，容易发生潮解、霉素、变色、聚合、氧化、挥发、升华和分解等物理化学变化，使其失效而无法使用。因此要采用合理的包装，适当的贮存条件和运输方式，保证化学试剂在贮存、运输和销售过程中不变质。对一些对贮存和运输有特殊要求的应按特殊要求办理。有些化学试剂有一定的保质期，使用时一定要注意。 化学试剂的有效期随着化学品的化学性质的改变，有着很大的区别。一般情况下，化学性质稳定的物质，保存有效期就越长，保存条件也简单。初步判断一个物质的稳定性，可遵循以下几个原则： 1. 无机化合物，只要妥善保管，包装完好无损，可以长期使用。但是，那些容易氧化、容易潮解的物质，在避光、荫凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5年）内保存，具体要看包装和储存条件是否合乎规定。 2. 有机小分子量化合物一般挥发性较强，包装的密闭性要好，可以长时间保存。但容易氧化、受热分解、容易聚合、光敏性物质等，在避光、荫凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5年）内保存，具体要看包装和储存条件是否合乎规定。 有机高分子，尤其是油脂、多糖、蛋白、酶、多肽等生命材料，极易受到微生物、温度、光照的影响，而失去活性，或变质腐败，故此，要冷藏（冻）保存，而且时间也较短。 3. 基准物质、标准物质和高纯物质，原则上要严格按照保存规定来保存，确保包装完好无损，避免受到化学环境的影响，而且保存时间不宜过长。一般情况下，基准物质必须在有效期内使用。 4. 化验室试剂的贮存期为距生产日期五年,应有完整、清晰的标签,以确保品名正确,并在贮存期内使用。 培养基:按规定配制并消毒好培养基,冷至室温,保存在阴暗处(尽可能贮藏在冰箱内),配制好的培养基应在一个月内用完,具体见培养基制备操作规程。 5. 除另有规定外、试液、缓冲液、指示剂(液)的有效期均为半年。HPLC用的流动相、纯化水有效期为15天。 6. 检验用的试剂、配制的试液必须贴好标签,配制的试液必须做好配制记录，其中培养基还必须做使用记录，标准滴定液领用后应做使用记录。检验用试剂的有效期：必须在贮存期内且除另有规定外,液体试剂开启后一年内有效,固体试剂开启后三年内有效。 7. 在贮存期和有效期内液体如发现有分层、浑浊、变色、发霉等异常现象,流动相用于样品检测时，样品的保留时间或相对保留时间发生明显变化，固体如发现吸潮、变色等异常现象则应停止使用。 8. 按公安部毒品要求管理的试剂,除上面规定外,到期经过复验合格的可继续使用。继续使用的复验期为一年。 大多数化学品的稳定性还是比较好的，具体情况要由实际使用要求来判定。如果分析数据作为一般了解，或者分析结果没有特定的准确要求，如一般教学实验，对化学试剂的质量级别就可以做一般要求。但工厂化验数据为指导生产而用，化学试剂的质量指标绝对不能含糊。而用于一般合成制备使用用的化学试剂，在大多数情况下，使用工业级别的化学试剂就可以满足。但研究型和某些特种化学品的合成制备，有些情况下，对原料的质量要求非常严格，需要严格把关。 在实际使用过程中，人们总是习惯于用生产日期来判断化学试剂的有效性，其实大谬不然。例如，在某个高等院校，曾经看到库房管理人员将出厂时间2年以上的化学试剂全部清理出来，准备销毁，理由是已经过期。且不说极大地造成资金浪费，单是那各具特性的化学危险品销毁方案就足以让人望而却步了。何况，还不准商业公司收购，以防商家“骗人”，其情可叹，其境可悲！后来据说将这些大批化学试剂“深挖洞掩埋”了。 化学试剂都没有注明保质期的，确定试剂是否变质主要是凭经验了，要了解化学试剂的理化性质；比如采用的三酸，用个十年八年没问题，浓度稍有变化也不影响使用效果，抗坏血酸也许买回来就发现变质了，有的带结晶水的试剂放久了结块，溶解，只要化学性质不变，没有引入杂质原则上都能用。对于储存期久的试剂可以用在要求不高的检测任务中，对可能变质的试剂可以与新购的试剂对比使用来判断是不是变质了。总之，化学试剂的有效性，首先要根据化学试剂本身的物理化学性质作出基本判断，再对化学试剂的保存状况进行表观观察，然后根据具体需要来作出能否使用的结论。

ELISA试剂盒吸光值均偏高（或线性不够陡）是什么原因?相信在做ELISA试剂盒实验的时候有的朋友遇到过这样一个情况，就是做完ELISA实验发现吸光值都偏高，这是什么原因引起的呢?又要怎么解决呢?吸光值均偏高(或线性不够陡)。a.原因：室温太高(>25℃)。解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。b.原因：底物溶液受到污染。解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。c.原因：反应时间超过太久。解决办法：请控制反应时间。d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)

             ELISA试剂盒检测细胞凋亡的三种常用方法,您知道几种?一、形态学观察方法   1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。   2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：医学教/育网搜集整理活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。   3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。   4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、DNA凝胶电泳1、检测原理    细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA的片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA的片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA的片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。2、结果判断    正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定    凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA的片断组成，可由ELISA法检测。  1、检测步骤  1.1将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；  1.2、在微定量板上吸附组蛋白体；  1.3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；  1.4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；  1.5、加酶的底物，测光吸收制。2、用途   该法敏感性高，可检测5*100/ml凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

