中山大学药学院教授,博士生导师。主要从事生物质谱新技术的开发及应用。
大家好,本周为大家分享一篇发表在Anal Chem上的文章,Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue [1]。该文章的通讯作者是来自英国伯明翰大学的Helen J. Cooper教授。
非变性原位质谱(native ambient mass spectrometry, NAMS)是一种新型的自上而下质谱分析方法。它结合非变性质谱和原位质谱的优势,可直接在蛋白质及其复合物的生理环境中进行对其进行无标记表征。NAMS可提供蛋白质结构、空间及瞬时相互作用的信息,具有直接从组织中分析内源性蛋白质组装体的巨大潜力。但是,目前,NAMS仅成功应用于直接检测低分子量 (<20kDa) 或高丰度的蛋白,如血红蛋白四聚体或RidA 同源三聚体。
目前应用于组织中蛋白质NAMS分析的技术有液体萃取表面分析(LESA)与纳喷雾解析电喷雾电离 (nano-DESI)[2]。LESA需要对组织底物进行自动微液节点采样,然后进行纳喷雾电离(nanoESI)进行MS分析。nano-DESI则通过探针与流动相形成流动溶剂桥,与样品直接接触,之后进行质谱分析成像。
在本研究中,作者采用NAMS对大鼠脑、肾、肝组织切片中的蛋白质组装体进行全面分析。主要通过调整质谱仪中的离子光学和气体压力以改善m/z传输与纳喷雾性能,来实现对较大蛋白质组装体的分析。结果鉴定出八种蛋白质组装体,证明了NAMS的可及分子量高达145kDa,并通过nano-DESI质谱成像在大脑和肾脏中绘制了高达94kDa的蛋白质组装体的空间分布。
在脑组织中,作者通过nano-DESI NAMS绘制了大鼠大脑切片中分子量为37.0–66.4kDa的完整蛋白质复合物的空间分布以及对应的质谱图(图1a,b)。实验成功鉴定并成像出大鼠脑组织中三种蛋白质组装体,包括同源三聚体细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF, 37.0kDa)、同源二聚体磷酸甘油酸变位酶1 (PGAM1, 57.6kDa)和苹果酸脱氢酶2 (MDH2, 66.4kDa)。结果发现,MIF在整个脑组织区域是均匀分布(图1c)。作者通过nano-DESI-HCD MS2分析产生的单体 (5+、4+) 和二聚体 (5+) 亚基和序列离子的谱图,识别出MIF(图1d)。作者还利用nano-DESI-HCD MS2成功识别出PGAM1,并发现PGAM1在大脑皮层区域中显示出高丰度,而在中脑和胼胝体中的丰度较低(图1e,f)。相比之下,MDH2在脑组织中的空间分布基本均匀(图1g,h)。检测到的结果与蛋白在大鼠脑中的实际分布相符合,可信度较高。
图 1. 离子图像和 HCD MS2光谱表明大鼠脑中蛋白质复合物的亚基解离。(a) H&E染色的连续组织切片的光学图像。标签:Ce,小脑;C,大脑皮层;CC,胼胝体;F,穹窿;V,侧脑室区;Mb,中脑;Me,髓质和脑桥;H,海马;Th,丘脑;Ht,下丘脑;BG,基底神经节;OR,嗅觉区域。(b) Nano-DESI 全扫描质谱,代表光学图像中标记为“(b)”的像素。(c,d)巨噬细胞抑制因子同源三聚体显示均匀分布。(e,f)PGAM1同型二聚体分布。(g,h)MDH2同型二聚体分布。
此外,作者在大鼠肾脏中鉴定了四种同源二聚体蛋白组件(61.2-94.2kDa),包括ω-酰胺酶 (61.2kDa)、MDH2 (66.4kDa)、苹果酸脱氢酶1 (MDH1, 72.8kDa) 和α-烯醇化酶 (94.2kDa),并将其成像(图2)。其中观察到的α-烯醇化酶为金属结合形式,每个亚基上结合了2个Mg 2+离子。
图 2. (a)大鼠肾脏的H&E染色连续切片显示皮质(C)和髓质(M)组织。(b)在MSI期间获得的大鼠肾皮质组织中单个nano-DESI 像素的示例全扫描质谱。(c, d)α-烯醇化酶同型二聚体。(e, f)苹果酸脱氢酶1。(g, h) MDH2同型二聚体。(i, j) ω-酰胺酶。
研究还从大鼠肝组织中鉴定出同型三聚体鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC,108.8kDa)和同型四聚体乳酸脱氢酶A(LDHA,145.4kDa)(图3)。其中,在全扫描模式下,nano-DESI可以检测到145.4kDa的LDHA的较弱信号。通过nano-DESI-PTCR MS2的进一步确认,检测到的物质确实为LDHA。
图3. (a) 直接来自大鼠肝组织的完整OTC同源三聚体的nano-DESI-PTCR MS 2。(b) 完整OTC同源三聚体的nano-DESI-HCD MS 2显示亚基质量为36.2kDa。(c)完整LDHA同源四聚体 (145.4kDa)的nanoESI-PTCR MS2。(d)完整LDHA 同源四聚体的nanoESI-HCD MS2。
在此研究中,作者成功利用NAMS质谱分析方法,直接从组织中检测并鉴定出内源性蛋白质组装体,分子范围为37.0-145.4kDa,包括二聚体、三聚体以及四聚体。其中检测到的上限(145.4kDa)超出LESA MS报道的质量上限的两倍,比nano-DESI 报道过的质量上限高出100kDa。通过调整离子光学和高m /z的气体压力,或者后续仪器和方法的开发,NAMS有可能进一步突破145.4kDa的上限,检测到分子量更大的蛋白组装体。
[1]Hale OJ, Hughes JW, Sisley EK, Cooper HJ. Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue. Anal Chem. 2022 Apr 12;94(14):5608-5614.
[2]Hale OJ, Cooper HJ. Native Mass Spectrometry Imaging and In Situ Top-Down Identification of Intact Proteins Directly from Tissue. J Am Soc Mass Spectrom. 2020 Dec 2;31(12):2531-2537.
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