Agilent 6545 Q-TOF 液质联用系统

在锂电池研发过程中，需要对未知有机物进行定性分析。比如在循环性能研究中，对电池循环后电解液中产生的未知化合物进行分析，这些化合物可能对锂电池性能产生影响。安捷伦推荐采用 LC/Q-TOF 或 GC/Q-TOF 对未知化合物进行精确定性分析

作为“使用 Agilent 6495 三重四极杆质谱仪检测水中的药物和个人护理用品 (PPCP)”应用简报的后续研究，本应用简报介绍了使用 Agilent 6545 Q-TOF LC/MS 系统对水中 ppt 级 PPCP 进行筛查和定量分析的两种方法。同样，由 于这两种方法使用了相同流动相，故将其分为正离子模式和负离子模式。使用针对易碎裂有机小分子优化的 Swarm 调谐参数，通过 6545 Q-TOF LC/MS 系统分别在正离子和负离子模式下对 118 和 22 种化合物实现了精准的筛查 和定量。选择高灵敏度限幅器模式以最大程度提高仪器灵敏度。无需进行固 相萃取 (SPE) 等繁琐的富集流程，即可检测出大多数 PPCP 组分。样品前处 理过程包括过滤约 3 mL 样品、向 1.0 mL 过滤后的样品中加入内标，以及将 40 μL 样品进样至 Q-TOF LC/MS 进行分析，大多数分析物的报告限为 10 ppt。 多数分析物的检测限 (LOD) 和定量下限 (LLOQ) 远低于 10 ppt。

As a follow up to the Application Note on detection of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in water using the Agilent 6495 Triple Quadrupole Mass Spectrometer 8 , this Application Note describes two methods to screen and quantitate PPCPs in water at part per trillion (ppt) levels using the Agilent 6545 Q - TOF LC/ MS System. Similarly, the methods were divided into positive ion mode and negative ion mode due to the unique mobile phases used for the two methods. The precise and accurate screening and quantitation of 118 compounds in positive ion mode and 22 compou nds in negative mode was accomplished on the 6545 Q - TOF LC/MS using the Swarm tune parameters optimized for small fragile organic molecules. The high sensitivity slicer mode was selected to maximize instrument sensitivity. Most of the PPCPs could be det ected without tedious analyte enrichment such as solid phase extraction (SPE). The extent of sample preparation included filtering approximately 3 mL of sample, adding internal standards to a 1.0 mL aliquot of the filtered sample, and injecting 40 μL of sample for analysis by Q - TOF LC/MS with reporting limits for the majority of analytes at 10 ppt. The limit of detection (LOD) and lower limit of quantitation (LLOQ) for most of the analytes are much lower than 10 ppt

本应用介绍了一种利用 Agilent 1290 Infinity Ⅱ 全二维液相色谱系统结合 Agilent 6545 四极杆飞行时间液质联用 (Q-TOF) 系统，对中药舒筋活血制剂中的化学物质基础进行系统表征分析的方法。为充分扩大第一维和第二维的分离选择性差异，选择氰基柱 (CN) 结合甲醇的流动相体系作为第一维的主要分离条件，并选择极性嵌入反相柱 (Bonus-RP) 结合乙腈流动相体系作为第二维分离条件。根据第一维流速和定量环体积大小，确定第二维梯度时间和调制时间，并对第二维的从动梯度进行优化。结果表明，本文所构建的全二维分析方法的峰容量得到显著提升，在 UV 277 nm 下共检测到 268 个比较明显的斑点；在质谱中共检测到 493 个斑点。结合 PCDL 数据库，对主要斑点进行了鉴定。利用本文所述在线全二维液质联用方法，可以更有效地对中药复杂体系的化学物质基础进行系统表征分析。

本应用展示了在 7100 毛细管电泳仪和 TOF/Q-TOF 质谱仪上进行的全自动在线 CIEF-MS 方法。使用电动泵送鞘流溶液纳米喷雾 CE/MS 联用技术实现该 CIEF-MS 工作流程。碱性蛋白和单克隆抗体的 CZE-MS 结果以及达雷木单抗电荷异构体分析的 CIEF-MS 结果表明，EMASS-II CE/MS 离子源在安捷伦系统上具有出色的性能。还提供了 CEIF-MS 方法的详细信息，包括毛细管性能验证和系统性能检查。在此 Agilent-CMP CIEF-MS工作流程中，对于通过毛细管等电聚焦分离得到的完整 mAb 电荷异构体，可以直接进行质谱鉴定。

分析与活性药物成分 (API) 有关的低浓度杂质对原料药的质量控制来说至关重要。当杂质与 API 的化学结构相似且浓度差异较大时，色谱分离与检测将变得困难。 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案可实现全二维液相色谱 (LC × LC)、多中心切割二维液相色谱 (MHC) 以及高分辨率采样二维液相色谱 (HiRes 2D-LC) 之间的轻松切换。在本应用简报中，使用高分辨率采样二维液相色谱实现两种紧邻洗脱的化合物的分离，其中一种化合物浓度极低且隐藏在其他高浓度化合物峰下。以氯二氟苯甲酸和脱酰胺胰岛素分别作为标准物质和实际样品进行分析。

