维生素D的问题要说起来还真是打开话匣子，一言难尽呀！一个检验项目两度登上报纸头条就是维生素D！相对于食物摄入或药物补充维生素D，暴露于阳光应该是最健康、最有效的方式：干香菇和三文鱼的维生素D含量是牛奶和鸡蛋的10-20倍，但是最环保的晒太阳5-10分钟，就可以得到3000单位的维生素D，是食物摄入的50倍之多，所以，多出去晒晒，顺便拍几张靓照！室外沐浴阳光得到的维生素D和饮食、药品获得维生素主要是维生素D2和D3，本身无生物活性，需要在肝脏经25羟化生成25(OH)VitD、在肾脏再经1a羟化转化为具有生物活性的1,25(OH)2 VitD，由于具有生物活性的维生素D在体内含量很少且代谢很快，临床上常常测定25(OH)VitD，在医学研究的维生素D与疾病关系中，指的就是25(OH)VitD。研究维生素D与健康的关系，首先就是要测定准确，然后研究结论才可能可靠！毫无疑问，质谱法是当前测定维生素D的金标准，但是仅能在大型第三方检验公司或研究型医院才能做到，绝大多数的检验科采取的还是基于化学发光的免疫学检测方法。有研究评估了YP、SL、IDS、RS、XMZ五个化学发光平台与质谱法测定维生素D的差异，发现存在-30%到33%的偏差，这可都是世界顶级品牌呀，所以你可以想象万马奔腾的国内品牌，诊断结论和扔个硬币能差到那里去！2009年的纽约时报关于维生素D的头条，就是关于检测方面的，美国QUEST公司（类似国内金域）宣布对近一年维生素检测的客户重新采用质谱法免费重检！女士健康研究是一项观察同时补充维生素D和钙对骨折发生影响的随机对照研究，研究结果没有发现同时补充二者能够降低骨折发生风险，仅仅在亚组分析中发现不易发生骨矿物质沉积障碍的人群如果补充维生素D和钙能够降低骨折风险（是不是有点难懂？），这也从侧面强调精准医学的必要性。对于单独补充维生素D和同时补充维生素D及钙的效果那个更好？有研究发现两种补充方式均能提升生物活性1,25(OH) 2 VitD 水平，但是维生素D和钙联用的提升效果小于单独VitD的补充，也与其它的研究相一致，即联合治疗综合优势反而较单独VitD治疗减少。支持补充维生素能够降低骨折风险的多是小型观察研究，而大型随机对照和基于孟德尔随机分配定律的研究则没有发现补充维生素D能够降低骨折发生风险。但是 请注意，这样的研究结论仅适用于普通人群，对于骨质酥松患者和骨软化症患者，治疗方案本身就包含维生素D和钙剂，上述研究结论不适用。 还有的同志咨询经常性的补充维生素D会不会引起中毒的问题，会不会引起骨质钙化增强影响儿童发育的问题。一般人体摄入>50000U才会中毒 ，普通补充难以达到这样的超高剂量，除非……总之，大量的研究指向普通人群补充维生素D和OmegA-3脂肪酸的无效性，但也无害！从身体健康和经济学的双重角度出发，还是祖国的传统医学讲的好：均衡膳食，阴阳平衡！

抗体从哪儿来？介绍抗体之前，我们先来看看人体的免疫系统。人体的免疫系统主要由三道防线组成。第一道防线是皮肤和黏膜，比如我们的表皮、鼻孔里的鼻毛，口腔里的黏膜等，它们可以阻挡并清除大多数异物。 第二道防线是体液中的杀菌物质和吞噬细胞。 杀菌物质能够破坏细菌的细胞壁使其死亡，吞噬细胞可以吞噬和消灭侵入人体的各种病原体。人体的第一道和第二道防线生来就有，是一种自然的、广泛的保护力，并不针对某一种特定的病原体，因此被称为非特异性免疫或 固有免疫（如果把我们的身体比喻成一座城池，那第一和第二道防线就是城墙、护城河）。而免疫系统的 第三道防线则是人体在出生以后，在特定抗原的刺激下，逐渐建立起来、只针对该抗原起作用的后天防御功能。 主要由各种免疫器官（如扁桃体、淋巴结、胸腺、骨髓和脾脏等）和免疫细胞（淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞）借助血液循环和淋巴循环组成，又称为特异性免疫或 适应性免疫（城里的警察）， 抗体便是由特定的免疫细胞产生的。身体内做坏事的不法分子即 抗原（antigen，ag），是指任何可以诱发机体免疫反应的物质，比如细菌、病毒、花粉等等。 当一些不法分子渡过了护城河、翻过了城墙，沾沾自喜地以为成功地混进了城里，却不想自己早已被几个不同的神秘组织给盯上了。这些神秘组织的成员训练有素，他们明白自己势单力薄，没法独自应对穷凶极恶的不法分子，于是悄悄地跟踪、围堵，并及时联络了城里的警察前来消灭不法分子。这些神秘组织就是 抗原递呈细胞（antigen-presenting cell，apc）。抗原递呈细胞又称辅佐细胞，它们可以摄取、处理和传递抗原信息，经过一系列信号传递过程刺激了b细胞分化为效应b细胞并分泌产生抗体。所以， 抗体（antibody）便是机体在经历这些抗原刺激后产生的相应的、具有保护作用的蛋白质，是活化的b细胞为了消灭特定抗原，“发明”的一种高性能、多用途的厉害武器。抗体如何保护我们？抗体是一种具有“y”型结构的蛋白质，其功能的发挥与其结构密不可分。抗体结构示意图：“y”型结构上半部分的两个枝丫（fab段）是抗体能够与特定的抗原表面的抗原表位结合的关键，而下面的杆（fc段）则是和很多免疫细胞结合并发挥功能的关键抗体发挥作用主要是通过以下几种方式：1.中和作用：抗体通过fab段直接结合抗原，与抗原表面的蛋白结合，使这些蛋白无法与细胞上的受体结合，阻止病原进入细胞。举个例子：新冠病毒进入身体后，其表面的刺突糖蛋白（s蛋白）需要与细胞表面的ace2受体（s蛋白的相应受体）结合后才能进入细胞。抗体抢先和s蛋白结合，占据了这些位置以后，病毒便无法再利用s蛋白侵入细胞了。2.凝集作用：当一些颗粒状结构的病原体与相应的抗体共存时，抗体就会像“桥梁”一样结合病原体，使得多个病原体相互集结，形成较大的团块，便于吞噬细胞吞噬病原体。3.调理作用：某些抗体的fc段可以与中性粒细胞、巨噬细胞表面的相应受体（fcr）结合，增强其吞噬病原体的能力。插一句嘴：日常生活中，很多人会对花粉、灰尘等过敏，这是因为身体免疫系统将花粉等物质当作了抗原物质。 当免疫细胞第一次接触这些抗原时，对其产生免疫反应，产生了很多特异性抗体，机体进入敏感状态。当这些免疫细胞再次接触相同抗原时，抗体会迅速与抗原结合，而抗体的另一端会结合至肥大细胞的表面，诱导肥大细胞产生一定的反应，并释放一些物质如组胺，造成平滑肌收缩，粘液分泌增加，出现气喘等过敏症状。4.抗体依赖细胞介导的细胞毒作用：病原体成功感染细胞以后，会在细胞内进行“殖民”，利用其资源、生产工具来制造新的病毒（生产过程中会有一些病毒的外壳蛋白展现在细胞表面成为可以识别的抗原）。相应的抗体通过其fab段与宿主细胞表面的病毒抗原结合，再通过fc段与具有杀伤性的细胞（如nk细胞等）表面表达的fc受体结合，让这些杀伤细胞杀死感染的病毒的细胞，同时也把病毒消灭了。5.补体激活作用：补体是另一种杀伤病原体的特效武器，在免疫过程中发挥着多种重要作用，而在抗体的帮助下，免疫系统可以活化、调用这些武器。6.通过胎盘及黏膜：抗体按照其重链的不同可以分为五种：iga、igd、ige、igg、igm，各类抗体的功能各不相同。其中igg可以通过胎盘进入婴儿血液中，为婴儿提供天然的被动免疫，所以婴儿虽然娇弱，但是妈妈的抗体可以保护他们。而免疫球蛋白中的iga可以穿过黏膜，是黏膜局部抗感染的主要因素。总而言之，抗体发挥作用的主要方式是：其fab段可以识别并和病原体结合使其失去感染能力， fc段可以和其他免疫细胞上的fc受体结合，借助免疫细胞发挥作用。总结 :抗体的化学本质是蛋白，由效应b细胞产生，是免疫系统非常重要的成员。从胎儿时期开始，它（主要是igg）就可以通过胎盘保护我们的健康，在我们长大并接触了多种抗原后，相应的抗体会分泌到全身各处保护我们的安全。我们注射的许多疫苗，也是为了通过免疫反应对已知的病原体产生抗体。抗体还可以用于治疗多种疾病。在身体遇到自身免疫系统无法战胜的病原体时，可以利用他人或者其他动物的含有相应抗体的血浆/血清进行被动免疫，如：抗蛇毒血清、新冠肺炎康复者的血浆。肿瘤的抗体治疗是抗体药物治疗的重要方向，例如pd-1/pd-l1抗体药物，已经成为了癌症治疗的明星。现在科研人员已经可以通过基因工程技术对抗体进行改造，使其可以更加安全、有效，临床上用抗体治疗癌症的例子也越来越多。

巨噬细胞是人体免疫系统的重要组成细胞。它可以吞噬细胞残片、垃圾，消化病原体，发挥 “清道夫” 的作用，还能像 “哨兵” 一样提醒其他免疫细胞“有敌入侵，准备战斗”，在免疫细胞与病原体激战时，它也常常冲在最前面。随着研究的深入，科学家们发现，它还可以调控器官发育、维持组织细胞间稳态、影响组织再生、参与神经系统修复等。巨噬细胞功能失调与癌症、糖尿病及阿尔茨海默病等多种疾病密切相关。但一直以来人们并不清楚，这种细胞最初来自哪里。日前，一项研究揭示了人胚胎巨噬细胞的多重起源及发育过程，解析了组织驻留巨噬细胞特化过程的关键分子特征。相关研究成果在线发表于《自然》，由解放军第五医学中心刘兵课题组、暨南大学基础医学院兰雨课题组等合作完成。寻找巨噬细胞来源的 “金钥匙”除了为人熟知的免疫功能，巨噬细胞也发挥着一些重要的非免疫作用。比如，胚胎早期，巨噬细胞参与卵黄囊脂质代谢、造血微环境形成、骨和神经系统发育等过程。对成年个体来说，新生成的血液和免疫细胞一般被认为是由造血干细胞分化而来。但新近研究发现，小鼠体内有一些巨噬细胞比造血干细胞出现得还早，它通过自我更新，稳定持续地存在着。也就是说，这类巨噬细胞并非由造血干细胞分化而来。已有研究发现，巨噬细胞早在小鼠肝脏造血发生前就在卵黄囊中发育分化了，在趋化因子诱导下，它随着血液到达脑部、表皮、肝脏等各个器官或组织中 “长期驻扎”，形成组织驻留型巨噬细胞。“小鼠中的发现，让我们自然想探究人巨噬细胞是否也存在多种起源。” 该研究第一作者、暨南大学基础医学院博士后边志磊说。但是，由于胚胎样本获取不易、发育早期的巨噬细胞极其稀少，加之无法追踪标记等客观原因，该领域研究一直无法取得突破性进展。“直到最近几年，单细胞组学技术的出现为解决这一科学难题提供了契机。” 边志磊告诉《中国科学报》，“利用这项技术，课题组在造血发育研究领域不断积淀，终于掌握了探究巨噬细胞来源的‘金钥匙’——单细胞转录组测序。”从卵黄囊中来，到全身去研究人员首先从 8 个 3~8 周人胚卵黄囊、头、肝、循环血、皮肤、肺等组织或器官中，按照发育时间进行定期间隔取样，而后利用高精度的单细胞转录组测序技术，得到 1231 个细胞的高质量测序数据，并据此绘制了人胚造血细胞发育图谱。边志磊介绍，巨噬细胞最早来自于卵黄囊，且分两拨产生，一拨在卵黄囊中直接产生，而后分布到胚胎各处；另一拨是由卵黄囊中的髓系偏向祖细胞迁移到肝脏后，先分化为单核细胞，再分化成巨噬细胞。“这两种发育路径与此前在小鼠中发现的高度相似，表明巨噬细胞发育具有相当的保守性。” 他说。接下来，研究人员分别解析了这两种起源的巨噬细胞的发育过程。头部的小胶质细胞属于第一种起源，在受孕约 34 天后，部分头部巨噬细胞开始出现小胶质细胞分子特征（SALL1 基因）；在受孕约 41 天后，伴随着 C3、P2RY12 等标志性基因表达，头部巨噬细胞逐渐特化为典型的小胶质细胞。肝脏单核细胞则属于第二种起源，卵黄囊中的髓系偏向祖细胞迁移到肝脏后，分别向单核细胞和粒系特征两个方向进行特化，肝脏产生的单核细胞也可进入组织并最终分化为巨噬细胞。为人体巨噬细胞研究奠基为了验证第二种起源的准确性，研究人员还进行了单细胞体外培养实验。边志磊介绍，利用流式检测，他们分离出了 184 个人体最早的、卵黄囊起源的造血祖细胞，进行培养后，最终有约 36% 的单细胞出现增殖和分化。他们随机抽取其中 39 个细胞进行流式检测后发现，大部分细胞都能分化成单核细胞、粒细胞、红细胞等，具有多系分化的潜能。不管是分子特征还是分化能力，这些细胞都更倾向单核及粒细胞特征。“有些巨噬细胞正是从单核细胞分化而来的，这再次说明卵黄囊产生的造血祖细胞的确具有在肝脏分化为单核巨噬细胞的能力。” 边志磊说。该研究通讯作者、暨南大学基础医学院教授兰雨告诉《中国科学报》，“我们的研究解答了组织驻留型巨噬细胞‘从哪里来、到哪里去’的核心问题，从单细胞层面解析了其逐渐发育及特化的分子过程，这可能为巨噬细胞相关疾病的诊断和治疗提供启发。”香港科技大学生命科学部教授温子龙评价说，“该研究跨越人体胚胎的多个发育阶段、覆盖多个组织器官，是目前为止对人体胚胎巨噬细胞发育最系统完整的研究。”“此外，通过胚胎样本获得的在体实验数据比体外实验数据更真实可靠，这为将来人体巨噬细胞的研究奠定了坚实的基础。”