       ELISA试剂盒实验材料与试剂配制1）仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。2）缓冲液使用：加5ul的缓冲液于50ul 的样品中，如果样品量不够或者不确定，缓冲液和样品的混合比例不要小于1:10即可，混匀，静置1小时备用（如果标本是血清或者血浆，此步骤忽略）。3）洗液的配制：按1:100的比例配制洗液备用。ELISA试剂盒操作方法如下：一、从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用，试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。二、加入准备好的样品和标准品，37℃反应90分钟；三、洗板2次，加入生物素化人ANG抗体工作液，37℃反应60分钟；四、洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30分钟；五、洗板5次，加入TMB显色液，37℃反应；六、加入TMB终止液；七、30分钟之内读OD值；八、计算标本待测因子含量。

操作这三条ELISA的孵育重点不可不知ELISA试剂盒提示您避免血清沉淀产生的方法：a）解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。b）血清分装冻存时，须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一。c）勿直接由-20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。d）勿将血清置于37℃太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏，从而影响血清的品质。e）血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。f）若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀，温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。操作这三条ELISA的孵育重点不可不知：1、为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；2、洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；3、同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。

2017中秋节国庆节连休放假通知　根据国务院办公厅通知精神，现将2017年中秋节、国庆节放假安排通知如下：　　10月1日（星期日）至8日（星期日）放假调休，共8天。9月30日（星期六）上班。节假日期间，各部门要妥善安排好值班和安全、保卫等工作，遇有重大突发事件，要按规定及时报告并妥善处理，确保人民群众祥和平安度过节日假期。恭祝所有的客户及全体员工节日快乐。　　                                                                                       上海沪震实业有限公司                                          2017年9月30日

SPA夹心ELISA试验检测CIC金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。（一）试剂1．5％与2．5％PEG用0．02mol/LpH7．4PBS配制。2．牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0．05mol/L pH 7．4PBS配制。含0．01mol/L EDTA、0．1％硫柳汞，0．05％Tween 20，4％BSA。3．HRP—SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（HRP）制成结合物。最适工作浓度以方阵法滴定。4．热聚合人IgG：人IgG 10mg/mL，63℃加热20min制成。（二）操作步骤1．用PBS稀释SPA成5Ps/mL，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0．1mL（对照孔不包被），置4℃过夜后洗涤3次备用。2．待测血清0．05mL加PBS0．15mL和5％PEG0．2mL混匀，4℃过夜后1 600r/min离心20min，弃上清，沉淀用2．5％PEG洗2次，加入PBS0．2mL和BSA缓冲液0。2mL，混匀，置37℃水浴30min，摇动，使完全溶解。3．将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃ 60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H202）0．1mL，37C 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。置酶标仪492nm测各孔吸光值。4．标准曲线制备 取正常人血清0．2mL，加热聚合人IsC（120ug/mL）0．2mL，再加PBS0．4mL和5％PEG0．8mL，置4℃过夜。同时做不加热聚合人耽的正常血清对照，以排除血清中干扰因素。沉淀清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液（加等量0．01 mol/LpH7．4PBS）1．6mL溶解并稀释成120、60、30、15、7．5ug/mL，与待测血清同法操作，制成工作标准曲线。5．结果判断 从待测血清吸光度值查标准曲线，即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。以高于正常对照X+2S，即大于28．4ug/mL为阳性。（三）注意事项1．热聚合人IgC应分装贮存于—20℃，不宜反复冻融，否则易解聚。2．PEG的浓度影响CIC沉淀量，须严格配制。

能影响酶免疫测定结果的标本外源性干扰因素外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长和标本凝固不全等。1．标本溶血 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。2．标本被细菌污染 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的p—半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。3．标本贮存时间过长 标本在2～8~C下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8~C下保存1周，如为有菌操作，则建议冷冻保存。样本的长时间保存，应在一70~C以下。4．标本凝固不全 血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则血液通常在半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。因此，血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。5．冷冻保存标本避免反复冻融 冷冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。此外，标本在保存中如出现细菌污染所致的浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 

