数字PCR应用丨naica®微滴芯片数字PCR技术定量DNA标准品助力弧菌NGS检测

导 读

弧菌是一种普遍存在的革兰氏阴性菌属，广泛存在于温带水生和海洋环境中，随着水温升高，给人类健康带来新的问题，弧菌由100多种弧菌属组成，其中12种可致人类感染，其中霍乱弧菌最为常见，可引起严重腹泻病，其他两种常见的非霍乱弧菌是副溶血性弧菌和创伤弧菌，与弧菌病有关，例如伤口感染、败血症和胃肠炎，主要通过接触受污染的水和食用受污染的海产品（主要是牡蛎）传人。弧菌的表征与检测正在从基于培养的传统方法转向新方法的应用，如定量PCR，数字PCR，NGS等。瑞士科学家发表于BMC Genomics的文章“Vibrio-Sequins - dPCR-traceable DNA standards for quantitative genomics of Vibrio spp”建立Vibrio-Sequins的DNA标准使用数字PCR（dPCR）进行绝对定量，再通过DNA标准品对弧菌属进行NGS测序定量分析，降低文库制备和测序的技术偏差。

应用亮点：

▶  开发六种DNA标准品，命名为Vibrio-Sequins ，同时配套优化的 TaqMan检测方法，用于dPCR方法进行DNA文库绝对定量拷贝数浓度（cp/μL）的检测。定量限LOQ 范围：20-120 cp/μL，检测限LOD均为 ~ 10 cp/μL。

▶  数字PCR作为更精准的方法，用于验证NGS定量方法的准确性。

▶ 通过DNA标准品将NGS和dPCR两种技术串联应用，提高基于NGS测序定量分析的精密度和准确度。

研究成果：

dPCR方法验证

（A）三种用于定量弧菌DNA基质中Vibrio-Sequins的双链dPCR 方法（HC1-LC1、rplA-xni、ushA-valS）拷贝数浓度对数的线性拟合分析。

（B）用于定量弧菌DNA 基质中Vibrio-Sequins的三种 dPCR 方法（HC1-LC1、rplA-xni、ushA-valS）的未转化的线性关系。斜率表示标准品的Qubit和dPCR 测量值之间的差异。

（A-B）测量相应标准品的PCR扩增子的拷贝数范围为3–50000 cp/μL。数据表示扩展测量不确定度（±MU）的平均值 （n = 10; nruns= 3）。

（C）Vibrio-Sequins标准品的dPCR方法验证的相关结果。显示的数据是三次dPCR实验总体平均拷贝数浓度（cp/μL）和总体CV值（%），重复性（%），批间重复性（%），标准不确定度（%），以及k=2的MU不确定度。

Vibrio-Sequins进行归一化和定量NGS分析

（A） 散点图显示单DNA文库中Vibrio-Sequins标准品的预期拷贝数浓度 （cp/μL）与测量拷贝数浓度 （cp/μL） 的线性关系。预期拷贝数浓度是指在对样品进行加标后为每个标准品计算的拷贝数浓度，基于Vibrio-Sequins的dPCR定量结果。测得拷贝数浓度是指样品经过文库制备后dPCR测得的拷贝数浓度。图中显示了Vibrio-Sequins混合物（1 = 圆形和 2 = 正方形）的六种标准品 HC1（紫黑色）、LC1（深蓝色）、rplA（青蓝色）、ushA（绿色）、valS（浅绿色）和 xni（黄色）中每个标准品的单个重复的拷贝数 （cp/μL）（1 = 圆形），以及变异系数（黑色）±变异系数 （%CV; n = 10）。

（B） DNA 文库中Vibrio-Sequins测序定量的准确性。散点图显示了Vibrio-Sequins中（1 = 圆形和 2 = 正方形）六种标准品 HC1 （蓝色）、LC1 （紫色）、rplA （粉红色）、ushA （红色）、valS （橙色） 和 xni（黄色）中每个标准品单个重复的非归一化覆盖率 （1 = 圆形和 2 = 正方形） 与Vibrio-Sequins的投入浓度 （attomoles/μL）。

（C） DNA 文库 （S28-S47） 内Vibrio-Sequins测序定量的准确性。散点图显示了两种Vibrio-Sequins（1 = 圆形和 2 = 正方形）中六种标准品 HC1（淡紫色）、LC1（紫色）、rplA （粉红色）、ushA（红色）、valS（橙色）和 xni（黄色）中每个标准品单个重复的归一化覆盖率 （1 = 圆形和 2 = 正方形） 与Vibrio-Sequins的投入浓度 （attomoles/μL）。通过对DNA文库中Vibrio-Sequins的最低覆盖率进行子采样读取，进行归一化。

（D） 三种不同的弧菌DNA混合物（A、B 和 C）由 Qubit 定量，包括来自霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和梅茨尼科维弧菌的不同量的DNA，并以 2%的丰度加入Vibrio-Sequins混合物 1（混入 A 和 B）或Vibrio-Sequins混合物 2（混入C）。

（E） 采用 [23] 中开发的方法，使用DNA文库（S28、S29和S38 = 弧菌混合物A-C）中Vibrio-Sequins的dPCR拷贝数浓度（cp/μL），针对三种弧菌DNA混合物（A、B 和 C）中的对弧菌来源的DNA进行定量。

微生物DNA的基因组分析和定量越来越多地应用于弧菌属的基础研究和诊断。与传统的基于培养的方法相比，基于测序的方法的显著优势是不需要任何关于样品的前期信息。此外，可以检测到非常少量的弧菌衍生DNA以及不可培养的弧菌菌株。然而，尽管（宏）基因组学具有不可或缺的技术优势，但由于文库制备、测序和比对过程中出现的技术偏差，很难对结果数据进行定量分析和样本间比较。

Vibrio-Sequins可用于确定和减少误差源和DNA文库间的差异，也可用于在不同的文库制备和测序方法之间、实验和批间以及单个 DNA 文库之间进行归一化，保留生物学上有意义的差异的同时，显著减少技术变量来源的偏差。除了质量标准化外，Vibrio-Sequins还是弧菌属 DNA定量的重要工具。

作者已经证明，通过将NGS与可量值溯源标准品的 dPCR 方法串联，并通过使用Vibrio-Sequins标准品，实现了混合样本中几种弧菌 DNA 的精确定量。因此，该方法可能应用于定量宏基因组样品中未知数量的DNA，从而能够检测痕量的弧菌DNA。Vibrio-Sequins的实施以及NGS与dPCR的联合应用，将提高现有宏基因组测序方法的准确性。

结论：

通过参考标准品将NGS和dPCR联合应用，提高基于NGS的定量方法的精密度和准确度，为测序定量的计量可追溯性提供了途径，为将测量科学整合到基于NGS的方法中开辟了新思路。

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10318669/

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