细胞培养的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。大家擦干眼泪，听小编几句话。希望我所说的能帮助你细胞培养的路上，少一点污染，多一点快乐！ 一： 细胞方面1. 买细胞要去靠谱的地方买，比如 ATCC 官网或者丁香通。一般上面会有针对细胞的介绍，这样培养之前可以了解细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。2. 不管是买的细胞，还是别人惠赠的细胞，刚拿到手赶紧的做两件事：检测是否有支原体污染；迅速扩增冻存，冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。3. 发现细胞有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时。细菌污染、真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，可以买个支原体检测的试剂盒定期检测一下。4. 不同细胞生长周期不同。有的生长很快，比如说 MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又是特别慢，比如 BT474，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满。这就需要要在培养细胞的过程中多多摸索。5. 对于娇弱的细胞，就得细心呵护。胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间。每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住，是每天。二： 操作方面1. 最好不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。自己的东西自己包自己烘干。枪头什么的只要有可能污染就换。2. 严格无菌操作。操作台一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精消毒一遍，稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。3. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，记得要勤换。身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。4. 细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。最好的是同一时间就你一个人在细胞房养细胞。5. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来。刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。

ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。一、样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。二、试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25℃)，一般需在室温放置20～30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。三、样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。四：加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。五：温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。六、洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。七：边缘效应使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。八：显色显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。九：比色比色要注意波长的选择。以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。其次，单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。总结综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。

在体外培养细胞时，往往需要通过倒置显微镜来观察细胞的形态，从而初步的鉴定细胞种类及初步判断细胞生长的状况。虽然每种细胞都有其独特的形态，也有相似的规律可循。如体外培养的细胞，按照其生长方式大体可分为黏附型和悬浮型两大类。一、黏附型细胞黏附型细胞是必须附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。由于体内、外生长环境不同，故细胞在体内、外的黏附方式也存在差异。在体内，细胞的黏附是全方位的，细胞的各个部分都与周围环境相接触，因而细胞外形具有复杂的立体特征。当细胞被转移到体外环境中之后，能够提供附着面的只有培养器皿的壁，大多数情况下，细胞只有一个附着平面，因而培养细胞的外形一般与在体内时明显不同。按照培养细胞的主要形态，可将黏附型细胞分为以下几大类型。1、成纤维细胞型成纤维细胞型的细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形，后两种情况下常具宽扁胞质突起（片状伪足）；胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体一般铺展很开。多数情况下，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。有时也见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形式。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为此型，如成纤维细胞、肌肉细胞、骨与软骨细胞以及血管内皮细胞等。注：①成纤维细胞型；②上皮细胞型；③游走细胞型；④多形细胞型。2、上皮细胞型上皮细胞型的细胞外形类似上皮细胞，细胞大体为扁平，形态较为规整，细胞大致呈多角形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列；当细胞紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，因为相互拥挤而呈现“铺路石样”，局部可构成单层的上皮样“膜片组织”。起源于内、外胚层的细胞体外培养时可能呈现此型，如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。3、游走细胞型体外培养中的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。细胞相互分散，一般不形成群落；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒，常具有胞质突起（伪足）。这类细胞在培养器皿生长的位置不固定，经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些肿瘤细胞。4、多形细胞型多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，类似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞。上述四种形态学类型是黏附型培养细胞的常见形式，也是较为明显的几种形态学形式。然而许多情况下，所培养的细胞并不一定呈现典型的形态形式，而会出现一些过渡形态，甚至同一种细胞不同的培养阶段也会出现不同的培养形态。能够影响细胞形态学特征的主要因素包括血清成分、培养液中的添加成分、培养液的酸碱度、气相环境、温度等条件。二、悬浮型细胞悬浮型细胞在培养时不粘附于支持物上，而是呈悬浮生长状态，如某些癌细胞和血液白细胞。悬浮生长的细胞胞体多为圆球形。适于大量繁殖，缺点是不方便观察。

革兰氏染色(Gram stain)是细菌学比较广泛使用的鉴别染色方法，革兰氏染色的主要步骤是：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不会脱去，有的可以被脱去。前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。为方便进一步观察，脱色后再用碱性蕃红进行复染，阳性菌仍为紫色，阴性菌染成红色，这就是革兰氏染色的原理。其实还有一种方法，能更有效的鉴别与分析活细菌与死细菌，即远慕生物推荐的活细菌染色试剂盒：流动流式细胞术活细菌检测试剂盒 活细菌荧光成像试剂盒。这款产品的作用原理是：MycoLight™520是一种非荧光酯酶底物，可扩散到革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中。在细菌细胞内非特异性酯酶水解后，产生绿色荧光产物并在细菌内积累。与常用的酯酶底物CFDA和CFDA-AM相比，该活细菌染色试剂盒可提供更明亮，更稳定的信号，背景更低，染色方案更容易。《免疫荧光显微镜-Cat#22409》用CFDA或MycoLight™活细菌荧光成像试剂盒染色的大肠杆菌的荧光图像。CFDA在成像之前需要洗涤步骤以最小化背景，而使用该试剂盒不需要洗涤（Cat＃22409）。MycoLight™520的染色效率远高于CFDA，因为更多的细菌显示出绿色荧光。在染色1小时后，MycoLight™520的信号仍留在细胞中，而CFDA很容易漏出。在每个样品中呈现相同量的细菌，并且在相同的暴露时间下拍摄荧光图像。《流式细胞仪-Cat#22407》使用ACEA NovoCyte流式细胞仪在FITC通道中分析大肠杆菌悬浮液的相对活力。读数（计数（％））获自各种活/死大肠杆菌混合物。通过两个不同的峰可以容易地区分每种混合物中的活的和死的种群。