酶标记荧光信号放大技术在IHC中的应用目前IHC方法可用许多的方法进行检测，如ABC法、S-P法、CSA法、EnVision法等。可用于标记的酶有HRP、AKP和葡萄糖氧化酶等。最后可通过酶促反应使其在抗原抗体结合部位转化为一定颜色的可见沉积物，对抗原进行定位、定量分析。这些转化物可根据底物不同，产生不同的颜色，如NBT／BCIP为紫蓝色，AEC／H202为红色，DAB／H202为棕褐色等。而另一种酶促反应可产生一种能在一定波长光照射下生成各种明亮荧光，使IHC敏感性大大提高。Larison等（1995）较早报道了荧光发生素—磷酸酶底物（fluorogenic Phosphate sesubstrate）方法，用于IHC的信号检测放大。该方法将标记在抗体上的碱磷酸催化酶底物，转化成能产生荧光的基团分子。Larison所用磷酸酶底物为2—（5，—氯—2，—羟苯基）—6—氯—4（3H）—喹吡啉，也称ELF-97磷酸盐底物，并检测冰冻切片——石斑鱼视黄醛组织内的多种抗原成分。其操作流程如下。（1）常规石斑鱼视黄醛组织冰冻切片16t~m厚，经固定，PBS洗。（2）浸入阻断液内洗30min（阻断液：30mmol／L Tris盐、150mmol／L NaCl、1%BSA、0．5％TritonX-IOO，pH7．5）。（3）滴加适当稀释特异性一抗，37~C，1h，PBS洗3X3min。（4）生物素化二抗，37~C，30min，PBS洗3X3min。（5）链霉亲和素—AKP，37~C，30min，PBS洗3X3min。（6）荧光信号转化：将切片浸入ELF磷酸盐底物液[ELF磷酸盐底物液：将3t~mol／L2—（5，—氯—2，—羟苯基）—6—氯—4（3玎）—喹吡啉加入至底物缓冲液（底物缓冲液：10mmol／LTris、200mmol／LNaCl、lmmol／lMgCl、0．1mmol／lZnCl2和0．1％二甲亚砜）内]，反应8～12s，快速除去反应底物，用阻断缓冲液（阻断缓冲液：150mmol／LTris、lOOmmol／LED—TA、lmmol／L左旋咪唑、0．05％TritonX—100，pH8．0）洗20min，中止反应。（7）用0．125~mol／LHoechst33342衬染3min，PBS洗，无水甘油封片。荧光显微镜下观察（激发波长为360nm；发射波长为540nm）。在荧光显微镜下可见ELF底物产生明亮的黄绿色荧光，沉积在抗原抗体结合部位。Larison等的结果表明，ELF技术在IHC中的应具有以下特点。（1）克服组织标本的自发荧光。ELF—97乙醇沉积物具有180nm以上的Stokes移位，对于组织细胞内的自发荧光位移小的特点，可以有效克服这种缺点。另外，ELF沉积物的荧光信号强度和持续发光时间要较其他标记二抗的荧光发光高500倍，也可以有效地避开自发荧光的影响。（2）具有较好的稳定性。ELF-97磷酸盐染色的固定标本可保存数月或数年，很少出现荧光信号的损失。（3）可用于免疫荧光组织化学的多重标记。ELF产生的亮绿色荧光可与红色荧光（如Texared、罗丹明、藻红蛋白）或蓝色荧光（例如Hoechst、AMCA和Cascade blue）结合进行多重标记。（4）另外，目前分子探针公司已开发了多种ELF免疫组织化学染色试剂盒和细胞学标记试剂盒。商品化试剂盒提供了一种快速、敏感的检测组织细胞内蛋白质和mRNA的方法。

ELISA试剂盒试验获新的技术手段如果该ELISA试剂盒抗原是一个原，或该抗体是一个对某病原具有特异性的抗体，则该抗原或该抗体的结果，可以用来帮助判断，提供血清的个体，是否感染或曾经感染过这个病原。ELISA测定模式包括以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作时差所引起的竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。不同批次的ELISA试剂盒检测试剂盒在制作过程中很难保证质量完全一致，即使是通过批批检的项目其检测结果也存在差异，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂，并且能够保证结果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，避免反复冻融造成试剂的失效。进口elisa试剂盒实验可以说是免疫学反应应用到科研出产中最为广泛最为敏捷的技术手段，那么它的实验前有什么需要准备的？按ELISA试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA试剂盒中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

ELISA试剂盒保温方法在树立ELISA试剂盒办法作反响动力学研讨时，实验标明，两次抗原抗体反响通常在37℃经1～2小时，产物的天然生成可达高峰。湿盒应先放在保温箱中预温至划定的温度，特别是在气温较低的时候更应如斯。抗原抗体反响的完结需求有必定的温度和时刻，这一保温进程称为温育，有人称之为孵育，在ELISA试剂盒中似不恰当。这就是为何ELISA反响老是需求必定时刻的温育。为加速反响，可前进反响的温度，有些实验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的联系只在固相表面上发作。ELISA试剂盒温育常选用的温度有43℃、37℃、室温柔4℃等。室温温育时要平置于操作台上即可。这是一个逐渐平衡的进程，因而需经分散才干到达反响的终点。通常有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶联系物后。不管是水浴仍是湿盒温育，反响板均不宜叠放，以保证各板的温度都能敏捷平衡。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其间的抗原并不是都有平等的和固相抗联系的时机，只要最靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体触摸。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体联系的适宜温度。保温的方法除有的ELISA试剂盒仪器附有特制的电热块外，通常均选用水浴，可将ELISA试剂盒板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度敏捷平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜笼盖板孔，此刻可让反响板漂浮在水面上。若用保温箱，应放在湿盒内，湿盒要选用传热性杰出的资料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最终将ELISA板放在湿纱布上。应留心温育的温度和时刻应按划定力求正确。抗原抗体反响4℃更为完全，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中过夜，以构成最多的沉积。室温温育的反响，操作时的室温应严厉约束在划定的范围内，尺度室温温度是指20～25℃，但具体操作时可根据仿单的请求操控温育。在这以后参加的酶符号抗体与固相抗原的联系也相同如斯。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板一起测定.。但因所需时刻太长，通常不予选用。

