SPA夹心ELISA试验检测CIC

SPA夹心ELISA试验检测CIC

金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。

（一）试剂

1．5％与2．5％PEG用0．02mol/LpH7．4PBS配制。

2．牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0．05mol/L pH 7．4PBS配制。含0．01mol/L EDTA、0．1％硫柳汞，0．05％Tween 20，4％BSA。

3．HRP—SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（HRP）制成结合物。最适工作浓度以方阵法滴定。

4．热聚合人IgG：人IgG 10mg/mL，63℃加热20min制成。

（二）操作步骤

1．用PBS稀释SPA成5Ps/mL，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0．1mL（对照孔不包被），置4℃过夜后洗涤3次备用。

2．待测血清0．05mL加PBS0．15mL和5％PEG0．2mL混匀，4℃过夜后1 600r/min离心20min，弃上清，沉淀用2．5％PEG洗2次，加入PBS0．2mL和BSA缓冲液0。2mL，混匀，置37℃水浴30min，摇动，使完全溶解。

3．将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃ 60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H202）0．1mL，37C 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。置酶标仪492nm测各孔吸光值。

4．标准曲线制备 取正常人血清0．2mL，加热聚合人IsC（120ug/mL）0．2mL，再加PBS0．4mL和5％PEG0．8mL，置4℃过夜。同时做不加热聚合人耽的正常血清对照，以排除血清中干扰因素。沉淀清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液（加等量0．01 mol/LpH7．4PBS）1．6mL溶解并稀释成120、60、30、15、7．5ug/mL，与待测血清同法操作，制成工作标准曲线。

5．结果判断 从待测血清吸光度值查标准曲线，即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。以高于正常对照X+2S，即大于28．4ug/mL为阳性。

（三）注意事项

1．热聚合人IgC应分装贮存于—20℃，不宜反复冻融，否则易解聚。

2．PEG的浓度影响CIC沉淀量，须严格配制。