1、细胞培养基的种类按照细胞培养基的发展历史，细胞培养基大致可分为平衡盐溶液、天然细胞培养基、合成细胞培养基、无血清细胞培养基、限定化学成分细胞培养基等几大种类。1.1 平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）BSS主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。其主要用于细胞的漂洗、配制其他试剂等。几种常用的BSS配方如下（表1-1）。D-Hank's与Hank's的一个主要区别是前者不含有Ca2+和Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。因为Ca2+、Mg2+是细胞膜的重要组成成份，参与细胞粘附等功能，使用不含Ca2+、Mg2+的BSS可避免细胞结团。此外，Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液，前者缓冲能力较弱，适合于密闭培养；后者缓冲能力较强，适合于5% CO2的培养条件。表1-1  几种常用的BSS配方（g/L）名称PBS（无Ca2+、Mg2+）PBS（含Ca2+、Mg2+）Earle’sHank’sD-Hank’sKrebs-RingerNaCl8.008.006.808.008.007.00KCl0.200.200.400.400.400.34CaCl2--0.200.14-MgCl2•6H2O-0.10---MgSO4•7H2O--0.20.2-Na2HPO41.151.15-0.0480.0480.10Na2HPO4•2H2O--0.14--0.207KH2PO40.200.20-0.060.06NaHCO3--2.200.350.35-葡萄糖--1.001.00-1.80酚红--0.010.010.01-目前用于细胞培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。此外，血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。目前，血清多作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5~20 %，最常用是10 %。1.2 合成细胞培养基合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。最早开发的基础培养基（minimal essential medium, MEM），其本质为含有盐、氨基酸、维生素和其他必需营养物的pH缓冲的等渗混合物。在此基础上，DMEM、IMDM、HAM F12、PRMI1640等各种合成细胞培养基被不断开发出来。常用合成培养基的配方此处不详细介绍，其特性及应用的范围见下表：哺乳动物细胞培养基：培养基名称特性及应用范围199细胞培养基添加适量的血清后，可广泛用于多种细胞培养，并用于病毒学、疫苗生产等MEM细胞培养基MEM（Minimal Essential Medium）培养基有含Earle's平衡盐的类型，也有含Hanks'平衡盐的类型；有高压灭菌型的，也有过滤除菌型的；还有含非必需氨基酸的类型。是最基本、适用范围最广的细胞培养基。DMEM细胞培养基DMEM（Dulbecco’s modified Minimal Essential Medium）是由Dulbecco在MEM培养基的基础上改良获得的，各成分份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）两种类型。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。IMDM细胞培养基IMDM（Iscove’s modified DMEM ）是由Iscove在DMEM基础上改良，增加了几种氨基酸和胱氨酸量等。可用于杂交瘤细胞培养，以及无血清培养的基础细胞培养基。GMEM细胞培养基Glasgow’s MEM培养基是MEM的改进型，用于支持BHK-21细胞的生长。原配方以BME为基础， 加入10%磷酸胰蛋白(月示)肉汤，氨基酸和维生素浓度加倍。RPMI-1640细胞培养基专门针对淋巴细胞培养设计，含有BSS、21种氨基酸、维生素等，广泛适于多种正常细胞和肿瘤细胞的培养，也用做悬浮细胞培养。HamF12细胞培养基含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F12适用于CHO细胞，也是无血清细胞培养基中常用的基础细胞培养基。DMEM/F12细胞培养基将DMEM和F12按照1:1比例混合，混合后营养成份丰富，血清使用量也减少，常作为开发无血清细胞培养基时的基础细胞培养基。McCoy's5AMcCoy's 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种(如骨髓、皮肤、肺和脾脏等)原代细胞的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。William's Medium E适用于大鼠肝上皮细胞的长期细胞培养。神经元基础培养基可为神经元生长提供基础营养物质。昆虫细胞培养基：培养基名称特性及应用范围Grace's昆虫培养基Grace昆虫培养基（Grace's Insect Medium）最初设计为支持澳大利亚白星橙天蚕蛾 (Antherea eucalypti) 细胞 的生长，是对Wyatt培养基的改良，以更接近 Antherea 血淋巴。Grace用这种培养基建立了第一个连续细胞系。适当补充添加剂后，该基本培养基已用于培养各种昆虫细胞，包括多种鳞翅类以及一些双翅类昆虫。Grace昆虫细胞培养基主要作为 培养基基础，用于培养Sf9 和Sf21细胞系，也用于其它鳞翅类昆虫细胞系的生长和维持。Grace's培养基(Grace’s Insect Cell Culture Medium) 是无血清培养基，使用时需要补充血清，从而为细胞提供必要的营养因子。添加5 -20%胎牛血清后，Grace昆虫细胞培养基可以用于培养多种昆虫细胞。IPL-41 昆虫培养基 IPL-41昆虫培养基（IPL-41 Insect Medium）旨在用于大规模扩增草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞系，也常用于通过杆状病毒表达系统（BEVS）进行蛋白表达。 IPL-41培养基是对原始IPL配方的改良，由美国农业部昆虫病理实验室Weiss等人开发，用于大规模扩增草地贪夜蛾衍生细胞系。Weiss向基础培养基中加入了胎牛血清和TPB培养基（Tryptose Phosphate Broth），成功地实现了IPL-21 AE (III)细胞系的大规模连续培养。该培养基主要用于培养和维护鳞翅类衍生细胞系和扩增这些细胞系的病毒。IPL-41培养基基础也以用于无血清夜蛾细胞的杆状病毒重组蛋白表达。Shield's & Sang Insect向Sheilds-Sang M3昆虫培养基中添加10%胎牛血清后广泛用于培养各种果蝇细胞系。Sheilds-Sang M3昆虫培养基（Sheilds and Sang M3 Insect medium） 基于D22培养基。该培养基支持黑腹果蝇衍生细胞的生长。Sheilds和Sang将原配方中的氯化物除去，用谷氨酸盐提供钠和钾离子，并用游离氨基酸替代乳白蛋白水解物。Bis-Tris作为缓冲剂放置pH变动。Schneider's 果蝇培养基     很多昆虫组织培养基的配方是模拟特定昆虫体液的主要物理化学性质。针对相同物种的不同培养基成分的相似度可能比针对不同物种的培养基之间更低。有多种培养基用于果蝇细胞和组织的体外培养。应用最多的是Schneider 培养基、D-22 培养基。果蝇细胞用于研究各种生物化学过程，包括遗传学、内分泌学、生理学和细胞生物学等方面，以及重组蛋白的表达。加入5-20% 胎牛血清后Schneider培养基能够支持黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）原代细胞和建立的细胞系的快速生长。该培养基用于培养和维护果蝇胚胎衍生的细胞系以及其它双翅目昆虫细胞培养物细胞培养基常用几种重要的添加成分及使用过程中应注意的问题酚红在细胞培养基中用作pH值的指示剂。一般情况下，可以通过酚红的指示作用判断培养基的pH值，但低血清或是无血清细胞培养基中酚红的含量与普通细胞培养基中的酚红含量不同，不能通过肉眼观察或通过经验来判定pH值，建议使用pH计进行测定。酚红通常对含血清的细胞培养基生产的生物制品质量并不会产生明显影响，也可通过纯化技术去除，但酚红在无血清细胞培养基中可能带来胞内钠/钾失衡，影响细胞生长。碳酸氢钠在细胞培养基中主要是作为缓冲系统，此外还具有调节渗透压的作用。通常产品使用说明中的碳酸氢钠推荐量是一个标准、安全量，是在科学的基础上根据实践经验所得。但是由于不同的细胞系（株）不同，同一株细胞适应环境也可能不同（细胞耐受性不同等），且存在的地域性水质差异等，在实际生产过程中也可稍作改动，但使用者需做相应的检测（理化及细胞生产试验等）。HEPES是一种非离子缓冲液，在pH 7.2 ～7.4范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34 g /L）共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。其安全浓度范围是10～25 mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是在没有葡萄糖的条件下，细胞也可以代谢丙酮酸钠。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4 ℃下放置1周可分解50 %，使用中最好单独配制，置-20 ℃冰箱中保存，使用前加入细胞培养液中。赖氨酸（L-lysine）：分子量大于70,000的多聚赖氨酸可以用于促进细胞贴壁生长，也可以用于组织学(Histology)分析时的粘片剂。Poly-L-lysine和Poly-D-lysine都可以用于促进细胞的贴壁生长。Poly-L-lysine可以被某些细胞所消化并吸收，摄入过多的Poly-L-lysine会产生一定的细胞毒性。如果遇到Poly-L-lysine有细胞毒性的情况，可以考虑选用Poly-D-lysine，因为右旋的聚赖氨酸是不会被生物吸收利用的，所以毒性更低。远慕生物致力于生物技术和生命科学等行业领域，专注于植物生物学技术研究，以满足全球不断增长的食品，能源、医药日益增长的需求和发展。目前远慕生物制造和提供的产品主要有动物细胞培养产品（包括细胞培养基、FBS、缓冲溶液、抗菌剂和其他试剂）和植物生物学产品（包括植物组织培养基、凝胶系列产品、植物生长调节剂、抗生素&抗菌剂、生化试剂以及植物组培容器和耗材）。

血清学检测是许多健康问题诊断过程中的关键检测方法，包括器官移植筛查，交叉匹配，疾病诊断，监测等。这些检测在临床决策中起着至关重要的作用，免疫分析是目前可用的最强大，最灵敏的血清学检测方法之一，它基于抗原抗体之间的高度特异性结合，即使在低浓度下也能进行定性和定量检测。有多种免疫测定方法，以下是其中最常见两种检测方法示意图，分别是夹心法（图1A）和直接法（图1B），当选择用于夹心法检测的抗人二抗时（图1A），需要考虑一抗的种属，并使用与该物种有最小交叉反应的二抗。图1：测定方式：A.夹心法，B.直接法免疫分析在多种疾病诊断起重要作用各类免疫测定技术各有优缺点，例如，快速测定法（如胶体金侧向流动法）可在数min 内提供定性结果，可进行即时检测，而ELISA可能需要花费数小时才能完成，但可提供定量数据。而当前严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行更加凸显了侧向流动分析的优势，由于该疾病具有快速传播和较高的死亡率等特征，美国FDA已采取相关措施，允许各州未经FDA批准就可开展新的SARS-CoV-2检测。该修订允许使用快速检测试剂盒，该试剂盒定性检测患者针对SARS-CoV-2产生的IgG和IgM抗体，从而显著加大了SARS-CoV-2的检测能力，尽可能地减少病毒的传播。尽管侧向流动检测具有明显的优势，但这种分析方法无法提供定量的数据。表1.几种类型的免疫测定法的优缺点，检测过程，检测的Ig类型免疫测定方法检测过程可检测免疫球蛋白亚型快速测试/横向流动（胶体金）胶体金层析试纸条主要由4个部分组成：在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜，金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现条带。而质控线不管有无目的样本，都会与金标抗体进行结合并显色，相当于我们的阳性对照，证明金标抗体是正常的。IgG，IgM流式细胞将血清样品添加到带有抗原的细胞或磁珠中，样本中的人源抗体会捕获抗原，再加入荧光探针偶联的二抗（图1B），然后可以通过流式细胞仪分析荧光以给出定量数据。IgG，IgM，IgA流动注射分析（FIA）与流式细胞术相似，将样品注射到含有固定抗原的柱子中，样品中的人源抗体会与抗原结合（图1B），再加入荧光探针或酶偶联抗人的二抗进行检测，用比色或荧光法进行检测。IgG，IgM，IgAELISA法将一抗固定在固体介质表面上，通常是微孔板，随后会捕获抗原（图1A）或将抗原直接包被在板上（图1B），与来自血清的人源抗体结合，加入酶标记的抗人二抗，最后，添加酶底物，从而得到与分析物浓度成正比的比色读数。IgG，IgM，IgA聚合酶链反应（PCR）该过程类似于ELISA，但是第二抗体是与寡核苷酸缀合。然后通过实时PCR进行DNA扩增和检测。IgG，IgM，IgA抗人二抗是各类免疫分析中的关键试剂尽管免疫测定的功能和目的有所不同，但为了在临床上获得准确，可靠数据，开发血清学试剂盒时，高质量试剂至关重要。抗人二抗的质量是开发免疫测定试剂盒时的关键考虑因素，二抗需要谨慎选择，因为它们会结合一种一抗的多个表位上，从而增强了信号的灵敏度和选择性。表2总结了在进行免疫测定选择合适的二抗时需要考虑的多个方面。表2.在免疫分析中选择合适的二抗时的考虑因素以及我们抗体的特征考虑因素Jackson 二抗抗体来源人体样品的血清学检测应使用抗人二抗，以最大程度地减少非特异性结合，以最大程度降低背景信号和假阳性。我们可以提供多种来源的抗人二抗，包括羊驼，驴，山羊，小鼠和兔子。产品类别(完整的IgG还是片段)二抗可以是完整的免疫球蛋白（Ig）G，也可以是F（ab'）2和Fab片段，完整的IgG分子可适用于大多数检测，而F（ab'）2和Fab片段可用于避免与具有Fc受体的活细胞的非特异性结合。我们可以提供完整IgG形式的二抗以及F（ab'）2和Fab片段特异性根据所需免疫测定的特异性，可以制备针对整个Ig分子的二抗，以及针对于Fc或F（ab'）2结构域特异性的二抗。我们可以提供针对于对整个人源Ig分子的二抗，以及针对于Fc和F（ab'）2结构域特异性的二抗。亚型大多数免疫测定均只检测IgG型抗体，这种类型抗体占总血清Ig的?75％，是次级免疫反应的一部分。但是，血清中同时也存在IgM和IgA，而且二抗只对同亚型一抗的具有特异性。我们可以提供对IgG，IgM，IgA，IgG+IgM和IgG+IgM+IgA一种或几种亚型有特异性的二抗。亲和纯化和交叉吸附由于在Ig结构域具有高度的结构保守性，建议对抗体进行亲和纯化并进行交叉血清吸附的，以减少交叉反应的可能性。免疫亲和层析可用于分离亲和纯化的抗体。我们可以选择已进行物种交叉吸附的抗体，交叉吸附相关信息会在对应产品说明括号中提供，表示为“ min X”，“X”为相关物种的缩写。偶联标记二抗通常与分子偶联，例如酶，荧光探针或有色颗粒。免疫测定的检测系统将确定标记物的种类。抗人二抗可以与多种标记物偶联，包括生物素，AP，HRP，荧光基团和胶体金纳米颗粒。