专业技术老师带你一起用心挑选ELISA试剂盒ELISA这个方法的原理，大家都很明白，可真正用起来的时候，偶然间就会有点犯糊涂，怎样灵活应用ELISA这个检测方法以及怎样去挑选ELISA试剂盒。有些客户会用OVA（卵清卵白）做一些哮喘，过敏性肠炎的模型，然后会检测粘膜特异性的sIgA以及血清内里IgG，IgE等指标。ELISA检测方法简单，灵敏度高，为ELISA最适合检测血清或者培养上清的细胞因子、胰岛素、激素等排泄型的小分子卵白的定量检测；病原体抗原的定性与定量；评估自己制备的血清抗体的效价等。很多客户有个误区，拿来一个指标就想当然地尝试用ELISA去检测，我还是建议多动脑，该检测活性的检测活性。对付一些小分子的检测，例如：前线腺素、糖皮质激素的检测，我的理解是要用竞争法ELISA去检测，也要购买采用这个方法的盒试剂盒。ELISA试剂盒一般细胞因子的检测，都是采用常规的夹心法ELISA检测，由于因子分子量比力大，一般10几个KD左右，很容易找到两个或多个抗原表位。小分子很难找到两个不通的表位，也就决定了包被抗体和检测抗体无法同时结合小分子并固相化。解决方案便是酶标板上包被二抗，每个孔加入一定量的酶标的小分子，然后加样品，再加不带标志的检测抗体，显色底物。样品的目标小分子的含量越高，吸光度越低。

ELISA试剂盒标准操作流程ELISA试剂盒免费代测中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次ELISA试剂盒验不需用的部分应及时放回冰箱保存。试剂盒的配制：对于每种细胞因子应仔细阅读说明书，注意每批的细节。在使用细胞因子前，瞬时离心试剂瓶，尽可能多地收回其中的细胞因子。根据每批说明书中的细节，将冻干的细胞因子复溶。一般待测抗原标准曲线的线性范围的可通过将标准品做8次2倍系列稀释从2000pg/ml到15pg/ml。可利用标准的elisa试剂盒免费代测操作流程、放大试剂盒、第三类试剂、或改变酶底物系统可在一定范围内提高灵敏度。抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性，酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，ELISA试剂盒免费代测可以按底物显色的程度显示试验结果。为了优化ELISA试剂盒灵敏度，建议孵育标准品和标本。若使用过氧化物酶作为显色系统，应严禁在洗液和稀释液中加叠氮钠，叠氮钠可抑制过氧化物ELISA试剂盒酶的活性。

与您共享ELISA试剂盒比色常见问题ELISA试剂盒比色常见问题共享：以软板为载体的实验，先将板置于规范96孔的座架中，才可进行比色，最好在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这么就可彻底平妥坐入座架中。 比色结果的表达以往通用光密度，现按规则用吸光度，一般的表明办法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表明办法为"A492nm"或"OD492nm"。 比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反响仅加底物液的孔）和空白孔（以盐水或稀释液替代标本作全过程的孔）。ELISA试剂盒实验标本请求 ：不能检查含NaN3的样品，因NaN3按捺辣根过氧化物酶的(HRP)活性。以记载本次实验的试剂状况，这以后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行核算。 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。标本收集后尽早进行获取，获取按有关文献进行，获取后应尽快进行实验，若不能立刻进行实验，可将标本放于-20℃保存，但应防止重复冻融ELISA试剂盒一直以来经过不断的提高本身的专业技术水平和效劳质量，为科研院所、高等院校等实验室有关人员供给非常好的效劳，除深获顾客信任外，更带给顾客高兴和满足，我司卖出的ELISA试剂盒可绕地球一圈，一点都不夸大哦！

ELISA试剂盒实验中血浆的采集,处理和保存ELISA试剂盒试验中血浆的搜集、处理和保留详细关键解析：1、 真空采血针搜集2ml新鲜血液，参加无菌试管中；2、 按1:9参加抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠），30分钟内于冰上别离血浆以削减血小板的污染；（也能够直接用抗凝管搜集）；3、 将搜集血液用离心机4℃，2500rpm离心5min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉积。4、 取上清。 分装冻存备用，2-8℃下，可放置保留24-48小时；-20℃下，可放置保留1个月；-70℃下，可放置保留6个月；5、 依据你的试验需求，取适量上清夜进行各种ELISA测定。 请注意指标说明书上关于抗凝血剂是不是有特殊要求，主张运用EDTA。血浆中除尚富含纤维蛋白原和抗凝剂外，别的成份均同等于血清。注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原搅扰而形成假阳性。

经验分享怎样选购Elisa试剂盒目前市场上的ELISA试剂盒质量参差不齐，如何去挑选适合自己的试剂盒就显得特别重要，具体有以下几点可供参考：一、特异性ELISA试剂盒的特异性与试剂盒的关键组分，抗体对有关，若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗，建议使用双单抗。二、灵敏度灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的能力，用户可根据自己样本中待检指标的量选择合适的试剂盒，如果待检指标量很低，一般的试剂盒不能满足要求，可选择高敏的ELISA试剂盒。三、重复性科学实验讲求重复性，一般ELISA试剂盒，其板内和板间变异系数应该控制在15%以内。四、简便性试剂盒在保证高质量数据的情况下，实验时间越短，操作越便利，越容易受到用户欢迎！这也不妨作为选择试剂盒的一个指标。五、经济性进口分装试剂盒因为省去不少物流和报关费用，与国外原装进口试剂相比价格上有比较大的优惠，而且能提供比较灵活的包装规格，特别是48T等小包装，目前很多客户因为对品牌的信任度问题，主要还是选择国外原装进口，但是国内进口分装比较成熟的公司仍然是一个非常好的选择！六、美誉度一个品牌不光要有知名度，更重要的是美誉度。通过行业调查公司以及网络，相关宣传资料等可以找到美誉度高的ELISA试剂盒供应商，这个反映的不仅是产品质量的问题，对供应商的售前售后服务也是一个非常严格的检验。目前国际上主要的ELISA供应商有R&D细胞因子方面的试剂盒，Bender粘附分子方面的试剂盒，Cayman花生四烯酸类产品的试剂盒，Merck(Linco)内分泌研究方面的试剂盒，Invitrogen(Biosource)磷酸化蛋白的ELISA，动物细胞因子ELISA试剂盒等。七、文献引用产品的文献引用特别是高质量的SCI文章的引用是很多用户都关心的问题，这是业界对产品认可的一个非常重要指标，而且对相关用户的科研有一定的借鉴作用。