分析与活性药物成分 (API) 有关的低浓度杂质对原料药的质量控制来说至关重要。当杂质与 API 的化学结构相似且浓度差异较大时，色谱分离与检测将变得困难。 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案可实现全二维液相色谱 (LC × LC)、多中心切割二维液相色谱 (MHC) 以及高分辨率采样二维液相色谱 (HiRes 2D-LC) 之间的轻松切换。在本应用简报中，使用高分辨率采样二维液相色谱实现两种紧邻洗脱的化合物的分离，其中一种化合物浓度极低且隐藏在其他高浓度化合物峰下。以氯二氟苯甲酸和脱酰胺胰岛素分别作为标准物质和实际样品进行分析。

肽谱分析是表征生物治疗蛋白质不可或缺的工具，该方法广泛运用于生物药物蛋白质的生产过程，以确保产品在各生产阶段的完整性和稳定性。利用 LC/MS 进行肽谱分析是表征肽段修饰的首选技术。稳定且重现性高的 LC/MS 方法，是成功实现肽谱分析分离的关键。因此，需要对 LC/MS 分离参数进行全面的研究。分析复杂蛋白质酶解物的过程中，如何实现肽段的高效、高分离度分离是一项巨大的挑战。甲酸是一种兼容质谱的离子对试剂，常用于 LC/MS 方法中，可实现灵敏检测。然而，甲酸也会导致峰形展宽，从而使肽段发生共洗脱。除此之外，流动相含甲酸的现有 LC/MS 方法具有峰容量小、峰展宽以及对相似肽段分离度差的限制。选择正确的反相色谱柱和 LC/MS 方法，对肽谱分离的成功十分重要。Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱专为高效的肽段分离而设计。HPH Poroshell 填料包覆了一层带正电荷的改性表面基团。采用 C18 配基的表面多孔颗粒填料表面带电，可改善峰形并提高峰容量。最佳孔径 (120 Å) 和粒径 (2.7 μm) 能够以低色谱柱反压提供类似 UHPLC 的性能。AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱还可以与含甲酸的流动相兼容，在与质谱联用时可提供出色的峰形。 ?本应用简报展示了 AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱在用含甲酸的流动相对单克隆抗体 (mAb) 进行肽谱分离时显示出的卓越性能。本文通过研究流速、梯度时间和温度等不同的填料影响因素，开发出了实现最佳肽段分离的 LC/MS 方法。并对峰容量、峰宽、峰面积、峰高、重现性和序列覆盖率等肽谱分析的关键要素进行了评价。

单克隆抗体 (mAb) 型药物代表了发展迅速的一类生物药物，对这类药物需要进行深入表征，以便获得临床试验和后续上市的批准。鉴于单克隆抗体具有分子量大及存在翻译后修饰（糖基化）的特征，精确质量数测定是单克隆抗体分析表征中最具挑战性的步骤。这些特性也使得修饰位置的测定更加复杂。 ?为了应对抗体质量数测定相关的挑战，人们使用了大量补充方法。可以用 PNGase F 处理抗体去除 N-糖链，后用 IdeS 等蛋白酶酶解获得抗体片段，也可还原单克隆抗体，以生成轻链和重链，随后进行质量数测定。这些技术可以各种组合加以应用。样品前处理可能费时费力，而且重现性不佳。本应用简报展示了如何使用 Agilent AssayMAP Bravo 的自动化功能简化这些方法，减少引入人为误差的可能性，提高重现性，并实现更长的无人值守时间。

开发了一种结合多种方法的创新靶向代谢组学策略，通过考虑中心 碳代谢、能量代谢、核酸代谢和氨基酸的峰形、分离以及代谢物覆盖度，以覆盖体液、 组织或生物来源的培养细胞系中的数百种代谢物，从而提高分析性能。采用了全 新的解决方案分析差异化生物样品，如本研究中展示的骨髓来源巨噬细胞 (BMDM) 或基 因敲除肝癌细胞小鼠模型的结果

为了在分析中实现对多种常见内源性代谢物类别的全面覆盖，开发了高 pH 和低 pH亲水相互作用色谱 (HILIC) 法。这些方法适用于高分辨率的精确质量数 LC/Q-TOF 质谱仪 (MS)。靶向代谢物类别包括维生素、氨基酸、聚胺、糖、磷酸糖、有机酸、核苷酸和辅酶 A (CoA) 衍生物。对液相色谱梯度和离子源进行了系统优化，以获得良好的异构体色谱分离效果，并获得所研究的所有代谢物类别的最佳信号响应。为验证此方法的稳定性，使用 HILIC LC/Q-TOF MS 方法运行 25 小时对酵母提取物进行了评估。

