NanoTemper Monolith及Promethus助力小分子靶向无序蛋白（IDP）的研究

前列腺癌是全球男性最常见的癌症之一。早期、低级别的癌症可以通过手术或放射成功治疗。对于患有前列腺以外的高级别肿瘤的患者，标准治疗与雄激素治疗相结合。雄激素消融阻断前列腺肿瘤赖以生长和存活的男性激素，最初是有效的；然而，在没有雄激素的情况下，前列腺癌会再次生长，并发展为更具侵袭性的形式，称为去势抵抗型前列腺癌（CRPC）。抗去势前列腺癌患者不可避免地会对抗雄激素疗法产生耐药性，部分原因是雄激素受体（AR）突变或剪接变体能够恢复AR信号。

上海奕拓生物和上海中国科学院生物与化学交叉研究中心朱继东/朱光亚团队合作的研究显示配体活化的AR可以形成转录活性的聚合物。AR的结构化和非结构化区域都有助于AR的有效相分离，无序N端起主要作用。AR液-液相分离行为具有转录活性和抗雄激素功效。抗雄激素可以以配体独立的方式促进AR抗性突变体的相分离和转录活性。该研究进行了基于相分离的表型筛选，并鉴定了ET516分子，ET516特异性破坏AR聚合物，有效抑制AR转录活性，并抑制表达AR抗性突变体的前列腺癌细胞的增殖和肿瘤生长。研究的结果表明液-液相分离是一种新的耐药机制，并表明靶向相分离可能为药物发现提供一种可行的途径。

在这项研究中，来自于NanoTemper的微量热泳动MST互作技术以及nanoDSF蛋白稳定性技术发挥了重要的作用。

图注：微量热泳动(MST)实验，作者用AR (NTD，1-555aa)–mEGFP

蛋白与不同浓度的ET516（蓝色）以及Enza（红色）孵育进行MST实验。mEGFP蛋白用作阴性对照（绿色）。使用亲和力分析软件拟合数据。结果表明，ET516与NTD的亲和力K_d值25µM，表明ET516可以作为很好的候选分子。

图注：与ET516孵育的AR AF-1（144-450 aa，0.3 mg/mL）中的TSA测定

加热过程从25℃增加到81.5℃，升温速率为1℃/min。记录发射强度比（Em350nm\/Em330nm），分析荧光强度比（左图）和一阶导数（右图）。

监测蛋白内源荧光的nanoDSF实验显示，ET516处理后AR AF-1中的荧光比率呈剂量依赖性下降，进一步证实了ET516和AF-1的相互作用。热位移TSA结果表明，AF-1是典型的固有无序蛋白，其在加热过程中没有明显的发射强度变化；然而，与ET516孵育诱导了AF-1熔化温度的剂量依赖性变化，表现为球状蛋白，表明ET516与重新分布后稳定的构象AF-1结合。Promethus系列仪器通过内源荧光检测，无需加入染料，对缓冲液没有要求，高精准的检测精度可以保证即使是极小结构变化造成的Tm值shift都可以很好表征。

对于固有无序蛋白，因为其蛋白的无序性的特性，其他常规方法难以进行检测。在这篇工作中，通过MST技术及nanoDSF技术，很好的筛选到目的分子。

Monolith系列分子互作仪基于MST技术，不依赖于分子量的改变，蛋白用量少，对于蛋白聚集耐受度高，可以轻松表征不同类型的分子间相互作用。

Promethus系列仪器，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性，该技术检测蛋白浓度宽泛，低浓度也可轻松表征，媲美DSC的高精准检测结果，快速高通量的检测速度，在小分子筛选上具有不可比拟的优势。