安捷伦发布关键质量属性文章第二篇

关键质量属性（CQA）是生物学特征，会影响安全性和有效性，必须得到密切监测，因此需要使用各种分析技术对分子进行大量测试。

定义太空洞？当我们在谈论关键质量属性时我们在谈论什么？今天来谈谈滴度测定和电荷异构体分析。CQA 检测中，除了聚集体分析至关重要之外，滴度测定和电荷异构体分析也分别起到不同的作用。

滴度测定

滴度测定虽然不直接测量 CQA，但常作为生物治疗蛋白生产的第一步质量检查。异常滴度可反映细胞株或培养基存在的问题，这些问题可能会导致异质性或产品出错而不仅是降低产率。使用 UV 检测的 Protein A 亲和捕获色谱是生物制药中用于单克隆抗体 ( mAb )滴度测定的一种普遍方法。许多实验室选择基因修饰的重组 Protein A 平台，因为重组蛋白质通常更稳定，有更长的色谱柱寿命。天然（纯化）Protein A 的吸引力在于对某些 IgG 具有更紧密的结合亲和性。Protein A 产品可用作预装填柱、整体床柱和供用户填装使用的松散介质。整体床色谱柱具有更大孔径的筛板，因此不易堵塞，对复杂样品基质更加耐用。

异常滴度可能需要分析用过的细胞培养基，以排除低产量的原因。氨基酸是培养基的主要成分，可以通过多种技术进行分析，最常见的是利用 LC/UV 分析衍生化氨基酸。衍生化技术的优点是可以广泛应用，并可通过反应化学引入一定程度的特异性，但是人们对分析未衍生化氨基酸以最大限度缩短样品前处理时间也越来越感兴趣。未衍生化氨基酸不具有 UV 吸收，因此需要用到其他检测器，如蒸发光散射( ELSD ) 或质谱 ( MS ) 检测器。

然而，ELSD 的灵敏度不够高，仅能达到低纳摩尔水平，而衍生化氨基酸的 UV 检测可以达到低皮摩尔水平。MS 分析检测也能得到更高的灵敏度，在数量级上实现提升。虽然MS 仪器的成本一直是此方法广泛使用的阻碍，但其引发的越来越广泛的关注已经使供应商开始在市场中引入经济实惠且切合实际需求的质谱仪。

随着 MS 更广泛的使用，快速有效地分离分子量较小的极性分子成为一个需要克服的挑战。使用反相色谱柱分析离子对可得到非常稳定的结果，但需要专用仪器。过去， 亲水相互作用色谱 ( HILIC ) 一直在努力满足市场对稳定性和重现性的要求，而最近推出的色谱柱在这方面已经有了重大改进。

电荷异构体分析

使用 UV 检测的离子交换色谱 ( IEX ) 常用于分离由 PTM（如赖氨酸截短、脱酰胺或唾液酸化）产生的电荷异构体。此项分析通常也在完整蛋白质水平上进行，因为这种变化可以被检测到，但无法进行特定的鉴定和定位，IEX 通常使用盐梯度来进行，这些高浓度的非挥发性盐不适用于 MS。因此，一个新的关注点是使用 pH 梯度而非盐梯度，这样便可以使用低浓度且可以有效挥发的缓冲盐流动相，以便和 MS 联用。为了保留样品，IEX 要求样品具有与固定相相反的极性电荷。盐梯度 IEX 使用高浓度盐来破坏这些离子的相互作用并洗脱分析物。pH 梯度必须跨越分析物的等电点 ( pI )，以便蛋白质在电中性时被洗脱。尽管线性 pH 梯度难以重现，但 pH 梯度可以将分析物

聚集到较窄的谱带中，从而获得比盐梯度更高的分离度。由于必须非常精确地控制并适当地选择流动相 pH、离子强度和梯度组分，可靠的 IEX 方法开发具有挑战性。通常需要进行大量的方法开发，但可以利用软件来筛选仅由少量储备液制备的复合缓冲系统的梯度，从而简化方法开发。

毛细管等电聚焦 ( cIEF ) 也常用于电荷异构体分析。类似于 pH 梯度 IEX，cIEF 也是基于 pI 进行蛋白质异构体分离，是一项验证 IEX 结果的常用技术。