Elisa抗原抗体包被技术分享将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。    脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。

洗板时ELISA试剂盒的洗液不能混用ELISA试剂盒洗板时留神各种试剂盒的洗液不要混用。然后削弱蛋白质与固相载体的联络，并借助于亲水基团和水分子的联络作用，使蛋白质回复到水溶液状况，然后脱离固相载体。洗刷液中的非离子型洗刷剂通常是吐温20，其浓度0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。假定洗液需要稀释，应按恳求稀释，所用的水电导率最好在1.5us/cm之下，洗液假定结晶应待其融解后制作。保证洗板浸泡时刻为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越洁净洗刷作用非常好，手艺洗板防止洗液在孔内构成气泡。ELISA试剂盒选择着试验的胜败。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗刷时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗刷下来。反响板不宜叠放，以保证各板的温度都能灵敏平衡。其他温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，主张为了客观的区别作用，将质控放在非边缘方位。便是靠洗刷来到达别离游离的和联络的酶符号物的意图。经过洗刷以铲除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体联络的物质，以及在反响过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。应留神温育的温度和时刻应按规则力求准确。ELISA试剂盒温育是在空气浴中完毕，选用水浴会构成值偏高或花板。

ELISA试剂盒样本加样技巧ELISA试剂盒实验有很多关键技术点，在前面的资讯内容中也为咱们介绍过不少。近段时间，不少的客户通过留言或来电都咨询过ELISA试剂盒加样的技巧，今天，我司就为咱们具体介绍：1.细胞上清：前处理有必要是细胞离心去掉，每孔直接加100μl即可。假设浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。2.脑脊液：前处理有必要是细胞离心去掉，每孔直接加100μl即可。假设浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。3.血清血浆：请参与ELISA试剂盒50ul样本分析缓冲液后加50ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量参与，缺少部分用标准品稀释液补偿至100ul。A 血清标本应是天然凝聚后，取上清，防止在冰箱中凝聚血液；B 血浆标本，举荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时查看，标本收集后请分装，冻存于－20℃，防止重复冻融。C 血清标本不该添加任何防腐剂或抗凝剂；D 标本应清澈通明，查看前样本中如有悬浮物应通过离心去掉。E 请勿运用溶血，高血脂或污染的标本查看，否则效果将不精确。4.组织匀浆液的样本要制备过程中需要在缓冲液中参与蛋白酶克制剂，防止蛋白成份被内源性蛋白酶降解，构成查看效果的值偏低。因组织匀浆液的样本蛋白品种多，含量丰盛，实验参照血清血浆标本的处理方法进行，否则就会影响实验效果。具体是参与50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，需稀释时，请将样本与样本分析缓冲液等量参与，缺少部分用标准品稀释液补偿至100ul。因为ELISA试剂盒政策蛋白不一样，或许构成降解的蛋白类型或许不一样，假设实验前通过文献断定用哪种蛋白酶克制剂，有针对性参与，可节省克制剂。假设查不到有关文献，可采用组合克制的方法确保蛋白不易被降解。