流式细胞术( Flow cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。与一般的技术相比，流式细胞仪分析时会涉及到各种参数，对于刚入门的我们，常常搞得焦头烂额。如下图（来自网络）仅仅流式分析数据图都是多种多样（一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等）。所以，今天就为大家科普一下，流式细胞仪中那些常见术语。01、流式细胞仪常见术语1. 设门（gate）：划定某一区域的细胞群体，对其单独加以分析或分选。举例来说，如下左图，以FSC为横坐标，SSC为纵坐标，圈出想进行分析的细胞主群（设门），双击圈内，看FL4(APC)为横坐标，FL2(PE)为纵坐标，进行分析。下中图为阴性对照，由此可以圈出阴性群的范围，在下右图中就可以划分出APC单阳、PE单阳、APC&PE双阳的细胞群。 2. FL1、 FL2、 FL3、FL4通道：在某些机型的流式细胞仪中存在，是指不同的荧光通道。举个例子，我们用FITC/PE双标记的细胞，在488nm的激光激发下，这两种荧光染料分别发出波长不同的绿色和橙色荧光，然后将发出的荧光再通过滤光片分开，对应的是不同的波长的滤光片，一般在FL1通道是530nm的滤光片，在FL2通道是575nm的滤光片，这样就可以把在一起的荧光分开了。3. FL2-W FL2-A FL2-H ：流式细胞仪检测信号时，每一个细胞通过激光，机器的探头都会检测到一个荧光信号，在内部产生一个电脉冲信号（波），这个信号机器记录为一个峰值，每一个峰值都有三个参数，高度（H），宽度（W）和曲线下面积（A），H 和W都是直接测出的，而A是根据机器的设置就算得出。4. APC、PE、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5等：这些名词均为常见的荧光素，在受激发后能产生荧光。5. 调补偿：若两种以上的荧光素的发射光谱之间存在重叠，则需要调补偿。这就意味着一种荧光素发出的光可能被另一种荧光素的检测器检测到。调补偿主要指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠的过程，去除干扰荧光信号。如下为补偿调节原则：①用于调节补偿的标本必须单染。②样本必须可以染出一群阳性和一群阴性，以比较它们之间的平均荧光强度。③可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿（例如在稀有细胞检测时）。④使用表达强度高的抗体来调节补偿。⑤用来调节补偿的抗体必须与实验用的抗体荧光素一样（例如不能用FITC调节GFP的补偿）。⑥串联染料的抗体如果批号不同，需要再次做补偿。⑦阴性和阳性细胞的自发荧光水平必须一致。⑧有些抗原表达弱，阳性群不明显，例如IFN-γ-PE，可以用补偿微球代替细胞。6. MFI值：即为平均荧光强度。每个细胞经过流式细胞仪检测都会有一个相对强度的荧光值。阴性细胞没有特异性荧光，也会发生很微弱的自发荧光，因此有很小的荧光强度；阳性细胞的特异性荧光强度是阴性细胞荧光强度的几百甚至几千倍。MFI就是把所有细胞的荧光强度相加再除以细胞数，就是所有细胞荧光强度的一个平均值。一般来说，百分比越高MFI就高，百分比低相应MFI就低，有时候两个样本百分比相处不多看不出差别时，MFI就能很好地反应这种微弱的差异。7. 染色：用带有不同荧光基团的抗体分别结合细胞上不同的抗原。荧光素偶联抗体的标记（染色）包括表面染色和胞内染色：①表面染色  ②胞内染色 8. 基线偏移：通过增加随机的高斯正偏移把一些低水平信号的对数数据从比较低的数字通道上移上来，方便数据间的分析。02、常见的技术指标1. 仪器的分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV (Coefficient of Variation)表示。DNA 流式分析中的分辨率（或精确性）非常重要，因为细胞群体之间DNA 含量的细微差别可能有显著的生物学意义。通常，分辨率由标准微球DNA 分布中的G0/G1 峰的变异系数CV来反映（CV%=（SD/Mean）×100）。仪器因素（如液流、光路调试和光学元件等）、样本制备和染色过程带来的人为因素都可能影响检测的精确性。评估真正的生物学意义上的DNA 含量差别因而具有更重要的价值。如何最大限度地减少样本制备和仪器因素带来的变异是DNA 分析条件最佳化的根本所在。DNA 直方图中峰的CV 越低，质量越好，从图中可能获得的信息越多。新鲜标本的CV 常比石蜡包埋的标本好。新鲜标本的CV 常≤3%，而石蜡包埋的标本CV 则取决于组织病理实验室的具体操作方法，通常到≤5%。当G1 峰的CV≥8%时，不再合适估计S 期比例。2. 荧光测量灵敏度：灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以能检测到单个微球上最少标有FITC 或PE 荧光分子数目来表示，一般现在FCM 均可达到3. 前向角散射光(FSC, Forward Scatter)检测灵敏度：前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM 可以测量到0.2-0.5μm 左右。4. FCM 分析速度：分析速度以每秒可分析的细胞数来表示，当细胞流过光束的速度超过FCM 仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间（Dead time）。死时间越短，我们就说这台仪器处理数据越快，一般可达到3000个/秒~6000个/秒左右，FACS Calibur 的分析速度为10000个/秒，大型机已达到每秒几万个细胞。5. FCM 分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度及分选得率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数，目前常用的台式分选仪器BD公司生产的FACS Calibur的分选速度为300个/秒，BD大型机的流式细胞仪最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度指被分选出细胞所占的百分比，一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%左右。分选得率是指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和得率是互相矛盾的，同一样品，纯度提高，得率降低，反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序地排着队，而是随机的，因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同条件下，仪器会作出取舍，因此，选择纯度还是得率要视具体实验要求而定。6. 背景（噪声、荧光、散射）Background (noise, fluorescence, scatter)：当样品流中没有颗粒时却仍存在的信号（背景噪声是限制荧光检测灵敏度的一个因素）。背景信号会有不同的主要来源：当激光器关闭，或流动室没有光激发时，检测器噪声是主要的背景信号来源。对于光电倍增管（PMT），检测器背景噪声被称为暗电流，主要来自光电阴极的电子的随机发射。对于光电二极管和其他固态检测器，主要来源于倍增器。荧光噪声源包括：水和光学元件的拉曼散射来自样品或鞘流中未结合的荧光染料、试剂或污染物的荧光光学组件的荧光。03、Tips①控制好孵育时间：荧光淬灭操作中的孵育时间一定要严格，孵育时间过长会导致荧光淬灭，如将试管放入冰中，可以延迟淬灭；②注意染色顺序：遇到多种荧光染色时，可能会因为染色顺序的不同而导致荧光强度不同。处理方法：提前进行预实验，尝试多种顺序，选择最佳染色顺序③合适的染色方案：选择不合理的染色方案也会导致荧光信号太弱。处理方法：提前进行预实验，设计好最佳染色方案④做好阴性对照及同型对照：试验细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。⑤选择合适的抗体：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

免疫学检验方法和免疫化学技术主要包括：抗原抗体的制备、纯化和鉴定，免疫扩散、免疫电泳、免疫凝集试验、补体结合试验，免疫细胞分离、纯化和鉴定，免疫功能检测，细胞因子检测，放射免疫检测，免疫酶标检测，荧光和发光免疫技术，免疫组化实验方法，原位杂交免疫组化，免疫PCR技术，免疫微球的应用，免疫电镜技术，细胞凋亡的检测方法，膜受体分析，胞内钙镁浓度的测定和细胞间通讯，流氏细胞仪技术及应用等。  从上述内容可以看出，免疫技术是免疫学和物理、化学及电子信息和分子生物学理论和技术的结合产物。其应用涉及生命科学的各个领域，已成为现代医学和生物学研究工作不可缺少的有效工具。  免疫技术的原理和特点：基于免疫应答的理论，即抗原抗体的特异性反应。基于免疫细胞的结构、应答特性和分子基础。 具有特异性 高度灵敏性； 可重复性；广泛适用性；快速反应性；可观察性；可定性、定量，即可控性；组化定位特性等特点。  概括起来可分为：  沉淀反应，即可溶性抗原和抗体间的反应。  凝集反应，即颗粒性抗原和抗体间的反应。  免疫标记，即用酶、同位素、荧光素或电子致密物质标记。  免疫印渍，即用标记抗体与待测蛋白质印迹结合。  单抗及工程抗体技术，即分子生物技术。  流氏细胞术，即荧光标记，流体喷射，激光和能谱检测， 电脑分析。

1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

氧化应激（Oxidative Stress，OS）是机体活性氧成分与抗氧化系统之间平衡失调引起的一系列适应性的反应。干扰细胞正常的氧化还原状态，会制造出过氧化物与自由基导致毒性作用，因此损害细胞的蛋白质、脂类和核酸。发生在人类的氧化压力，被认为是造成亚斯伯格症候群、自闭症、阿兹海默症、帕金森氏症、注意力缺陷过动症、动脉粥样硬化、心脏衰竭及癌症等的成因。然而活性氧也有它的益处，免疫系统可利用活性氧攻击并杀死病原。短期的氧化应激在防止老化上，也提供了重要的步骤，称做毒物兴奋效应。氧化应激可通过测量活性氧（ROS）来直接评估，或通过过度产生的ROS对脂质，蛋白质和核酸造成的相关损害来间接评估。尽管直接测量ROS是理想的方法，但是与ROS的瞬时特性相比，通常更依赖于间接方法因为生物分子上的损伤标记相对稳定。ROS：氧气作为正常代谢的一部分被电子还原，导致形成各种ROS，包括过氧化氢（H2O2）和超氧化物（O2?-）。当不受控制的氧化对生物系统造成压力时，会对细胞大分子造成损害。ROS的测定不能识别ROS产生的来源（即正常状态与疾病状态），但是如果实验模型处于压力下，则ROS可能增加并且分子成分改变。ROS：氧气作为正常代谢的一部分被电子还原，导致形成各种ROS，包括过氧化氢（H2O2）和超氧化物（O2?-）。当不受控制的氧化对生物系统造成压力时，会对细胞大分子造成损害。ROS的测定不能识别ROS产生的来源（即正常状态与疾病状态），但是如果实验模型处于压力下，则ROS可能增加并且分子成分改变。RNS：在氧化应激过程中也会产生活性氮（RNS）。由一氧化氮合酶（NOS）和O2?-合成的高含量一氧化氮（NO?）导致过氧亚硝酸盐的形成。NO?本身也与硫醇和铁硫酶反应，而过氧亚硝酸盐与酪氨酸残基反应形成硝基酪氨酸。DNA/RNA损伤：鸟嘌呤是DNA和RNA损伤时最容易氧化的碱基。为纠正这种损伤而启动的修复过程将下列氧化的鸟嘌呤类释放到尿液中：8-羟基鸟嘌呤——无核糖的碱8-羟基鸟苷——RNA的核苷8-羟基-2-脱氧鸟苷——DNA的脱氧核苷可以检测多种氧化鸟嘌呤种类的测定法比只限于分析一种（例如8-羟基-2-脱氧鸟苷）的测定法能捕获更多的氧化损伤生物学相关产物。蛋白质氧化和硝化：蛋白质氧化的最常见标志是蛋白质羰基含量。氧化还原循环阳离子与蛋白质结合，并与ROS的攻击结合，导致形成含有羰基（酮，醛）的氨基酸衍生物。香烟烟雾和醛类也会将羰基引入蛋白质中。另外，ROS暴露于蛋白质的蛋氨酸残基会产生蛋氨酸亚砜（MetO），这是一种氧化修饰，如果未被MetO还原酶逆转，则会进一步氧化为蛋氨酸砜，并可能导致蛋白质功能障碍。蛋白质上硝基酪氨酸的存在用作NO?与 O2??反应时体内形成的过氧亚硝酸盐的标志物。当过氧亚硝酸盐经历杂化裂解时，释放出的硝化氮离子硝酸盐蛋白酪氨酸残基。NO?可以通过RNS介导的S-亚硝基化过程直接修饰蛋白质，其中NO?基团与蛋白质半胱氨酸残基的硫醇基结合，从而形成S-NO部分。脂质过氧化：脂质过氧化导致不饱和脂质的高反应性和不稳定的氢过氧化物的形成。 它们可以通过不稳定的氢过氧化物的各种分解产物（例如烷烃，酮，醛）直接或间接评估。通过组织脂质的随机氧化产生的8-异前列腺烷目前被认为是体内脂质过氧化最可靠的生物标记之一。它是脂质过氧化作用的特定产物，其稳定且在所有正常生物体液和组织中的含量均可检测到。磷脂中酯化水平的测量可用于确定目标靶位点脂质过氧化的程度。

PCR实验时，我们有时候会遇到目的基因得率低，或者根本扩不出来的情况，不管是PCR的实验王zhe，还是初级实验小白，都需要逐个排查问题，那么我们需要考虑哪些因素呢？今天这一篇干货，帮您彻底解决问题。首先考虑的问题，是不是DNA模板的问题呢？    如果模板质量太差？那么检查DNA模板的纯度和完整度，保证你的模板中不含有PCR抑制剂。在分离DNA时，尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要，可通过凝胶电泳检测模板DNA完整性。将DNA保存于分子级别的水或TE缓冲液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。    如果是模板浓度太低？建议使用DNA纯化试剂盒分离模板DNA时，应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南，改善较低的DNA质量。如果采用化学或酶促DNA纯化方案，应确保无PCR抑制剂残留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA，去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子（如， K+, Na+等）。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。    如果是DNA模板量不足？建议检查 DNA起始量 ，如有需要适当增加起始量。 选择具有高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。适当增加PCR循环数。    如果需要扩增的目的片段比较复杂（如，高GC含量或含二级结构）？、建议选择具有相应的扩增试剂盒，比如适合高GC含量片段的PCR试剂盒。或者选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，geng适合扩增困难靶标。 使用 PCR添加剂或辅助溶剂 ，促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。增加 变性时间或温度 ，从而高效解离双链DNA模板。    如果目的片段太长？建议直接使用长片段设计的PCR试剂盒，或者确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为 长片段PCR设计的DNA聚合酶。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性。根据扩增子长度，增加延伸时间。或者是引物的问题？    考虑引物浓度是不是不是最you的？建议预实验优化引物浓度（范围通常为0.1–1 μM）。对于长片段PCR和使用简并引物的PCR，最小起始浓度为 0.5μM。    引物设计有问题？可以使用多种引物设计软件比如Primer Premier等，或者使用在线 引物设计工具 。确保引物针对目的片段具有特异性。 确认引物与正确的目标DNA链互补。也许是其他试剂的问题？    MgCl2 浓度太低？镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。在PCR中，标准的 Mg2+ 终浓度范围为1–4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。 Mg2+ 浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面， Mg2+ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。还有可能是PCR循环设置不理想呢？    变性效果不理想？建议优化DN变性时间和温度。变性时间短、温度低可能无法获得良好的双链DNA模板解离效果。相反，变性时间长、温度高可能会降低酶活性。    退火效果不理想？尽量使用 梯度热循环仪 ，以1–2°C增量逐步优化退火温度。最jia退火温度通常比最低引物Tm低 3–5°C。当使用 PCR 添加剂或辅助溶剂 时，应调整退火温度。使用指定DNA聚合酶在其最jia缓冲液中的 推荐退火温度 。DNA聚合酶不同，则引物对的退火温度也不同。    延伸效果不理想？选择适合于扩增子长度的延伸时间。在扩增长片段（如，>10 kb）时，降低延伸温度（如，降至68°C）可保持酶活性。使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶，在较短的延伸时间内也能实现 稳定的扩增 。    PCR循环数不合适？调整循环数（通常为23-35个循环），以获得合适的PCR产物得率。如果DNA起始量低于10拷贝，则将循环数增加至40。

