苏州医工所周连群团队在芯片式数字PCR检测技术和仪器研制方面取得系列进展

核酸检测逐渐成为病原体诊断的“金标准”，随着新型冠状病毒疫情的持续蔓延，核酸检测的重要性正不断被大众认知和认可。作为高灵敏度、绝对定量、高耐受性的新一代核酸检测技术，数字化聚合酶链式反应（数字PCR，dPCR），在稀有突变检测、拷贝数变异检测、液体活检、单细胞分析、转基因检测、病毒载量检测、微生物定量分析、NGS文库制备等应用领域发挥着重要作用。 

　　苏州医工所周连群课题组聚焦生物传感器领域，深耕十余年，在生物传感方法开发、生物芯片设计加工、生命科学仪器研制等方面积累了坚实基础。在数字PCR研发方面，基于隔离稳定性高、温度均匀性好、检测速度快的芯片式数字PCR（cdPCR）方法，自主研发了高通量数字化芯片及高通量数字化核酸分析仪，围绕高通量数字化核酸检测方法、芯片、试剂和仪器等方面取得了一系列重要进展。 

　　在高通量数字化芯片的加工与改性方面，周连群课题组的李金泽、邱亚军等人在Analyst上发表题为Heterogeneous modification of through-hole microwell chips for ultralow cross-contamination digital polymerase chain reaction的论文，提出了针对数字化芯片三维异质性改性的新策略，通过内壁亲水、表面疏水的异质性化学改性，实现了高填孔率、低残留的数字化样品分割。通过深硅刻蚀可以得到高密度蜂窝状微孔阵列，如何保证待测生物样本能高效的填充入微孔，并且降低液体在表面残留导致的孔间连通，是数字化样品分割的关键。针对该问题科研人员提出了对于均质硅材料的三维异质性改性策略，即通过微接触印刷只在特定的空间位置发生化学修饰，进而在均质材料的三维空间上形成具有不同化学性质的界面。通过工艺优化消除了样本挥发导致的扩散效应，实现了芯片表面的选择性疏水修饰。三维异质性改性后的芯片可以达到91%以上的填孔率以及小于5%的液体残留率，优于商业化的数字PCR芯片。利用该芯片可以实现高效准确的dPCR检测，定量结果的线性相关性达到0.999以上。该核心技术的突破为自研cdPCR的精准定量奠定了坚实基础。 

 图1 高通量数字化核酸检测芯片的三维异质性改性效果图 

　　在样本的数字化分配与封装方面，周连群课题组的高旭等人在Biomicrofluidics上发表题为High filling rate digital PCR through-hole array chip with double independent S-shaped flow channels的论文，提出了针对数字化芯片的微流控进样封装方法，通过双S型流道夹心数字化芯片的结构，有效提高的样品的填孔率和装载重复性。传统的刷样方式，受限于操作的繁琐性，存在耗时长、重复性差、易污染的问题，限制了芯片式数字PCR的应用。通过微流控结合标准化仪器设备，可以实现进样封装的标准化和自动化，简化用户的手动操作步骤和整体样品装载和封装时间。本文主要通过流体力学仿真结合试验验证，解决了流体样本与微孔相互作用过程中的稳定性、均匀性和重复性问题，通过合理的结构设计和优化的进样条件，实现了填孔率大于99%、填孔液体体积CV达6%的高效、高均匀性进样与封装。该成果的突破有效提升了自研cdPCR的易用性，为产品的临床应用推广奠定了良好基础。 

 图2 数字化芯片的微流控进样封装结构：（a）结构装配图；（b）结构爆炸图 

　　在芯片式数字化核酸检测的应用方面，周连群课题组与华山医院检验医学科关明课题组合作在Sensors & Actuators: B. Chemical（中科院I区）上联合发表题为Establishment of scalable nanoliter digital LAMP technology for the quantitative detection of multiple myeloproliferative neoplasm molecular markers的论文，对骨髓增殖性肿瘤（MPN）的多重标志物实现了超敏、多靶标、定量检测，从而为这种罕见病的早期诊断和靶向治疗提供新的方法。Ph染色体（费城染色体）阴性的经典骨髓增殖性肿瘤是以一系或多系分化相对成熟的骨髓造血干细胞持续克隆性增殖为特征的恶性血液疾病。随着分子生物学技术的迅速发展，越来越多的分子标志物被不断发现。根据世界卫生组织（WHO）最新的骨髓增殖性肿瘤诊断标准，JAK2、MPL和CALR三个基因的突变已被作为骨髓增殖性肿瘤诊断的重要参考指标。周连群研究员课题组与关明教授课题组“医-工”结合，将环介导等温扩增（LAMP）技术快速等温扩增的优势、微流控技术高通量的优势和数字PCR技术准确定量的优势进行整合，成功开发了一款数字LAMP检测平台，并基于纳米粒子的特殊功能，对现有的LAMP检测体系进行了改良，可在60分钟内实现骨髓增殖性肿瘤CALR-1、CALR-2和JAK2 V617F分子标志物的准确定量检测，检测灵敏度分别为0.5%、0.1%和0.5%突变水平。与现有的商业化数字PCR平台相比，本项目开发的数字LAMP平台具有检测成本低、检测速度快等优势，具有良好的应用前景。论文的第一作者为曹国君博士和李金泽博士。 

 图3 多靶标数字LAMP检测平台检测流程示意图 

　　芯片式数字PCR的研发工作得到了国家自然科学基金委、中国科学院项目的支持，形成了高耐受高扩增效率试剂（CN201811098669.3）、三维异质性改性（CN201810568211.3）、进样封装一体化（CN201910377557.X）、物理分区式多靶标检测（CN201710560138.0）、均匀快速热循环（CN201910911821.3）、高分辨率多色荧光成像（CN201910049908.4）、自适应图像处理算法（CN201910600118.0）等一系列核心技术，实现了方法、芯片、试剂和仪器的全链条自主知识产权创新。相关仪器入选《中国科学院自主研制科学仪器2021》目录，并完成了二类医疗器械的型式检验，进入医疗器械注册证申报流程；已经在华山医院、北京基因组所等多家医院、科研院所等单位开展了应用示范。 

 图4 芯片式高通量数字化核酸分析芯片及仪器

　　论文链接： 

　　[1] Jinze Li#, Yajun Qiu#, Zhiqi Zhang, Chuanyu Li, Shuli Li, Wei Zhang, Zhen Guo, Jia Yao, Lianqun Zhou*. Heterogeneous modification of through-hole microwell chips for ultralow cross-contamination digital polymerase chain reaction. Analyst, 145 (2020), 3116-3124. https://doi.org/10.1039/D0AN00220H 

　　[2]Xu Gao#, Jinze Li, Chuanyu Li, Zhiqi Zhang, Wei Zhang, Jia Yao, Ming Guan, Zhen Guo, Chao Li, Lianqun Zhou*, High filling rate digital PCR through-hole array chip with double independent S-shaped flow channels. Biomicrofluidics 14 (2020), 034109. https://doi.org/10.1063/5.0006374 

　　[3]Guojun Cao#, Jinze Li#, Zhifang Xing, Zhiqi Zhang, Wei Zhang, Chuanyu Li, Longhui Li, Zhen Guo, Shuli Li, Xu Gao, Yanchun Ma, Lianqun Zhou*, Ming Guan*. Establishment of scalable nanoliter digital LAMP technology for the quantitative detection of multiple myeloproliferative neoplasm molecular markers. Sensors & Actuators: B. Chemical 346 (2021) 130493.https://doi.org/10.1016/j.snb.2021.130493