pcr 实验看这篇就够了聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。一pcr 实验步骤pcr 反应试剂dna 模板与特定 dna 模板结合的引物去离子水商业化的 dna 聚合酶以及缓冲液dntpmgso4（可选）dmso（可选）pcr 反应准备工作pcr 反应开始前，你需要准备好 dna 模板（基因组 dna 或者反转录制备的 cdna）, 特异性的引物（手动设计或利用软件设计）并选择合适的商业化 dna 聚合酶（根据实验的目的不同做出决定）。dna 聚合酶的选择市面上有多种 dna 聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将 dna 聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的 taq 聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的 pcr 产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的 taq 聚合酶已经足够。另外要注意的一点是，进行 t 载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有 a 末端的，因此你在 t 载体连接之前需要进行加 a 反应。或者直接选用普通的 taq 聚合酶。引物引物特异性会影响到 pcr 反应成功的可能性，好的引物设计对 pcr 成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑：引物长度。通常 pcr 引物长度在 18~22 个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。解链温度 （tm）。tm 值的定义是使得一半双链 dna 解螺旋成为单链 dna 的温度。引物的 tm 值通常要在 52~58 ℃ 之间。gc 含量。最适合的 gc 含量为 40~60%。就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如 primer 5 和 oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。pcr 操作流程pcr 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。准备好各种试剂和 pcr 仪，就可以开始 pcr 实验：将各种试剂混合并按照说明书设置 pcr 反应。一般 pcr 循环如下：起始步骤：这对于热启动 pcr 而言是必须的，将反应混合液加热至 94~98 ℃ 以激活 dna 聚合酶。这一步的时间取决于所选用的 dna 聚合酶。变性步骤：dna 本身是双链结构，而 dna 扩增需要引物与单链 dna 模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至 94～98 ℃ 保持 20～30 秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链 dna。这是 pcr 循环中的第一步。退火步骤：变性之后，dna 模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与 dna 模板互补，当反应温度降至 50~65 ℃ 时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的 tm 值，通常比引物 tm 值低 3～5 ℃。这一步通常维持 20～40 秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始 dna 合成。延伸步骤：在这一步，dna 聚合酶开始 dna 合成，因此这一步的温度选取的是 dna 聚合酶的最优温度。通常我们选用 72 ℃，但某些 dna 聚合酶的最适温度是 68 ℃。这一步与体内的 dna 复制很相似：dna 聚合酶按照碱基互补规律将 dntps 加到引物的 3’ 末端最终得到新的 dna 双链片段。延伸时间取决于目的 dna 片段的长度和 dna 聚合酶的合成能力。一般而言 dna 聚合酶每 60 秒能够合成 1 kb 长度的 dna。循环：第 2 步至第 4 步称为一个循环。每次循环之后 dna 的量均是前一次的两倍。通常一次 pcr 反应进行 30~35 个循环。在前几轮的 pcr 循环过程中 pcr 产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着 dntps 和引物的量的减少以及 dna 聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此 pcr 反应的产量也受到了限制。最后的延伸步骤：当 30~35 个循环结束后，我们通常会以 68~74 ℃ 延伸 5~10 分钟，这是希望使反应体系中残留的单链 dna 全部反应完毕。保存温度：通常我们设置 4~10 ℃ 为反应后 pcr 产物的保存温度。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。pcr 的反应动力学 pcr 的三个反应步骤反复进行，使 dna 扩增量呈指数上升。反应最终的 dna 扩增量可用 y=(1+x)n 计算。y 代表 dna 片段扩增后的拷贝数，x 表示平均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列 dna 片段的增加呈指数形式，随着 pcr 产物的逐渐积累，被扩增的 dna 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现「停滞效应」，这种效应称平台期数、pcr 扩增效率及 dna 聚合酶 pcr 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。pcr 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5’ 端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的。以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 dna 为模板，引物是从 3’ 端开始延伸，其 5’ 端是固定的，3’ 端则没有固定的止点，长短不一，这就是「长产物片段」。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链 (即「长产物片段」) 结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5’ 端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3’ 端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的「短产物片段」。不难看出「短产物片段」是按指数倍数增加，而「长产物片段」则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 pcr 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 dna 片段供分析与检测用。二pcr 常见问题原因及对策无扩增条带酶失活或在反应体系中未加入酶。taqdna 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 dna 脱嘌呤而影响 pcr 的结果。变性温度是否准确：pcr 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 taq 酶以前，将反应体系 95 ℃ 加热 5~10 分钟。引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。引物错误。利用 blast 检查引物特异性或重新设计引物。dna 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 dna 凝胶和 pcr 程序的问题。pcr 产物量过少退火温度不合适。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 pcr 反应优化退火温度。dna 模板量太少。增加 dna 模板量。pcr 循环数不足。增加反应循环数。引物量不足。增加体系中引物含量。延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。变性时间过长。变性时间过长会导致 dna 聚合酶失活。dna 模板中存在抑制剂。确保 dna 模板干净。扩增产物在凝胶呈弥散状酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。dntp 浓度过高。减少 dntp 的浓度。mgcl2 浓度过高。可适当降低其用量。模板量过多。质粒 dna 的用量应 引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 pcr 反应。循环次数过多。增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用两种温度的 pcr 循环。退火温度过低。电泳体系有问题：① 凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；② 凝胶没有凝固好；③ 琼脂糖质量差。若为 pcr 试剂盒则可能：① 由于运输储存不当引起试剂盒失效；② 试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。扩增产物出现多条带（杂带）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 pcr 反应优化退火温度。样品处理不当。mg2+ 浓度偏高，因适当调整 mg2+ 使用浓度。若为 pcr 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。引物特异性差。利用 blast 检查引物特异性或重新设计引物。引物量过多。减少反应体系中引物的用量。模板量过多。质粒 dna 的用量应 外源 dna 污染。确保操作的洁净。阴性对照出现条带试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。条带大小与理论不符污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。模板或引物使用错误。更换引物和模板。基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 blast 研究。