实时聚合酶链反应(pcr)是基于pcr的革命性方法，这一技术是pcr高灵敏度和实时检测相结合的结果。实时定量聚合酶链反应(rt-qpcr)的独特特征就是把目的基因的扩增与荧光信号联系起来，并将其量化。 在定量基因表达分析,目前有两种方法最受欢迎, sybr green and taqman，那么这两种哪个更好呢？本文分别分析其优缺点。一、荧光染料法(sybr green)其原理是：在pcr反应体系中加入过量荧光染料，dna扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入dna双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。如果你要扩增你的目标样品40个循环，在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。优点：    成本较低，适合大规模的实验。    在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计。缺点：    特异性不是很高。染料可以插入任何双链dna，包括引物二聚物和非特异性产物。    如果引物二聚体存在或者产物受到污染，得到的结果会不可靠。    更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。    需要更多的时间进行结果分析。二、寡核苷酸探针(taqman)这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短dna分子)，探针通常在5 '端和3 '端都被标记。在探针的5’端有报告基团，3’端设计淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。rt-qpcr反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与pcr产物同步。使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游互补序列的结合。优点：    更有可能只放大所需的产物，由于引物和探针的结合具有特异性。    不需要解离曲线，只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。    由于具有特异性，数据更可靠。    数据分析时节省时间。缺点：    需要大规模实验时耗费成本高。    需要更长的时间来设计实验，因为需要好的引物和探针。总的来说，这两种荧光检测方法都很有效，但对于你的具体实验，可以选择适合的方法。

胎牛血清是实验室里细胞培养中用量最大的天然培养基，因为胎牛从未接触过外界，而使得其血清中所含的抗体和补体几乎没有对细胞有害的成分。并且高质量的胎牛血清含有的丰富营养成分可以满足细胞生长需求，在应用于动物细胞的体外培养中发挥出重要作用。那么为什么人们一定要用胎牛血清而不用新生牛血清呢？想知道两者之间都有哪些区别不妨看看以下小编归纳的几点内容：胎牛血清与新生牛血清的三大区别1、来源不同        胎牛顾名思义就是指还在母牛身体里的小牛，所以胎牛血清的采集工作，便是先从怀孕中的母牛身体里取出胎牛。之后人们在未发育完全的胎牛的心脏进行穿刺取血，完成采血的工作以后便再通过一系列的工艺处理获得胎牛血清。而新生牛血清主要是采集自已经出生一段时间的小牛，而且它们的发育相对于胎牛而言更加完全。2、组份与比例不同        虽然胎牛血清与新生牛血清的成分并不存在很大的差别，可是诸如促细胞生长因子和促贴附因子等组份并不相同，而且两者之间的激素还有其他活性物质的比例也不同。另外，胎牛血清的免疫球蛋白含量要远远低于新生牛血清，胎牛的血清相对来说比较纯，所以培养细胞的效果会更佳。3、用途与用法不同        由于胎牛血清与新生牛血清存在细微差异，因此它们的用途与用法也不尽相同。比如某些细胞只有使用胎牛血清才能顺利生长，但是有一部分的细胞并不是非胎牛的血清不可，新生牛血清可以完全满足这种细胞的生长需求。另外，由于新生牛血清价格更经济实惠，并且细胞培养效果接近胎牛的血清，因此被疫苗生产等大规模的生产型企业大量采购使用，而胎牛血清则更较常应用于对培养条件要求比较高的细胞研究领域中。        综上所述，胎牛血清主要与新生牛血清存在来源、组份与比例、用途与用法三个方面的区别。而且从上文也不难看出胎牛血清和新生牛血清都各有优势，虽然有区别可是在不同的领域里表现都非常亮眼。另外，在培养细胞方面表现突出的胎牛血清的美容作用也不容小觑。

人“最”怕的是什么？死亡？疾病？都不是。是衰老！这是欧洲一家趣味生活调查机构得出的结果。因为，来自死亡的恐惧是短暂的，甚至偶发于瞬间。所以，很少有人每天都为此战战兢兢。疾病，人们怕，却不会特别担心。因为比比皆是的医院、数不胜数的名医成为人们心里妥妥的依靠。唯有衰老，神仙难助、金钱无力。一旦越过时光的悬崖，就会出现“衰老加速度”，一发而不可收拾。无论再如何“抢救”、如何“装修”都于事无补。于是，每天对镜贴花黄，每天伤感愁断肠……随着现代医学的发展，人们发现最ke学有效的方法就是从源头、从肌体内部延缓生命衰老的进程，阻止“衰老加速度”效应。这只延寿驻颜的“上帝之手”就是蜚声中外的干细胞抗衰科技。干细胞技术能延缓人类衰老速度在现代抗衰老研究进程中，干细胞技术始终占据重要地位，受到全球科学家的密切关注，承载着全人类抗衰老的美好梦想。中国科学院周琪院士曾在采访中表示：“干细胞的价值在于它的科学本质，干细胞它可以自己不断地复制自己，它会不断地增殖，它也可以向各种组织器官分化。所以它这种特性决定它有这种潜质，（可以）替代、修复那些缺损的器官，甚至是延缓我们的衰老，增强我们的健康。”干细胞抗衰老原理干细胞是一类能够自我复制，并通过增殖分化形成各种不同的功能细胞和间质细胞，它们能够维持机体的正常结构和功能。但随着年龄的增加，人体内的干细胞数量也会减少，因此造成衰老，从而疾病发生率升高。所以，补充干细胞，就能够延缓衰老，这是由干细胞抗衰老的原理决定的，主要有以下几点：01.组织修复作用在衰老过程中，很多组织器官都会受到损伤，从而导致组织结构的不完整和功能的退化或丧失。间充质干细胞不仅仅可以分化为同胚层来源的各种细胞，组成肌肉组织、结缔组织，还可以跨胚层分化为其它细胞，组成神经组织、上皮组织等。因此，体外静脉回输间充质干细胞，或者局部定点注射间充质干细胞，可以通过“归巢效应”，让间充质干细胞在受损部位，帮助体内的干细胞一起，大大增加组织再生的能力。02.代谢调控作用长寿和抗衰老的一个关键因素是消化好，代谢能力强。除了日常生活中通过控制饮食减轻代谢负担，也可以通过干细胞的帮助增强代谢功能。间充质干细胞就具有这样的功能，它能够分泌大量的细胞因子，调节胰岛细胞，促进糖脂代谢等。03.免疫调节作用衰老过程中的损伤和修复，是一个动态过程，损伤都会有炎症的发生，干细胞在炎症修复中发挥了重要的作用。间充质干细胞具有的低免疫原性和免疫调节的特性，通过再生和分泌细胞因子，来对抗炎症，修复炎症。大量临床实验证实，补充年轻供者的间充质干细胞对老年性衰弱症及慢性病患者有显著治疗作用，有效提升了患者的生活质量。干细胞会给你的身体带来哪些变化？01.脑部功能年轻化修复损伤，提高机体适应性。人到中年后，随着脑神经细胞逐渐减少（25岁以后年减少约0.8%，到了70岁时脑神经只剩下55%），综合功能将明显减退。中老年人一般会出现记忆力、智力、认知力衰退，乃至出现痴呆等症状。自体活性神经干细胞回输后，可分化形成新的神经细胞，为大脑提供全新细胞源，有效改善脑衰老状况。尤其对老年性痴呆患者的记忆力、智力有明显改善和恢复。02.心脏功能年轻化修复损伤，改善脏器内部环境，提高生命活力。心脏自身干细胞具有心脏组织分化能力。通过使用SDF-1蛋白可诱导、促进干细胞向心脏靶向归巢，将干细胞整合至损伤心肌，促进心脏前体细胞的分化，进而促进血管新生和改善心脏功能，提高心脏自我修复潜力。使用Urantide阻断UrotensinⅡ受体能够通过增加心脏侧群细胞提高心脏修复能力，使活力心脏面积增加，局部心肌收缩功能改善。03.肝脏功能年轻化修复损伤，改善功能，提高机体适应性。肝脏干细胞具有肝脏组织分化能力。随着干细胞向肝脏靶向归巢，活性肝脏干细胞将发挥合成、解毒和促进胆红素排泄（或胆红素、转氨酶下降）等作用，使白蛋白、血清PIIIP、血清肝细胞生长因子水平明显提高，延缓或阻止肝纤维化的发生。通过肝细胞的再生和体液分子机制作用恢复肝脏的正常功能，保持肝脏年轻化。04.肺部功能年轻化修复损伤，改善肺部功能。肺干细胞具有肝脏组织分化能力。通过干细胞向肺部靶向归巢，一方面活性肺干细胞将替代、修复受损细胞；另一方面干细胞生成新的肺细胞，为肺纤维化后肺组织损伤修复和肺功能恢复奠定基础。肺部组织（肺泡、肺部血管等）再生的过速度超过外界刺激物和内部病变因素所引起的破坏性炎症的发展速度，再生组织系统对各种炎症的产生形成抑制作用，防止、遏制、消除肺纤维化，进而使肺部组织保持良好的稳定状态，肺功能得以维持健康态、年轻化。05.肾脏功能年轻化修复损伤，改善肾功能，强化命源能力。肾脏干细胞靶向归巢后到达肾脏病灶，通过改善肾脏局部微循环，恢复正常细胞代谢，为肾脏创建新的有氧环境，缓解肾脏缺血、缺氧引发的衰竭症状，从而实现对受损固有细胞的修复和脏器组织重建。同时，肾脏干细胞通过组织分化、再生功能形成新的胰岛细胞来修复胰腺，使患者的血糖逐渐得到调整，并不断向正常指标回归，增强对肾脏的保护。06.骨关节功能年轻化修复损伤，改善功能。骨关节一旦损伤很难修复，将导致不可逆性的关节退变和骨关节疾病形成。 骨髓间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。骨髓间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、 肝、心肌、内皮、脂肪等多种组织细胞。作为种子细胞可用于因衰老或病变引起的组织器官损伤修复干细胞移植技术可以直接补充减少的干细胞并发挥其活性，促进局部病变骨组织的修复。骨髓干细胞可以向软骨分化并具有分泌软骨特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖基质的功能。间充质干细胞植入软骨损伤区可以分化成软骨细胞，并产生软骨基质或新骨组织，具有促进骨缺损修复的能力。07.免疫功能抗衰老提高肌体免疫力，增强抵抗疾病能力。免疫功能衰退是整体衰老的重要标志。免疫是人体抵抗疾病，尤其是清除进入人体的病原微生物(细菌、病菌、寄生虫等)和监控、杀灭肿瘤细胞的关键因素。衰老导致免疫细胞减少、活性降低，导致抗病能力下降，因而容易发生肿瘤和其它疾病。外源性干细胞植入后可以重新建立造血免疫系统，恢复正常免疫功能。08.卵巢功能年轻化修复损伤，改善功能，提高机体适应性。卵巢是女性生殖和重要的内分泌器官，是保证女xing生活质量的重要保障。卵巢早衰是指女性40岁前由于卵巢内卵泡耗竭或因医源性损伤而发生的卵巢功能衰竭。表现为经量减少、无排卵、黄体功能不足、阴道干涩、xing欲下降等绝经症状。

