安捷伦发布关键质量属性文章第三篇

安捷伦 AdvanceBio 色谱柱专注用于生物制药分析，当您分析高度复杂的生物药物分子需要监控其纯度及关键质量属性，本章将为您讲述关键质量属性中的肽图分析和糖基化分析。

肽谱分析 — 特异性地鉴定和定位修饰的唯一方法

与先前讨论的 PTM 检测方法相比，肽谱分析是可以通过 LC/MS/MS 特异性地鉴定和定位修饰的唯一方法。肽谱分析主要用于检测目标蛋白的序列变异，但也越来越多地作为多属性方法( MAM ) 的一部分，用于同时定量 PTM，如氧化、脱酰胺基化、糖基化和异构化。在图 1 中，我们可以看到肽谱分析显示创新药物和生物仿制药 mAb 之间差异的示例。

图 1. LC/MS 总离子色谱图显示了创新药和生物仿制药产品肽谱的差异。 突出显示的差异由 C 端赖氨酸截短引起

MS/MS 实验表明，差异是由 C 端赖氨酸截短引起的。尽管样品前处理（还原、酶解和纯化蛋白质样品）过程较为复杂，但肽谱分析可以从单个实验中提供关于多个CQA 的大部分信息。在转移到 LC/UV 进行 QA/QC 之前，肽谱分析在蛋白质表征阶段严重依赖于 MS 检测。只进行紫外检测的情况下，无法确信已经建立了完整的肽谱图。精确质量数测定，通过 MS/MS 进行序列确认和 PTM 定位，对真实地表征蛋白质和鉴定关键质量属性非常必要。

肽谱分析的局限性包括：相对较低的通量（液相色谱方法通常需要一个小时或更长的时间）、色谱柱化学键合相的选择（能在保持 MS 分析灵敏度的同时拥有最大的色谱分离度）、如何获得较宽的动态范围以及如何应对修饰和未修饰肽的化学多样性。

糖基化分析—研究工具那么多，选哪个？

糖链是修饰的异质性中独有的 PTM。由于糖链在细胞信号转导中具有重要作用并且可以影响蛋白质构象，糖链结构的变异可能会导致有效性和安全性的改变。蛋白质上的糖基化位点和糖链结构本身对表征都非常重要，可以用来分析多种样品类型，如完整蛋白质、糖肽和释放后的糖链。

适用糖肽分析的研究工具

由于糖链仅占完整蛋白质相对小的一部分，因此通常情况下色谱分离几乎不会提供完整蛋白质糖基化状态的信息。而对此最重要的例外是使用离子交换测量唾液酸糖链。但是，质谱可以准确地测量高水平的糖基化，并且可以进行相对定量分析。当与反相分离相结合时，可以评估蛋白质纯度和糖基化状态。对于这些完整蛋白质水平的方法需要注意的是，它们无法测定具体的位点修饰。

释放后的糖链分析通常通过 HILIC 分离标记糖链结合荧光检测来实现。通常情况下，在将方法转移到 LC 荧光之前，会进行 MS 检测方法开发以确认峰归属。尽管 MS 确实比光学检测提供了更具体的信息，但糖链的结构表征仍然存在较大的问题。

MS/MS 技术创新对糖基化分析做出了重大贡献，电子迁移裂解 ( ETD ) 等基于电子的技术可以产生比更成熟的碰撞诱导解离 ( CID )表现出的碎裂模式更为丰富的穿环裂解。

糖肽分析很大程度上也依赖于 MS/MS，但糖肽不适合 HILIC 或反相分离。糖肽比大多数非糖基化肽更具亲水性，因此在用于肽谱分析的反相色谱柱上对其进行保留和分离具有很大挑战性。然而，糖肽的肽段基团常使它们难以通过 HILIC 进行保留和分离。混合模式色谱和二维液相色谱组合是可用于糖肽表征的研究工具。类似于糖肽引起的分离问题，肽段由 CID 充分而可预测（更重要）地进行碎裂，而如上所述，ETD 能给出更有帮助的糖链碎片。混合 ETD/CID 技术是未知糖肽表征的前沿技术。

法规越来越严格，怎么办？

生物固有的含水性使液相技术在生物治疗药物的 CQA 分析中占据主导地位。LC/UV 是 CQA 分析的重要基础，因成本不高、所需用户专业知识不多，这项技术的预计使用不会很快减少。然而，随着法规要求越来越严格，生物治疗药物变得越来越复杂，光散射和 MS 等可以提供更多信息和更高可信度的技术越来越受到青睐。由于效益与成本的比率以及所需技能的提高，这些技术一旦在生物制药公司的早期研究阶段和表征环境中应用后，便逐渐进入下游 QA/QC 环境中。

前沿方向

多属性方法 ( MAM ) 是 CQA 监测的一个备受关注的方向，因为可将多达六种分析方法整合到一种 LC/MS/MS 方法中。除了上述肽谱分析讨论中提到的 PTM 外，它还可以用于测量工艺杂质，如宿主细胞蛋白质。虽然高分辨质谱仪可能具有需要投资和大量的专业知识的缺点，但通过单次分析鉴定蛋白质、测量序列变异、片段、电荷异构体、糖链、其他 PTM 和工艺杂质可节省时间和成本，因此是一个值得关注的机会。

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本文仅限研究使用。不可用于诊断目的 。