使用 UHPLC 和荧光检测对单克隆抗体 和其他糖蛋白的 N-糖链进行分析——配备 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱的 Agilent 1290 Infinity 二元液相色谱系统

摘要

本文描述了使用配备 Agilent 1260 Infinity 荧光检测器和 Agilent 6530 精确质量 Q-TOFLC/MS 的 Agilent 1290 Infinity 二元液相色谱系统，通过亲水相互作用色谱 (HILLC) 对N-连接糖链的分析。使用 PNGase F 对单克隆抗体 (mAb) 及两种其他糖蛋白（胎球蛋白和卵清蛋白）进行酶解后，再利用 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 对释放所得的糖链进行衍生化反应。Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱具有的出色分离度使我们可以对 mAb 样品中所有主要的 N-糖链进行检测和鉴定。此外，从胎球蛋白和卵清蛋白中释放出的多种高度复杂的 N-糖链可以得到良好分离。

前言

糖基化是一种最为常见的翻译后修饰。哺乳动物糖蛋白包括三种主要类型的糖链：即由一个或多个单糖单元构成的 N-连接糖链、O-连接糖链以及糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 脂锚。单个糖基化位点即可使糖蛋白质量和电荷数产生可观的异质性。这些低聚糖参与许多生物调节和识别过程，例如蛋白质分选、免疫及受体识别、炎症、致病性、新陈代谢及其他细胞过程。此外，治疗性蛋白的安全性、有效性和血清半衰期等特性也会受到其糖基化模式的影响。

重组单克隆抗体治疗药物 (mAb) 是最大的一类治疗性蛋白药物。此类治疗性药物的有效性高度依赖于 mAb 正确的糖基化模式，且迄今为止，所有批准的治疗性 mAb 均为免疫球蛋白 G (IgG)。人 IgG 有一个单独的保守 N-连接糖基化位点，位于每条重链 Fc 区域的 Asn297（图 1），这使得每个 IgG 上存在两条 N-糖链。它通常包含少量主结构和众多细微结构。再加上 Fc 段中这两个糖基化位点上不同糖链的组合，导致每批 mAb 产品中包含大量不同的糖型。

糖链的结构在补体激活和受体亲和性上发挥着至关重要的作用，可影响治疗性 mAb 的有效性。此外，非人类来源的糖链还存在安全性问题，因为它们会引发免疫反应。因此，糖基化模式分析是表征治疗性糖蛋白（尤其是 mAb）的一个重要部分。

本文依照美国功能性糖组学协会 (CFG) 的规定使用符号式糖链结构，如图 2 所示。归属的糖链也采用 Oxford 糖链命名法和另一种风格的命名法来描述，后者对于 mAb 糖链更常见。

图 2A 中展示了用于描述蛋白质不同糖链结构的糖残基的一般命名法。图 2B 中展示了出现在人 IgG Asn-297 位点上的一些主要糖链结构。通常 N-糖链有一个核心结构，包括两个 b-D-N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNac) 及三个甘露糖 (Man) 单元。IgG Fc N-糖链主要为二分支复合型结构，部分经核心岩藻糖糖基化（例如 FA2 或 G0F）。

关于 N-糖链分析，已有一些不同的方法策略。多数方法均基于通过 PNGase F 对蛋白质 N-糖链的酶促释放。由于缺乏内在发色团，分析前通常还会使用荧光标记物对糖链进行衍生化。每个 N-糖链包含一个可以与过量荧光标记物反应的还原端位点，因此每条 N-糖链将与一个荧光基团连接。因此，处理后的样品即适用于通过分离和荧光检测的相对定量分析，无需任何定量标样或校准步骤。2-AB 是一种稳定的中性标记物，常用于 N-糖链的分析。图 3 说明了 2-AB 通过还原胺化反应进行标记（希夫碱中间体未展示）。

后续的纯化过程采用亲水相互作用色谱/固相萃取 (HILIC/SPE) 法以去除大量过量的 2-AB，从而不对 HILIC/FLD 分析产生干扰。

本文中，我们描述了通过 PNGase F 对 N-糖链进行酶促释放，并在采用 HILIC UHPLC 分离前使用 2-AB 进行衍生化反应，以及采用荧光检测和通过在线四极杆飞行时间质谱(Q-TOF/MS) 进行鉴定。

结论

Agilent 1290 Infinity 二元液相色谱系统与 Agilent 1260 Infinity 荧光检测器和 Agilent 6530 精确质量 Q-TOF LC/MS 系统联用是分析 2-氨基苯甲酰胺衍生的 N-糖链样品的理想组合。本实验对一种单克隆抗体和其他两种糖蛋白样品使用 PNGase F 进行样品前处理以释放 N-连接糖链，然后利用 2-AB 进行衍生化，再进行 HILIC 样品纯化。

Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱具有优异的分离能力，可以实现大鼠 mAb 样品中所有主要 N-糖链的分离和鉴定。这款色谱柱还可对胎球蛋白和卵清蛋白复杂的二分支和三分支 N-糖链进行分析，表现出极高分离度。经优化的 260 和 430 nm 的荧光激发和发射波长实现了更高的信噪比。根据样品的复杂性，电喷雾离子化 Q-TOF MS 分析能够归属不同的糖链结构或确定其单糖组成。