两种RT-qPCR方法的优缺点比较

上海远慕生物科技有限公司

2020/06/09 10:18

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实时聚合酶链反应(pcr)是基于pcr的革命性方法，这一技术是pcr高灵敏度和实时检测相结合的结果。实时定量聚合酶链反应(rt-qpcr)的独特特征就是把目的基因的扩增与荧光信号联系起来，并将其量化。在定量基因表达分析,目前有两种方法最受欢迎, sybr green and taqman，那么这两种哪个更好呢？本文分别分析其优缺点。

一、荧光染料法(sybr green)

其原理是：在pcr反应体系中加入过量荧光染料，dna扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入dna双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。如果你要扩增你的目标样品40个循环，在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。

优点：

    成本较低，适合大规模的实验。

    在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计。

缺点：

    特异性不是很高。染料可以插入任何双链dna，包括引物二聚物和非特异性产物。

    如果引物二聚体存在或者产物受到污染，得到的结果会不可靠。

    更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。

    需要更多的时间进行结果分析。

二、寡核苷酸探针(taqman)

这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短dna分子)，探针通常在5 '端和3 '端都被标记。

在探针的5’端有报告基团，3’端设计淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。rt-qpcr反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与pcr产物同步。

使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游

互补序列的结合。

优点：

    更有可能只放大所需的产物，由于引物和探针的结合具有特异性。

    不需要解离曲线，只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。

    由于具有特异性，数据更可靠。

    数据分析时节省时间。

缺点：

    需要大规模实验时耗费成本高。

    需要更长的时间来设计实验，因为需要好的引物和探针。

总的来说，这两种荧光检测方法都很有效，但对于你的具体实验，可以选择适合的方法。