细胞培养最常遇到的问题都在这了1培养液 pH 值变化太快>>>>原因CO2张力不对培养瓶盖拧得太紧NaHCO3缓冲系统缓冲力不足培养液中盐浓度不正确细菌、酵母或真菌污染>>>>对策按培养液中 NaHCO3浓度增加或减少培养箱内 CO2浓度，2.0 g/L 到 3.7 g/L 浓度 NaHCO3对应 CO2浓度为 5％ 到 10％。或者改用不依赖 CO2培养液松开瓶盖 1/4 圈加 HEPES 缓冲液至 10 到 25 mM 终浓度在 CO2培养环境中改用基于 Earle’s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用 Hank’s 盐配制的培养液丢弃培养物或用抗生素除菌2培养液出现沉淀，pH 值不变>>>>原因用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来冰冻保存培养液>>>>对策用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌将培养液加热到 37 ℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液3培养液出现沉淀，同时 pH 发生变化>>>>原因细菌或真菌污染>>>>对策丢弃培养物或用抗生素除菌4培养细胞不贴壁>>>>原因胰蛋白酶消化过度支原体污染培养液中无贴壁因子>>>>对策缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物改变培养液成分5悬浮细胞成簇>>>>原因培养液中含钙、镁离子支原体污染蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放 DNA>>>>对策用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物用 DNase I 处理细胞6原代细胞培养物污染>>>>原因原代培养组织在进入培养前已污染>>>>对策培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织7培养细胞死亡>>>>原因培养箱内无 CO2培养箱内温度波动太大细胞冻存或复苏过程中损伤培养液渗透压不正确培养液种有毒代谢产物堆积>>>>对策检测培养箱内 CO2检查培养箱内温度取新的保存细胞种检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为 260~350 mOsm/kg。加入额外试剂如 HEPES 或药物都有可能影响培养液渗透压。换入新鲜培养液8培养细胞生长减慢>>>>原因由于更换不同培养液或血清培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏培养物中有少量细菌或真菌污染试剂保存不当接种细胞起始浓度太低，细胞已老化支原体污染>>>>对策比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌血清需保存在 -5 ℃ 到 -20 ℃。培养液需在 2~8 ℃ 避光保存。含血清完全培养液在 2~8 ℃ 保存，并在 2 周内用完增加接种细胞起始浓度，换用新的保种细胞分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物9保存血清最好的方法？建议血清应保存在 -5 ℃ 至 -2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。10如何解冻血清不会使其质量受损？建议将血清从冷冻箱取出后，先置于 2～8 ℃ 冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。11血清解冻后有絮状沉淀物怎么办？血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以 400 g 稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。12为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养 ES 细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。13有必要做热灭活吗？实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是「小黑点」，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37 ℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。14储存冰箱中的胎牛血清出现沉淀？GIBICO 的胎牛血清没有预老化，储存在 2~8 ℃ 时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在 -20 ℃ 储存胎牛血清，避免反复冻融。15如何避免沉淀物的产生？解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20 ℃ 至 4 ℃ 至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如 -20 ℃ 至 37 ℃），实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于 37 ℃ 太久。若在 37 ℃ 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守 56 ℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

表观遗传检测方法以及DNA甲基化数据分析工具分享表观遗传学在肿瘤生成和治疗、干细胞分化等诸多领域扮演了重要角色。日前，西奈山伊坎医学院的一项研究表明，在涉及情绪和抑郁的大脑区域，早期的生活压力会通过长期的转录程序编码终身的压力敏感性。相关研究于6月15日发表于Science杂志，该项研究也属于表观遗传学，具体来说，西奈山的研究人员鉴定出了一种发育转录因子，确定了Otx2(orthodenticlehomeobox2)在持久的基因变化中主要调节因子的作用。虽然这对抑郁行为产生了真实而持久的影响，但令我们惊讶的是，我们也可以通过在成年期间改变Otx2水平在短时间内改变压力敏感性。那么，目前有哪些比较常用的表观遗传检测技术呢？且听我一一道来： 表观遗传检测技术： 1.亚硫酸氢钠测序法（bisulfitesequencing）。通常，DNA甲基化是指5-甲基胞嘧啶（5mC），即在DNA甲基转移酶（DNMT）作用下将甲基集团添加到胞嘧啶的5’C位置上。为了高效准确的分析基因组中所有的甲基化位点，可采用全基因组甲基化（Whole Genome Bisulfite Sequence，WGBS）。WGBS是通过重亚硫酸氢盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶（C）脱氨基转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变，再经PCR将U转变为T，结合NGS便可高效准确地分析基因组中所有甲基化位点。然而此法不易区分DNA甲基化和DNA羟甲基化（5hmC）。那么为了鉴定出5hmC，可将与5hmC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA中，并富集胞嘧啶羟甲基化的基因组片段，而后对富集的片段进行高通量测序即可。测序法能够检测的范围可覆盖全基因组，所需测序测序数据量较少，可广泛用于大样本量的疾病研究和分子育种研究。但是该法不能在单碱基分辨率水平上检测DNA胞嘧啶甲基化状态。 2.染色质免疫沉淀测序技术（chromatin immunoprecipiation sequencing）。组蛋白的翻译后修饰（PTM）（即甲基化、乙酰化、泛素化等）大多发生在赖氨酸位点，且能直接改变染色质结构/动态变化，或通过招募组蛋白修饰蛋白和（或）核小体改构复合体来影响染色体的基因表达情况。因而，目前研究PTM-组蛋白与DNA之间的关系已经成表观遗传学领域中的研究热点。而ChIP-seq方法是最直接识别某种组蛋白修饰位点的方法，它可通过抗PTM抗体有针对性的俘获和富集被修饰的组蛋白，进而获取与这些蛋白结合的DNA片段，将其纯化后可用于高通量测序，获取特定DNA与组蛋白之间的相互作用和结合位点的完整信息。值得注意的是，在进行ChIP-seq实验前，需要仔细评估抗PTM抗体的质量和特异性以及考虑以下问题：其他组蛋白修饰位点的交叉反应、对未修饰蛋白的识别及与核中其它物质的交叉反应等。 3.开放染色质测定（determination of open chromatin）。染色质在细胞分裂过程中往往会凝结成染色体。而每种类型的细胞都有一个特有的染色质结构，包括封闭的染色质（紧紧缠绕在核小体周围并且相对不活跃）和开放的染色质（宽松的DNA片段，可与相应的调控元件相互作用）。美国Jackson实验室的研究小组研发了一种关于开放染色质的全基因组分析法，可用于识别引起特定类型白血病的细胞。结果发现大量肿瘤细胞中的染色质呈开放状态，且又因染色质结构有着细胞特异性，因而该方法也可用来识别癌细胞的起源。这项研究利用最新的基因组测序技术，迅速地将研究结果与人类基因组数据进行整合和比较，揭示了最具有转化相关性的潜在生物学机制。 4.3D染色质捕获分析（3D chromatin capture），最新研究表明，远程基因组元件，如增强子和启动子，能通过染色质的相互作用而被带入其他区域，调控临近位置的基因转录，打破了传统对于基因调控的理解，同时也只指出了三维染色质结构的重要性。随着染色质构象捕获（chromatin conformation capture，3C）及更高通量的衍生技术的出现，研究人员对阐明染色质的复杂结构有了进一步的了解。该技术主要经过染色质甲醛交联染色体邻近区域、酶切交联DNA片断对、反向连接、扩增测序等步骤来分析染色质在核内的空间构象。也许将来Hi-3C技术会有进一步的发展，可使该技术分辨率更高，能够提供更为精细的染色质互作的组图谱，使得人们更加深入的了解基因调控和人类疾病。