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，目前主要应用于医疗、美容行业。干细胞实验室是从事干细胞基础研究、制剂制备、技术开发、医疗服务的重要场所。培养环境wu毒和无菌室保证培养细胞生存是建设干细胞实验室的首要条件。一、干细胞实验室的建设总体原则干细胞实验室的选址、设计及布局应遵循《药品生产质量管理规范》、《实验室生物安全通用要求》(GB19489)、《医院洁净手术部建筑技术规范的规定》(GB50333)，质量检测区应符合GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求。zui终达到布局合理、独li使用、人物分流的要求，应具备细胞分离、培养扩增、冻存复苏、质量检测控制、制剂运输、设备及环境远程控制、信息管理系统等功能。洁净区房间的房门应具有自动关闭功能，通道门还应具有联动互锁功能。洁净区建筑材料应隔热、防震、防虫、防火，不产尘、不吸尘、不积尘等。仪器设备应具有标准数据通信接口等输出有关数据，支持中央数据处理系统进行控制和综合分析处理等。二、干细胞实验室的功能设计干细胞的工作流程，主要分为干细胞的制备、质检及存储。其中干细胞的质检管理又包括无菌检测、致病因子检测、培养基残余量检查等。根据干细胞实验室的建设原则和工作流程，干细胞实验室的设计主要包括geng衣区、样本接收区、细胞制备区、细胞培养区、质量检测区(PCR检测区、微生物检测区、功能检测区)、细胞库、档案室、信息中心等区域。区域设计的平面图，见图2。据SZDB/Z188-2016细胞制备中心建设与管理规范，geng衣区分为一geng和二geng。geng衣区的面积不低于30㎡，该区域应配备自动洗手设备、洁净风烘干设备、感应式消毒液给液设备。样本接收区面积应不低于20㎡，应具有4℃医用冰箱、电子天平、恒温培养箱等。细胞制备区用于干细胞的分离，面积应不低于200㎡，包括试剂储备间、细胞分离室等房间。细胞制备区应具备生物安全柜、CO2培养箱、冷冻离心机、倒置显微镜、细胞计数仪、4℃医用冰箱等。细胞培养区用于干细胞的培养和扩增，面积应不低于100㎡，每个培养区均配置生物安全柜、倒置显微镜、CO2培养箱、4℃医用冰箱等。其中样本接收区、细胞制备区和细胞培养区均配备万级层流净化环境。质量检测区主要用于干细胞确认检验及放行检验，面积应不低于300㎡，质量检测区分为PCR室、微生物室及功能检测室三部分。PCR室分为试剂制备区、标本制备区、样本扩增分析区三个部分。PCR三个区域的空调系统完全独li，其中试剂制备区和标本制备区为相对正压状态，样本扩增分析区为相对负压状态，每个区域和缓冲区之间均保持10Pa的压差。标本制备区配备有B2型生物安全柜，需要考虑到安全柜运行时，要补充相应数量的新风。另外产物分析区配有排风橱，也需要补充一定数量的新风。PCR室应配备4℃医用冰箱、生物安全柜、离心机、荧光定量PCR仪等仪器。微生物室为检测干细胞的病原微生物，主要配备生物安全柜、全自动微生物培养检测仪等仪器。功能检测室需要配备流式细胞仪、酶标仪、细胞计数仪、医用冰箱、纯水仪、凝胶成像系统、电泳仪、离心机等。细胞库面积应不低于60㎡，主要为干细胞的储存场所。具有液氮罐、程序降温仪、超低温冰箱、液氮塔等，配备实时环境、安全监控，如氧浓度检测系统、温湿度检测系统等。

PCR实验室又称基因扩增实验室。是一种分子生物学技术，可用于放大特定的DNA片段，可看成生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能够迅速掌握患者体内的病毒含量，其精准度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、为提供了可靠的检验依据。大量用于疾病的诊断和任何有DNA,RNA的地方，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。PCR实验室通常按物理学，无机化学，有机合成化学，生物学来分类。主要组成有化学基本实验室、仪器分析实验室、洁净实验室、电子计算机室、研究室、辅助实验室、服务供应室等。能够对患者的病情进行准确的掌握，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻止肝病病毒的复制疗法、可以有效的分解肝炎病毒，解决乙肝病毒易变异、耐药、病毒复制难以治疗，人体免疫耐受不易打破的医学难题，能快速消除临床症状，并且有效的控制乙肝病毒复制，加快e抗原、抗体的血清转换速度，灭杀肝细胞及血液内的病毒，为防止再次感染提供了保护，有效的阻断和逆转肝纤维化、肝硬化过程。规范的PCR实验室设计应注意什么?1、可共用的建筑物，应自成一区，宜设在一侧，与建筑物其他部分可以相通。将实验室分为三区，半污染区、污染区和洁净区;2、实验区应设置有非手动洗手池;3、实验室的墙、天花板和地面应平整、易清洁、耐化学品和消毒剂的腐蚀，地面要防滑，不得铺地毯;4、实验室的门应带锁，可自动关闭，门要带有可视窗;5、实验室工作区外应有存放个人衣物的条件;6、实验室内配置生物安全柜;7、实验室应设洗眼设备，必要时有紧急喷淋装置;8、有可靠的应急照明;9、实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识。

１．电连线：仪器连线必须使用带有接地的三根线的护套线，不可使用普通的塑料绞线。严禁私拉乱扯。接地：仪器应有良好的接地，提高仪器的稳定性及安全系数。维修：维修仪器时必须切断电源，方可拆机修理。墙电：需要对墙电进行维修、改造时，必须由持有市供电局和劳动局核发的电工证的人员进行操作。检查：如遇线路老化或损坏应及时地更换。触电：断电或绝缘脱离。2.水上水：水龙头或水管漏水时，应及时地修理。下水：下水道排水不畅时，应及时地疏通。冷却水：输水管必须使用橡胶管，不得使用乳胶管；上水管与水龙头的连接处及上水管、下水管与仪器或冷凝管的连接处必须用管箍夹紧；下水管必须插入水池的下水管中。纯净水：应按照“操作规程”进行操作；取水时应注意及时地关闭取水开关，防止溢流。3.气体搬运：搬运或转动钢瓶时，不得用手执着开关阀移动。使用：按气瓶的类别选用减压器，安装时螺扣应拧紧，并检漏。开启钢瓶：逆时针方向为开；先开总阀，后开减压阀。关闭钢瓶：顺时针方向为关；先关总阀，后关减压阀。气嘴保护：用死扳手夹紧气嘴后再开总阀。安全：气瓶内的气体不可用尽。惰性气体：应剩余0.05MPa以上压力的气体。可燃气体：应剩余0.2Mpa以上压力的气体。氢 气：应剩余2.0MPa以上压力的气体。存放：分类分处保管，直立放置时要稳妥；气瓶要远离热源；避免曝晒和强烈振动；一般实验室内存放气瓶量不得超过两瓶。氢气瓶和氧气瓶不能同存一处。 （1）氧气性质及使用安全性质：强烈助燃烧。高温下，纯氧十分活泼；温度不变而压力增加时，可以和油类发生急剧的化学反应，并引起发热自燃，进而产生强烈爆炸。使用：不可将氧气瓶与油类物质混放，并绝对避免让其它  可燃性气体混入氧气瓶。存放：氧气瓶禁止放于阳光曝晒的地方。 （2）氢气性质及使用安全性质：氢气密度小，易泄漏，扩散速度很快，易和其它气体混合。氢气与空气混合气的爆炸极限：氢气含量爆炸下限4.1％，爆炸上限74.1％(体积比)，此时极易引起自燃自爆，燃烧速度约为2.7m/s。使用：提倡使用氢气发生器。在使用氢气 的地方，严禁烟火；严防泄漏；用后及时地关闭总阀。存放：氢气应单独存放，最好放置在室外专用的小屋内，确保安全。 4.火加热，进行蒸馏实验和消化样品时应使用加热套和封闭式电炉，不应使用明火加热。安全使用酒精灯。明火，实验室内严禁吸烟。在使用易燃气体和易燃试剂的实验室内不得使用明火。火情处理报警：119（说明火源、火情、单位名称、地理位置，或明显标志）。措施：早发现、早处理、早报告。灭火：学会使用灭火器（一拔、二握、三瞄、四扫），易燃固体、易燃气体、易燃液体和带电物体着火时，可用干粉灭火器灭火；导线或电器着火时，应先断电，再用干粉灭火器灭火；切不可用泡沫灭火器，此灭火器导电；衣服着火时，应尽快地脱掉衣服，并用水灭火。或就地滚动，切忌外跑。防火：火灾不能预期、不能杜绝、只能预防。备逃生四件宝（灭火器、绳、手电筒、防毒面具）。 5.化学药品使用任何的容器都必须贴上标签，注明其内容物及有效时间。使用低沸点有机溶剂时，一定要远离火源和热源。试剂瓶应封严，并放在阴凉处保存。浓酸、浓碱具有强烈的腐蚀性。如果溅到皮肤上或眼内， 应立即用流水冲洗至少15min，然后用5%NaHCO3或5%H3BO3冲洗。浓硫酸粘到皮肤时不能直接用水洗,因为会有大量的热量产生,会烧伤皮肤,应该先用硼酸,再用NaHCO3溶液处理，严重的应处理后尽快就医。在使用任何化学药品前，一定要熟知该化学药品之危险性。使用有毒有机溶剂或者腐蚀性试剂时应在通风橱内操作，并使用防溅面罩，防止意外事故发生。 6.药品溢泼处理 （1）溶剂避免点火及可引起火花之任何动作。去最近的地方，拿喷洒吸收溶剂之干粉，将喷洒吸收剂由外而内洒在溅有溶剂处。用铲子将吸收剂清理掉。 （2）酸和碱去最近的地方，取中和酸(碱)剂，由外向内喷洒，用试纸测试是否还在该处。将中和剂清理掉。用肥皂及水清理溅洒处。 7.试剂有机试剂：使用三氯甲烷、四氯甲碳、乙醚、苯、丙酮、己烷等低沸点有机溶剂时，一定要远离火源和热源。装有上述试剂的试剂瓶应封严，并放在阴凉处保存。使用有毒有机溶剂时应在通风橱内操作，防止意外事故发生。无机试剂：浓酸、浓碱具有强烈的腐蚀性。使用浓硝酸、浓盐酸、浓硫酸、高氯酸及氨水时，应在通风橱中操作。如上述试剂溅到皮肤上或眼内，应立即用水冲洗，然后用5%NaHCO3或5%H3BO3冲洗。标识：自配试剂应贴标签，并注明化合物名称、浓度、配制日期，以及配制人姓名。 8.试废液处置废弃的溶液应按有机及无机进行分类，严禁将不同类别的液体混放在同一个瓶中。装有废液的容器必须具有明显的标识，标识上应注明该废液的名称、组成、浓度、日期及该溶液废弃人的姓名。将装有废液的容器放在指定地点，统一处理。严禁将有毒、有害、强腐蚀性试剂及液体倒水池中。废弃的洗液不得倒入下水道，应装入试剂瓶统一处理。 9.仪器使用仪器使用者必须认真地阅读操作规程，经过培训方可上机操作。必须严格地按照“仪器操作规程”进行操作。在使用仪器之前应进行预登记。完成样品测定后，应在该仪器的“使用维修登记本”上进行机时登记。在样品的测定过程中，应保持仪器、实验台面及实验室的整洁。遇到仪器发生故障，立即向管理人员报告，不得擅自处理。未按“仪器操作规程”进行操作而造成仪器故障或损坏，应由该操作人员及所在班组长负责。按操作规程使用水、电。发现安全隐患应立即报告，及时处理。>离开实验室时应检查仪器、水、电、门、窗是否关好。不得擅自挪用与公用仪器相关的辅助设备和零、配件，以及实验室内的一切公用设施。

inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多，而Inverse-PCR一般只要有特异条带，基本上就是目的片段。基本步骤如下：1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界（左边界、右边界均可）和酶切位点附近设计引物P1、P2；b. 回收DNA，T4连接酶连接，使酶切后的DNA片段环化；c. 回收连接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。2、限制性内切酶消化：选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：Buffer for EcoR I2μlGenomic DNA3μlEcoR I0.5μl （10u/μl）ddH2O14.5 μl20μl37度 过夜，电泳检测酶切效果。3、回收DNA① 将酶切产物转到1.5ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250μl；② 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1min；③ 最大速度（13, 000 rpm）离心1min；④ 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1min；⑤ 最大速度（13, 000 rpm）离心2min；

