什么是KASP
KASP (kompetitive allele specific PCR,竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应) 是一种基于单核苷酸多态性(SNP) 的新型基因分型技术。该技术基于PCR 反应结束后的荧光读取,每孔采用双色荧光检测一个样本一个位点可能的两种基因型,是目前最为高效和经济的基因分型手段之一。下面我们来看看如何通过盘古qPCR仪进行KASP基因分型检测。
KASP 工作流程
第一步:
设计对应的探针与引物,引物一共是三条,两条带有荧光接头的分型上游及一条通用下游(下图A)。探针一共是四条,两条荧光探针和两条淬灭探针(下图B),荧光探针与淬灭探针是互补的,且荧光探针是与特异性上游引物的接头部分序列(tag sequence)一致。
第二步:
通过qPCR仪进行PCR扩增。在第一轮PCR扩增中,等位基因特异引物(3'末端能配对的)就可识别特定等位基因模板,完成等位基因识别,反向通用引物也会结合并完成整个PCR过程,在此阶段,荧光标记的探针仍与其互补的淬灭探针结合,并且不会产生荧光信号。从第二轮PCR扩增开始,产物中出现携带通用标签序列(tag sequence)的模板,这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物中。随后携带荧光的探针通过与tag互补的DNA链结合而添加到PCR产物中,因此不再与其互补的淬灭探针结合,从而产生荧光信号。
PCR过程中如何保证探针和引物都能按照预期进行结合呢?
因为设置了降落PCR的程序,可以保证探针及引物的分开结合。当退火温度高时,引物因为Tm值高,会先与模板进行特异性的结合,然后在Taq酶作用下进行扩增,从而增加探针扩增的原始模板。随着退火温度降低,探针开始结合模板,然后产生荧光信号。
第三步:
盘古qPCR检测运行后,在SNP分析菜单下获取KASP数据。
盘古快速荧光定量PCR系统助力KASP基因分型检测
•升温速度可达8.5℃/s,一次快速完成96个基因分型反应并出具结果,产物得率高,特异性好
•温控精度±0.1℃满足KASP对扩增温度的严苛要求,确保识别单个碱基差异的特异性
•支持12列温度梯度功能,便于快速优化KASP扩增所需条件
•光波导顶部检测,无边缘效应和光程差,无需校准
•6色检测通道,支持各种常用荧光标记,兼容常用KASP分型试剂盒
KASP应用
KASP技术具有灵活、便宜、准确等特点,相比于其他技术,具有一定的灵活性,更容易实现高通量和自动化检测。另外,KASP采用的是通用探针,可以与各种不同的基因特异引物配合使用,而不需要针对每个特定的位点进行探针合成,这极大降低了实验的试剂成本。该技术目前已在动植物育种、种质资源鉴定、遗传图谱构建和种子纯度鉴定等领域得到了广泛的应用。
[来源:艾普拜生物科技(苏州)有限公司]
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