表观遗传检测方法以及DNA甲基化数据分析工具分享

表观遗传学在肿瘤生成和治疗、干细胞分化等诸多领域扮演了重要角色。日前，西奈山伊坎医学院的一项研究表明，在涉及情绪和抑郁的大脑区域，早期的生活压力会通过长期的转录程序编码终身的压力敏感性。相关研究于6月15日发表于Science杂志，该项研究也属于表观遗传学，具体来说，西奈山的研究人员鉴定出了一种发育转录因子，确定了Otx2(orthodenticlehomeobox2)在持久的基因变化中主要调节因子的作用。虽然这对抑郁行为产生了真实而持久的影响，但令我们惊讶的是，我们也可以通过在成年期间改变Otx2水平在短时间内改变压力敏感性。那么，目前有哪些比较常用的表观遗传检测技术呢？且听我一一道来：

表观遗传检测技术：

1.亚硫酸氢钠测序法（bisulfitesequencing）。

通常，DNA甲基化是指5-甲基胞嘧啶（5mC），即在DNA甲基转移酶（DNMT）作用下将甲基集团添加到胞嘧啶的5’C位置上。为了高效准确的分析基因组中所有的甲基化位点，可采用全基因组甲基化（Whole Genome Bisulfite Sequence，WGBS）。WGBS是通过重亚硫酸氢盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶（C）脱氨基转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变，再经PCR将U转变为T，结合NGS便可高效准确地分析基因组中所有甲基化位点。然而此法不易区分DNA甲基化和DNA羟甲基化（5hmC）。那么为了鉴定出5hmC，可将与5hmC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA中，并富集胞嘧啶羟甲基化的基因组片段，而后对富集的片段进行高通量测序即可。

测序法能够检测的范围可覆盖全基因组，所需测序测序数据量较少，可广泛用于大样本量的疾病研究和分子育种研究。但是该法不能在单碱基分辨率水平上检测DNA胞嘧啶甲基化状态。

2.染色质免疫沉淀测序技术（chromatin immunoprecipiation sequencing）。

组蛋白的翻译后修饰（PTM）（即甲基化、乙酰化、泛素化等）大多发生在赖氨酸位点，且能直接改变染色质结构/动态变化，或通过招募组蛋白修饰蛋白和（或）核小体改构复合体来影响染色体的基因表达情况。因而，目前研究PTM-组蛋白与DNA之间的关系已经成表观遗传学领域中的研究热点。而ChIP-seq方法是最直接识别某种组蛋白修饰位点的方法，它可通过抗PTM抗体有针对性的俘获和富集被修饰的组蛋白，进而获取与这些蛋白结合的DNA片段，将其纯化后可用于高通量测序，获取特定DNA与组蛋白之间的相互作用和结合位点的完整信息。值得注意的是，在进行ChIP-seq实验前，需要仔细评估抗PTM抗体的质量和特异性以及考虑以下问题：其他组蛋白修饰位点的交叉反应、对未修饰蛋白的识别及与核中其它物质的交叉反应等。

3.开放染色质测定（determination of open chromatin）。

染色质在细胞分裂过程中往往会凝结成染色体。而每种类型的细胞都有一个特有的染色质结构，包括封闭的染色质（紧紧缠绕在核小体周围并且相对不活跃）和开放的染色质（宽松的DNA片段，可与相应的调控元件相互作用）。美国Jackson实验室的研究小组研发了一种关于开放染色质的全基因组分析法，可用于识别引起特定类型白血病的细胞。结果发现大量肿瘤细胞中的染色质呈开放状态，且又因染色质结构有着细胞特异性，因而该方法也可用来识别癌细胞的起源。这项研究利用最新的基因组测序技术，迅速地将研究结果与人类基因组数据进行整合和比较，揭示了最具有转化相关性的潜在生物学机制。

4.3D染色质捕获分析（3D chromatin capture），

最新研究表明，远程基因组元件，如增强子和启动子，能通过染色质的相互作用而被带入其他区域，调控临近位置的基因转录，打破了传统对于基因调控的理解，同时也只指出了三维染色质结构的重要性。随着染色质构象捕获（chromatin conformation capture，3C）及更高通量的衍生技术的出现，研究人员对阐明染色质的复杂结构有了进一步的了解。该技术主要经过染色质甲醛交联染色体邻近区域、酶切交联DNA片断对、反向连接、扩增测序等步骤来分析染色质在核内的空间构象。也许将来Hi-3C技术会有进一步的发展，可使该技术分辨率更高，能够提供更为精细的染色质互作的组图谱，使得人们更加深入的了解基因调控和人类疾病。