组织细胞培养技术研究的对象不一般，它是具有完整生命力的生物单位，因此与其他一般实验工作不同，要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。本文将主要针对细胞培养实验室，讲解建设使用注意事项。       一、基础建设方案之墙顶地       （1）墙体       废物暂存间、强电间、水处理间可采用乳胶漆墙面，其他实验室区域采用玻镁板墙体。玻镁板是氧化镁、氯化镁、和水三元体系，具有防火防水、无味无毒、高强质轻、施工方便、使用寿命长等特点。       （2）天花       防火等级达到A级：天花选用彩钢板。实用美观，且易清洁消毒、光滑防水。       防火等级达到B1级：天花选用铝扣板。可大幅度降低通风和机电施工及维修的难度和强度，也利于日后的正常维护和检修。       （3）地面       地面材料的选择通常要求抗静电、抗菌耐磨、耐腐蚀、防火、防尘、降噪音等，色泽选择和墙体统一或相似的2.2mm厚进口品牌PVC卷材，防火等级为B级以上。        二、细胞实验室的设计分区       细胞培养实验室应能进行六方面的工作：       无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。       无菌操作区——       理想的无菌操作室应划为三部分：       ●更衣室：供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。       ●缓冲间：位于更衣间与操作间之间。       目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。        （37℃恒温细胞培养箱）       ●无菌操作间：专用于无菌操作、细胞培养。       大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m），以保证紫外线的有效灭菌效果；       墙壁光滑无死角以便清洁和消毒；       工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。       孵育区——本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用高，一般实验室多采用孵箱进行工作。       储藏区——主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，环境需要清洁无尘。       制备区——主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。       清洗和消毒灭菌区——清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。        三、保卫细胞，横扫污染源的7大战场       2008年8月，《The Scientist》期刊发表了一篇题为 A case of mistaken identity 的文章，文中指出现已发表的 650 多项研究中所用的乳腺癌细胞可能并不是真正的乳腺癌细胞。        对于细胞培养实验室来说，杜绝一切可能的污染源至关重要。        ①细胞房入口：和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。进入后经过洗手-消毒—戴手套-再消毒。 ②水浴锅：对其进行定期消毒，也可以向水浴中加入适量的杀菌剂来抑制各种细菌、真菌的滋长。最好用恒温孵育器代替水浴锅，确保温控精确性和均一性的同时也减少了污染的概率。       ③显微镜：敞口放置培养皿或培养瓶。防止造成溶液飞溅，或观察时污染物镜，并进一步造成交叉污染。       ④CO2 培养箱：对于日常使用来说，至少每月清洁培养箱一次。尽量减少门打开次数，避免对温度、培养基中 pH 值调节的影响。       另外要特别注意，CO2培养箱不能直接放在地板上。       ⑤生物安全柜：在开始实验前，必须对超净台进行全面消毒，正确的做法是对整个机柜表面进行擦拭。还有一件事必不可少，那就是事先打开安全柜通风系统，流通空气，直到原有的内部浊气都被排出。       ⑥离心机：和显微镜一样，离心机也是交叉污染的重灾区。平日里应保持离心机盖关闭，拒污染于千里之外。离心机内部的小缝隙是藏污纳垢之处，定期清洁转子和腔室至关重要。       ⑦窗户 ：细胞房通常没有窗户，如果有窗，那么无论什么时段，窗户都不允许打开。同时拉上窗帘，做好请勿开启的警示标记。        四、珍爱生命，看好那个“液氮罐” (-197°液氮柜）       1992年，一艘日本放在冻存船的液氮罐外胆破裂，导致原有的罐内9.3bar的正常压力，瞬间变成了68.7bar。接着整条船炸了，方圆400米内的车和房子全部损毁，船被炸出了350米。       另外，液氮罐的作死方式不光是爆炸，还能很温和。       那是爆炸的8年后，在爱丁堡的MRC西城医院冻存细胞的实验人员詹姆斯，由于液氮盖子没关导致的泄露，最终窒息死亡。        这并不是个例，类似的事故时有发生。因此工作人员在进行实验室相关操作的时候，一定要实时控制好液氮柜。这既是对自己生命的负责，也是对他人生命的尊重。        五、找专业人，做专业事       建设一座功能完善的实验室，要由专业的人员进行专业设计，要全面综合考虑，遵循以人为本的原则，建成正规化、标准化的实验室达到最佳的使用效果。

    细胞怎样才能茁壮成长呢？除了基础培养基，还有一样‘营养品’非常重要，那就是——血清。     血清，决定细胞宝宝健康成长的关键因素     血清含有丰富的生长因子可促进细胞的繁殖，含有附着因子可促进细胞的贴壁，同时也是矿物质、脂类及激素的来源。因此，细胞培养中普遍需要添加血清，而血清也成为对细胞的生长繁殖发挥重要作用的关键因素，血清的质量直接影响着细胞的生长状态。    影响血清的质量的关键因素是？     血清的质量主要取决于两个因素：原产地和生产加工过程     原产地     血清是一种生物制品,可能因来源动物的健康状况而存在差异。而来源动物的健康状况又受到饮食、环境和全球疾病因素的影响。源自澳大利亚的血清是公认的的zui安全血清，已经是广泛使用于全球许多科研机构和生物制药等工业生产中值得信赖的来源，并被证明可以很好地满足科研和工业生产方面的需求。   澳源血清为何会有如此高的口碑？     根据牛海绵状脑病（BSE）的地理风险科学指导委员会的指定，澳大利亚是获得BSE风险zui低评价的国家之一。     澳大利亚是拥有旨在全国范围内追踪动物来源和运输轨迹的体系zui好的国家之一，即保障血清产品的可追溯性。     所有牧场必须遵守国家制度并接受政府的监管。     生产加工过程     只有从采集、加工、过滤、包装、质检，再到物流等生产各个环节严格遵循行业zui高标准，才能确保产品的高品质。通常要求胎牛血清必须经过3次0.1微米孔径的过滤，而其他血清均经过0.2微米孔径的过滤。每批血清均经过严格的质量控制措施和理、化、微生物指标的分析检测。     zui常用的血清有胎牛血清和小牛血清。远慕生物推出的进口小牛血清满足您的全方位需求。   远慕小牛血清的特点：     澳大利亚来源，具有可追溯性     采集自小于12个月龄的小牛     0.2μm过滤除菌     可提供γ射线辐照处理的血清现货，灭活病毒和其他外来微生物     严格QC标准进行微生物、内毒素、血红蛋白、IgG含量等多项检测     经过细胞培养和杂交瘤细胞培养验证   购买以下血清均有优惠 更多优惠产品详情电询我司销售人员!!!     胎牛血清（无菌采制）     特级新生牛血清（无菌采制）     优级新生牛血清（无菌采制）     标准新生牛血清（无菌采制）     胎牛血清（辐照灭菌）     特级新生牛血清（辐照灭菌）     优级新生牛血清（辐照灭菌）     标准新生牛血清（辐照灭菌）     小牛血清（辐照灭菌）     大牛血清（辐照灭菌）     胎牛血清（无菌过滤）     特级新生牛血清（无菌过滤）     优级新生牛血清（无菌过滤）     标准新生牛血清（无菌过滤）     标准新生牦牛血清（无菌过滤）     脱纤维新生牛血（无菌 pet瓶装）     脱纤维新生牛血（无菌 袋装） 

一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至zui慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 3.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入dian乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

维生素B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。测定原理VB6与4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在390nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。保存条件及有效期1．试剂盒保存：2-8℃。2．有效期：6个月维生素B6测试盒注意事项：为了使测定结果有较高的灵敏度和准确度，如何选择适宜的测量条件？一般从以下几个方面来考虑：①选择适当的测量波长。一般根据待测组分的吸收光谱选择zui大吸收波长作为测量波长。如果干扰组分在zui大吸收波长也有吸收,则应根据：吸收大，干扰小”的原则来选择测量波长②调价溶液的浓度，或选用不同厚度的吸收池，控制被测是呀的吸光度在0.2-0.8范围内。③选择适当的参比溶液。在分析复杂样品时，如何消除干扰？消除干扰方法主要有：1、加入眼笔记，如加入配位掩蔽剂，使其与干扰离子生成测定波长物吸收的配合物，如加入氧化还原掩蔽剂，改变干扰离子的价态。2、选择适宜的显色条件，如控制溶液的酸度等，使干扰离子与显色剂不发生反应。3、采用双波长或其他选择性的方法；4、分离干扰离子。

问题序号可能原因解决方法 显色淡，灵敏度偏低 1  试剂盒未充分平衡 试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃） 2  样品不适合做ELISA检测 样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分） 3  酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 防止板过于干燥 4  包被抗体遭到破坏 操作温和，移液枪不能碰到孔底 5  样本和抗体孵育条件不合适 按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。 6  洗涤浸泡时间过长 按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间； 7  偶联HRP试剂污染 弃去试剂，重新配置 8  错误的稀释偶联HRP试剂 弃去试剂，重新配置 9  TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间 确定合适的孵育时间：人为判定-最高浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65 10  样本浓度过高或存在基质效应 建议做不同稀释倍数，确认样本最佳稀释倍数。 11  酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对 确认仪器设置及选择正确的波长检测。 12  酶标板不适合做ELISA 不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。 背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD 1  洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。 2  底物污染，未避光保存，出现颜色 弃去底物，重新配置 3  样品稀释液污染 弃去稀释液，重新配置 4  吸头重复使用，未洗净或消毒不彻底 吸头尽可能一次性使用 5  不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间） 最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。完全按照说明书要求。 6  偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高 按照说明书调整到最佳的浓度 7  ELISA板子不正确的贮存 酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的Elisa板 8  没有正确封闭 在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间 9  样本溶血严重 建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。 重复性不佳，高CV值 1  样品不均一 加样前充分混匀样品，取样确保移液位置一致； 2  包被板表面遭到破坏 洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面 3  孔与孔之间的交叉污染 孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用 4  加样量不一致 样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 5  边缘效应（外周孔显色较中心孔深） 孵育时尽量100 rpm旋转混匀 6  微量加样不准确 保证微量加样的准确性和均一性 7  不正确的洗涤 洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，确定每一步的洗涤 出现白板，阳性对照不显色 1  显色液变质 更换新的显色液 2  洗涤液配制有误 请按说明书所示稀释倍数配制 3  未加酶结合物而认为已加入 注意不要漏加 4  终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 每次加液前均应看清标签 5  标准品稀释方法错误/或标准品有问题 请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数 6  不同试剂盒或不同批号的试剂混用 建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。 不正常的标准曲线 1  错误的方法重悬标准品  加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分 2  标准品稀释错误  按照说明书要求稀释标准品 3  标准品污染  使用一次性的灭菌吸头， 标准品贮存于2-8 ℃ 4  错误的倍比稀释步骤  按照说明书倍比稀释标准品 5  波长选择错误 TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而 前者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。 6  标准品混用  不同批号试剂勿混用 7  试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活  尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温 8  ELISA未终止而直接检测450nm和620nm TMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。（数值仍有梯度规律） 样品或标准品OD超出正常范围 1  错误的样品或标准品的稀释  完全按照说明书稀释 2  偶联抗体浓度过高  按照说明书调整到最佳的浓度 3  TMB底物孵育时间过长  调整到合适的孵育时间 4  样品或标准品污染  避免污染 5  错误的孵育时间或温度  完全按照说明书 6  孵育时未加盖导致溶液挥发和污染  贴封片或加盖 标曲很好，但是样本无法计算到数值 1  标曲选择不合适 选择最合适的标曲拟合； 2  样本含量很低，低于灵敏度无法被检测到 尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测 3 样本含量很高，超过标曲 建议进行预实验摸索稀释倍数，确保样本OD值落在标曲范围内 标曲高浓度间无明显趋势 1 如OD绝对值靠谱，但是仅无梯度，则显色过度 TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。 2仅作单波长检测。由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。

