Promethus助力AAV血清型检测——快速，经济，简便，可靠 ！

重组腺相关病毒 (AAV) 载体由于其良好的安全性、高转导效率和在非分裂细胞中的长期基因表达，已发展成为最有前途的基因治疗技术。基于 AAV 的基因疗法对于治疗遗传性失明、肌肉萎缩或出血性疾病等遗传疾病具有很大的前景。存在多种天然存在的和工程改造的 AAV 血清型，它们的衣壳序列不同，因此在细胞嗜性上有所不同，在AAV研发工作中快速地评估不同血清型的AAV是十分重要的。

https://doi.org/10.1016/j.xphs.2019.10.031

在这篇文章里，作者提出使用nanoDSF 技术测量，作为确定 AAV 衣壳 Tm 的一种简单替代方法。该研究表明，nanoDSF 测量是一种简单、准确和快速的 SO-DSF 替代方案，它能够以出色的精度表征 AAV 衣壳稳定性，并且不需要任何其他染料。

AAV 颗粒由 3 个结构病毒蛋白（VP1、VP2 和 VP3）和一个大约 4.7 kb 的单链 DNA 基因组组成，其中包含 2 个反向末端重复序列 (ITR) 之间的 2 个基因 Rep 和 Cap。Rep 编码多种非结构性 Rep 蛋白，这些蛋白对于病毒基因组复制和包装至关重要。Cap 包含一个开放阅读框，它以大约 1:1:10 的比例从不同的起始密码子产生 VP1、VP2 和 VP3 蛋白。

不同的 AAV 血清型不仅具有不同的细胞趋向性和转导谱，而且它们的结构特性和稳定性也不同。后一个特征也反映在热稳定性上，并导致衣壳的血清型特异性解链温度 (Tm)。nanoDSF 方法基于 AAV 衣壳蛋白序列中色氨酸残基的内在荧光，其在 AAV 血清型中高度保守，其光谱特性取决于其局部环境。从疏水环境到亲水环境的变化会导致在紫外范围内激发时色氨酸的发射光谱发生红移。通过这种简单的测量，可以在 1 小时内确定不同 AAV 血清型的 Tm，检测浓度大约 2Ⅹ10¹¹ cp/mL，样品体积仅为 10 μL。

文中作者对不同血清型的AAV进行了检测，并且检测了不同生产实验室生产的AAV都是可以得到很好的区分，其中，除了AAV3/AAV8及AAV9/AAV10这两对不能很好的有效区分，作者报导对于其他AAV血清型都是可以很好的快速区分的，并且仪器的准确度与重复性都是十分优秀的。

为了检测仪器的对不同血清型AAV的区分度，作者使用不同血清型的AAV进行混合后，如上图所示，不同比例混合下的AAV可以很好的在Promethus上得到区分。而检测样品的浓度可以低至2Ⅹ10¹¹ cp/mL，样品体积仅为 10 μL，可以很好的节省实验样品进行更多地其他分析。

在本研究中，使用nanoDSF方法来确定AAV衣壳的Tm，作为血清型鉴定的方法。使用nanoDSF测量Tm是一种简单、快速（30-60分钟）和高通量（48个样品/30-60分钟）的方法，用于以低成本和低材料输入（2Ⅹ10¹¹cp/mL，10 μL）测定AAV-Tm，从最终产品和过程控制样品中很容易获得如此少量的材料。由于nanoDSF测量也允许检测与工艺相关的杂质，因此该方法是一种非常有吸引力的高通量筛选方法，用于在纯化过程中监测样品纯度和分析批次间的一致性。

尽管 nanoDSF 可以快速可靠地确定 Tm，因此可以了解 AAV 衣壳的类型，但最明显的问题是具有非常相似的热稳定性水平的 AAV 衣壳，例如 AAV3 和 AAV8 或 AAV9 和 AAVrh10无法进行区分。但这一限制可以通过测量不同的缓冲液来克服，在这些缓冲液中，AAV 血清型表现出不同的热稳定性并允许区分对。除此之外，该方法很容易区分所有AAV血清型表现出不同的热稳定性并被有效区分出来。此外，可以精确测量 AAV的混合物，并且可以在 1:10 的浓度比下区分 1 个样品中的 2 种血清型。由于nanoDSF方法在常用的配方和储存缓冲液及洗涤剂中具有独特的稳定性，不会受到缓冲液成分影响，因此它为AAV血清型鉴定提供了一种快速、经济、可靠的方法。

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