新手指南:如何设计CRISPR实验进行基因组编辑简介 CRISPR和CRISPR关联系统(CAs)是强大的基因编辑技术。最初被发现是在细菌体内特有的，内源CRISPR系统以RNA依赖的防御机制抵抗外来噬菌体DNA的入侵。细菌和古菌进化的自适应免疫防御，称为群集定期空隙短期复发性重复(CRISPR)/CRISPR关联(CAs)系统，使用短RNA可以直接降解外源核酸。 2013年，CRISPRcas9基因组编辑以其能使目标DNA双链断裂的能力被开发利用,是分子生物学中革命性的进展。本文涉及CRISPR实验设计的基础知识。一．CRISPR的基本原理说明2012年，Makarova等人将内源的CRISPR系统分为三类:I型、II型和III型。由内生型II系统改编和简化的CRISPR基因组编辑工具主要有以下组件构成:1.Cas9:核酸内切酶,其作用是诱导基因组DNA双链断裂,允许基因或DNA序列的移除,以及在特定位点外源DNA的整合。2.向导RNA(gRNA):这种RNA具有一段特殊序列，是Cas9结合所必须的,以及一个20个核苷酸的自定义间隔序列。3.同源重组模板(可选):这是一个包含突变的DNA片段,用于引入同源区域。 二．CRISPR/Cas9基因编辑是如何进行的?1.在同一细胞中表达gRNA和Cas9,形成gRNA:Cas9复合物以招募目标DNA序列,其位于上游的一个前间区序列邻近基序(PAM)，大多数Cas9酶识别PAM基序是依赖于NGG序列（一个任意核苷酸之后带有2个鸟嘌呤核苷酸)。2.gRNA与目标DNA的结合是通过互补碱基配对原则，基因组目的序列和gRNA上的20个核苷酸的间隔区识别。随后gRNA：Cas复合物上的Cas9酶切断基因组DNA，导致PAM序列后的DNA双链断裂。至关重要的是，Cas9不能消化DNA，除非DNA结合到gRNA上，因此具有系统特异性。3.最后，通过内源非同源性末端接合(NHEJ)途径修复断裂，至此编辑过程完成。虽然这种DNA修复系统是最有效的修复途径,但也容易出错,有时会有小的插入或删除,会导致移码，降低蛋白质产量。另一种选择是利用内生同源性定向修复(HDR)系统，通过提供同源重组模板,通常在需要引入目标突变时使用。 三．目标序列和gRNA注意事项:1.在设计gRNA之前,确定你的目标DNA的精确序列，如果gRNA和目标DNA不同，则会降低效率。同时，检查是否有物种特异性，细胞专一性，多态性。2.接下来，确定所有PAM序列(NGG)在你的兴趣区域内。一旦确定，你可以在最佳的潜在目标区域进行选择。3.基于PAM的位置设计gRNA和HR模板(如果使用)。gRNA必须匹配目标DNA,同样重要的是,gRNA不应该与任何其他的远离目标序列的基因组位点匹配。HR模板设计好之后克隆进载体中 四．CRISPR结构的转染和筛选设计好gRNA和HR模板后,将Cas9质粒和gRNA及HR载体共转染至已选择好的细胞株中，可以使用脂质转染、电穿孔或显微注射等转染方法。转染后,下一步即为筛选，可以通过限制片段长度多态性分析(RFLP),TIDE分析，测序技术或荧光激活细胞分选(流式细胞术)等方法进行。最优的筛选方法取决于你所做的修饰和所选细胞系。 五．Tips最终，CRISPR基因组编辑实验的效率好坏，一部分在于计划，一部分在于运气。系统组件和Cas9的相互作用机制还不是很清楚。使用高质量的完整DNA，确保没有RNA和其他污染物。检查HR模板与Cas9/PAM的结合位点，这些位点有可能会导致模板降解。对PAM位点进行筛选，通过沉默突变移除它们。NGG替换为NAG是不起作用的，NAG是一个隐藏的PAM位点。