走进PCR小世界，常见问题知多少

新学期开始，刚进实验室的“实验小白”开始苦恼了：师兄师姐都说PCR实验很简单，然而我的PCR实验却反复没有结果，实在让人头疼。

不要急，本文整理了PCR实验中可能遇到的一些问题，帮助大家轻松掌握PCR实验！

1. 1、PCR产物的电泳检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

1. 2、假阴性，不出现扩增条带

一、模板核酸的制备：模板中含有杂蛋白质、Taq酶抑制剂；在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；模板核酸提取过程出现问题。

二、酶的质量及活性：酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

三、引物的质量与特异性：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

引物设计对策：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

四、PCR循环条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。因此扩增仪温度的准确性和均一性是获得稳定扩增的保障。

艾普拜生物的精卫自动PCR仪采用镀金槽的设计，不仅具有优异的热传导性能，能够快速且均匀地传递热量，使PCR反应体系中的温度变化更加迅速和准确，可以提高反应的效率和特异性，减少非特异性扩增的出现。而且具有良好的温度均匀性，使得热量能够在槽内均匀分布，确保每个样品孔位的温度基本一致，提高实验结果的可靠性和可重复性。

1. 3、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

一、引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

二、靶序列或扩增产物的交叉污染：整个基因组或大片段的交叉污染或者是空气中的小片段核酸污染。 

1. 3、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

  精卫自动PCR仪  

精卫自动PCR仪有Kingwell 96、Kingwell 96DW和Kingwell 384三款型号可选，能够满足不同通量的实验需求。所有型号均采用镀金样品槽，能够带来更好的温控性能和更快的升降温速度。同时所有型号均采用简洁现代的外观设计，搭配10.1英寸彩色触控屏和智能化操作系统，带来更高效便捷的实验体验。