NADH氧化酶（NOX）测试盒 可见分光光度法

NADH氧化酶（NOX）测试盒 微量法/紫外分光光度法

NADH氧化酶(NOX)测试盒/微量法说明书
注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:
NOX(EC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将 NADH 氧化为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生,而且与免疫反应密切相关。

测定原理:
NOX 能够将 NADH 氧化为 NAD,NADH 的氧化与 2,6 二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的 DCPIP被还原为无色的 DCPIP,在 600nm 下测定蓝色 DCPIP 的还原速率计算出 NADH 氧化酶活性的大小。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、蒸馏水
 
试剂的组成和配制:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
试剂五:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 5mL 蒸馏水,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
 
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 NOX(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 NOX 活性测定。血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 600nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)试剂四于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。
(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、200μL 试剂四和 40μL 试剂五,混匀,记录 600nm处 20s 时吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。