长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。“养细胞难、养原代细胞更难、养原代神经干细胞难上加难！”今天，远慕生物为大家详细讲解原代神经干细胞取材及培养的那些事，手把手教你轻松搞定~神经干细胞神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。原代取材及培养步骤一.原代取材：1.脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。2.将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。3.将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。重复2-3次。4.细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。5.按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。2天后隔天换液。通常一周左右，神经球长出。步骤二.传代培养：1.在光镜下观察细胞球中心已出现灰黑色区域时进行传代，将培养基转移至15ml离心中，800r/min离心5min，弃上清。2.加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打神经球至至细胞悬液， 800r/min离心5min，弃上清。3.加入适量干细胞培养液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），调整细胞浓度为5×105/ml，置于37℃，5%CO2继续传代培养。实验影响因素1.供体年龄的影响实验研究显示，胚胎鼠大脑皮质中的神经干数量明显高于新生鼠，且胎龄为12~15d左右的鼠胚胎体内的神经干的分化能力最强。2.分离方法对细胞纯度及活力的影响常用的细胞分离方法有机械分离法和酶消化分离法。机械分离法的缺点是吹力度和次数不易掌控，且机械切割作用会使细胞活性降低；酶消化法缺点是消化的时间不易掌握，并且用于分离神经干细胞的消化酶对细胞具有潜在的损害作用。3.接种密度对神经干的影响神经干细胞的适宜接种浓度一般可用1×10*8/L~1×10*9/L，接种细胞密度过小，细胞不成球，不利于细胞增殖；接种细胞密度过大，第一次传代后很快出现死亡、特大、散乱、单细胞数迅速增多。采用半量换液的方法可以最大程度地使细胞生存环境保持稳定,有利于细胞生长。4.传代培养时机的影响神经干细胞经过原代培养后中，细胞数量大量增殖，必将导致大部分神经干细胞因缺乏营养而死亡，因此及时进行传代是防止其死亡的关键，有文献报道一般选用原代培养5~7 d时进行，既可避免细胞过度增殖而死亡, 又保持细胞增殖的活性。注意事项1.为维持取材过程中的细胞活性，在取材整个过程中应都在冰上进行并且在剥离脑膜和血管组织中要在含有10%FBS高糖培养基中，因为胎鼠神经干代谢旺盛，长时间在无糖环境对神经干造成损伤。2.在取材过程中，不要取一个皮层，剥离一个脑膜血管，而是快速将所有胎鼠皮层取下来，放到高糖培养基中。3.剥离脑膜及血管应全部分离干净，否则在制作单细胞悬液时，会被迫加大吹打力量和次数，造成细胞损伤。4.在培养过程中，为防止细胞贴壁分化，隔天轻轻晃动培养基。5.避免细胞污染。加强无菌操作意识，做好实验室、实验器械等的消毒工作。

    在给许多客户介绍酵母浸粉时，很多人都会将其与酵母粉混为一谈，经常会问：“酵母浸粉不就是酵母粉吗？”“酵母浸膏和酵母浸粉哪个好呢？”    首先我们了解一下什么是酵母粉、酵母浸粉和酵母浸膏吧！    酵母粉含义：一般是指灭活的酵母，产品成分主要是失去活性的酵母菌体，营养成分包括仍然包裹在菌体内部的粗蛋白、胞壁多糖以及丰富的维生素、生长素、微量元素等。    酵母粉分类：分糖蜜酵母粉与啤酒渣酵母粉两大类，前者专门发酵生产并干燥制成，以糖蜜为主要原料，品质好且质量稳定；后者采用啤酒生产的废料－废啤酒酵母泥为原料，一般采取滚筒干燥制成，成本较低，但杂质较多，酵母细胞较老化，微生物不易吸收利用，品质不稳定。酵母粉主要在传统的抗生素等发酵行业应用较广泛。    酵母粉特点：微生物对酵母粉的营养物质利用率与利用速率较低，发酵完毕后不能利用的残留物（粗蛋白与菌体细胞壁）较多，难以处理。    酵母浸粉含义：又称酵母提取物，是采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、 浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色 干燥粉末。有酵母自然 香味，易溶于水，水溶 液呈淡黄色。酵母浸粉吸湿性，请放阴凉干燥处保存。酵母浸粉当中含有氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，酵母浸粉当中含有丰富的B族维生素和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。在当中它起的主要作用是补充氮源和提供细菌生长的各种维生素及氨基酸。    酵母浸粉分类：同样可以采取糖蜜发酵的糖蜜酵母和啤酒生产的废啤酒酵母泥为原料生产。 糖蜜酵母生产的酵母浸粉一般品质较高，这一方面是糖蜜酵母发酵经过专业的生产控制，原料品质就比较高，另外啤酒酵母粉为原料也有利于酵母积累更丰富的天然营养成分。另外一方面是以糖蜜酵母为原料的酵母浸粉生产规模可以做的很大，生产厂家可以充分采用先进的生产工艺设备与技术，从生产技术的角度保证酵母浸粉产品的高品质。    酵母浸粉特点：酵母浸粉的生物利用度高，微生物的利用速率快，特别有利于对发酵培养基比较挑剔的营养缺陷型、基因重组工程菌的吸收利用，有助于缩短发酵周期，提高微生物发酵效价；同时发酵残留非常少，有利于发酵废液的环保处理。 酵母浸粉主要用于微生物培养基制备的基础原材料以及生物制药发酵。    酵母浸膏以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色精制浓缩而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的膏状产品。    废啤酒酵母泥生产的酵母浸粉品质一般要大大差于糖蜜酵母浸粉，这主要是因为废啤酒酵母泥本身是啤酒生产的副产物，不存在什么质量控制；另外一方面是废啤酒酵母泥不能长途运输，生产厂家一般只能依赖周边啤酒厂的有限供应，生产规模难以扩大，因此限制了厂家的投资规模，一般只能土法上马，难以把生产技术装备以及所能采取的技术手段提升到理想的状态，导致产品色泽较深、不溶性杂质较多，维生素、生长素等微量营养物质的含量也比较欠缺。    酵母粉和酵母浸粉是完全不一样的产品，更不能混为一谈。    酵母浸粉和酵母浸膏的区别在于酵母浸粉经过高温瞬时干燥所损失的营养成分比酵母浸膏长时间浓缩所损失的营养要少得多，所以酵母浸粉在实际使用中用量更经济，且使用方便，也更易于运输和保存。    酵母浸粉和酵母浸膏应用领域食:品饲料领域、动物营养领域、生物发酵领域、营养保健领域、发酵工业领域：可用于抗生素新药、多肽、核苷酸、B族维生素、生长因子、氨基酸、有机酸、酶制剂、生物防腐剂、原料药、VC及肌苷、生物材料、维生素、微量元素、基因工程等生物工程产业。为微生物发酵培养提供全面均衡的营养;、微生物培养基:假单胞杆菌、醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸链球菌、葡萄球菌、酵母及支原体。

    牛肉浸膏和牛肉浸粉哪个更适合您？    很多客户在选择产品的时候，不知道究竟该选用牛肉浸膏还是牛肉浸粉。针对这个问题，远慕生物为大家解惑！    【牛肉浸膏简介】    牛肉浸膏（Beef Extract），是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。    牛肉浸膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。该产品广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备。在当中它起的主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的营养不足，一般的用量为0.3%～0.5%。    牛肉浸膏是一种生物发酵工程常用的褐色粘稠膏状酶解物。主要为微生物提供优质易利用高级氮源 。    牛肉浸膏的生产工艺有二种：化学酸碱高温水解法和多酶生物低温酶解法。目前比较流行的的是低温酶解法，其所含的具有生物活性的微量生长因子不会因高温或酸碱而失活，微生物生长旺盛，代谢活力高，发酵产率高。    “工业牛肉浸膏（酶解型）”主要用于发酵行业，包装规格25公斤一桶。    【牛肉浸膏技术标准】    总    氮：≥ 9.0%；氨 基 氮：≥ 2.0%；固 形 物：≥ 60.0%    远慕生物温馨提示：也有人将牛肉浸膏称为牛肉膏，微生物发酵用牛肉膏是特为微生物培养与发酵制造的专用牛肉膏，不宜直接用于食品调味行业。因本品仅为培养微生物而制，不含任何食品所需的增香、增味添加剂，因这些添加剂不利于微生物的生长。    【牛肉浸粉简介】    牛肉浸粉是采用新鲜牛肉通过生物提取技术精制加工而成的类黄色干燥粉末，含有多种营养成份，适合做微生物培养用原料，提供细菌生长所需的生长因子。牛肉浸粉中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质等，主要为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，一般使用浓度为 3g/L。有试验采用牛肉浸粉不同浓度的配方配制基础培养基，接种标准菌株在基础培养基中添加浓度为 1-7g/L 的牛肉浸粉时，菌株生长良好，得分范围为 1.8-2.0；菌落典型，得分均为 3.0；抑制性较差，得分范围为 1-2；培养基外观较好，得分均为 3.0；牛肉浸粉添加浓度为 3-5g/L 时，基础培养基的性能指标较高，为 10，其余浓度的为 9.0。说明牛肉浸粉的添加浓度在 3-5g/L 时效果较好。    【牛肉浸粉制备】    牛肉浸粉以新鲜牛肉为原料，经热处理，过滤、浓缩、干燥制成牛肉原粉，再将牛肉原粉经过水解、固液分离、冷藏、过滤、浓缩及干燥等工序获得。色泽呈类黄色。    【牛肉浸粉应用】    牛肉浸粉主要作为培养基原料使用。牛肉浸粉可作为蛋白胨的营养补充剂，补充蛋白胨中所缺失的矿物质、磷元素 、能量物质和长链脂肪酸。用于配制多种培养基，尤其是营养要求较高的微生物培养基。    牛肉浸粉用于培养链球菌、不产芽孢的厌氧菌、嗜热嗜酸细菌、产甘露糖的第三芽胞梭菌、产甲烷的污泥分离物。    【牛肉浸粉技术标准】    干燥失重：≤ 6.0%；    炽灼残渣：≤ 13.0%；    总       氮：≥ 14.0%；  氨 基 氮：≥ 2.5%。    远慕生物提示您：牛肉浸膏与牛肉浸粉的前提工艺一致，只是物质形态各有不同，对一些需要营养齐全的微生物体，建议采用牛肉浸膏，因为在其生产过程中，未经高温侵蚀，所以，各种氨基酸保存完整。

    什么是培养基？远慕生物针对——培养基，做一下详细的介绍。    【培养基含义】    培养基，是指供给微生物、植物或动物（或组织）生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。    培养基种类很多，根据配制原料的来源可分为自然培养基、合成培养基、半合成培养基；根据物理状态可分为固体培养基、液体培养基、半固体培养基。    根据培养功能可分为基础培养基、选择培养基、加富培养基、鉴别培养基等；根据使用范围可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基、真菌培养基等。    培养基配成后一般需测试并调节pH，还须进行灭菌，通常有高温灭菌和过滤灭菌。培养基由于富含营养物质，易被污染或变质。配好后不宜久置，最好现配现用。    培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在3-6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，均改制成粉末。    本公司生产的培养基原材料部分，根据生物催化的条件和纯化条件的不同，特划分为三个级别：    （试剂级）： 是所有级别中最高的，最好的一级其要求是产品的2%水溶液在碱性高压条件、磷酸盐高压条件下无任何杂质、沉淀产生。各种微生物学检测指标处于优级水平。这类产品一般适用于各类培养基厂家，要求很高的药厂食品厂做基因工程蛋白质组学工程疫苗工程微生物检验室和大专院校科研院所等 。    （生化级）：是指产品的2%水溶液在碱性高压条件无沉淀、磷酸盐高压条件下有杂质、沉淀产生。各种微生物学检测指标处于较好水平。这类产品一般适用于各类药厂、食品厂，L-氨基酸工厂，乳制品厂，维生素厂家，相对粗放的疫苗工程，微生物检验室等。    (工业级)：是指产品的2%水溶液在碱性高压条件有沉淀、磷酸盐高压条件下有杂质、沉淀产生。各种微生物学检测指标处于较差水平。这类产品一般适用于各类抗生素厂、动物保健品厂，饲料加工厂，工业大发酵厂，肥料厂等要求不高，后期不需要纯化的工厂使用，特殊情况例外。