安捷伦的 AdvanceBio 色谱柱能够让您的生物技术实验室更轻松地分析用过的细胞培养基中的氨基酸和其他小分子代谢物，无论样品是否经过衍生化处理。用氨基酸对用于这两种解决方案的色谱柱进行测试，以确保其质量和性能。您只需选择满足您需求的工作流程。

通过测量生物基质中的脂质追踪其对疾病、药物、基因修饰和其他刺激因素的响应，需要采用具有较高分辨率、质量精度和灵敏度的四极杆飞行时间液质联用系统。 本应用采用 6545 Q-TOF 和 1290 Infinity 液相色谱系统分析来自慢性阻塞性肺病 (COPD) 患者的诱导痰脂质提取物。6545 Q-TOF 系统利用全新 Swarm 自动调谐功能进行调谐，可在脂质的 m/z 范围内获得最佳性能，并在具有参比质量校正功能的正负离子化模式下采集数据。

本应用简报介绍了发酵培养基中氨基酸 LC/MS 分析的解决方案。氨基酸的极性使其 难以进行反相液相色谱分析，因此通常使用衍生化来改善其保留能力。然而，亲水 相互作用色谱 (HILIC) 无需衍生化也能保留并分离复杂的氨基酸混合物，同时还具有与传统反相液相色谱类似的工作流程。HILIC 与质谱的组合提供了一种极其简单而功 能强大的未衍生化氨基酸分析解决方案。

Metabolomics allows researchers to interrogate thousands of potential biomarkers simultaneously, without a priori knowledge of the underlying biology or pathophysiology. Due to the complexity of the samples, people need outstanding mass resolution, mass accuracy, and sensitivity as well as sophisticated data analysis software. Agilent 6545 Q - TOF LC/MS system and Agilent MassHunter software are the perfect combination to fulfill the requirements. In this application, serum extracts from healthy subjects and samples with chronic kidney disease (CKD) at stage 3 and stage 5 are analyzed with 6545 LC/Q - TOF and 1290 Infinity LC system. The mass s pectrometer is tuned using the novel Swarm Autotune for optimal performance in the m/z range of the metabolites. Data was acquired in both positive and negative ionization modes with reference mass correction. The typical metabolomics workflow is ill ustrated here. Big sensitivity gains improve results The improved sensitivity of the 6545 Q - TOF LC/MS enables us to extract 5,817 features as opposed to 2,102 features on the previous generation of Q - TOF under the same column load in positive ionization mode. Even with a five - fold reduction of column load, we are still able to extract 2,489 features.

The measurement of lipids in a biological matrix to study their responses to diseases, drugs, genetic modifications, and other stimuli requires a Q - TOF system with outstanding resolution, mass accuracy, and sensitivity. In this application, the 6545 Q - TOF and 1290 Infinity LC system are used to analyze an induced sputum lipid extract from a donor with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). T he 6545 Q - TOF is tuned by novel Swarm Autotune for optimal performance in the m/z range of the lipids, and data acquired in both positive and negative ionization modes with reference mass correction

糖基化广泛存在于植物的一系列生物过程中，并被认为对人体健康有益，但是有关这一生物过程的研究有限，其主要原因在于缺乏有效的分析方法鉴定植物中丰富多样的糖基化代谢物。本应用简报介绍了 Dai 等人最近报道的一种研究茶叶 (Camellia Sinensis L.) 中糖基化过程的非靶向特异性修饰代谢组学方法。将安捷伦超高效液相色谱 (UHPLC) 与高分辨率四极杆飞行时间质谱 (Q-TOF/MS) 结合使用，在全离子源内碎裂模式下对绿茶进行分析。利用实验室定制的工作流程对采集的数据进行处理，基于特定糖基化修饰的特征性中性丢失模式，选择性地提取与糖基化相关的化合物。直接在数据库中搜索糖基化代谢物或相应的底物，进一步鉴定这些化合物。借助这一策略，同时检测出 202 种糖基化代谢物，包括葡糖基化/半乳糖基化、鼠李糖基化、芦丁糖基化和樱草糖基化，其中在绿茶浸泡液中推断鉴定出 68 种糖基化代谢物。基于 MS/MS 谱图，初步解析出另外 44 种新型糖基化代谢物。此方法使用户能够分析、发现和鉴定植物样品中的新型糖基化代谢物。所述工作流程大大拓展了糖基化代谢物的鉴定范围，并提高了对未知代谢物进行结构解析的能力。该方法可以进一步扩展以分析植物中许多其他重要的修饰。

本应用通过基于 UHPLC-Q-TOF/MS 的非靶向代谢组学分析方法探讨了白茶中非挥发性化合物对茶叶风味特征的影响。使用 UHPLC-Q-TOF/MS 分析茶叶的提取物，然后进行特征化合物的提取和比对，得到 1915 种化合物。基于这些化合物的主成分分析 (PCA) 和有监督的偏最小二乘差异分析 (PLSDA) 表明，三种不同品质白茶样品可以很好地分离。通过与标准品和数据库进行匹配，鉴定出多达 99 种代谢物。经由显著性检验和相关性分析发现，有显著差异的代谢物中有 41 种与风味高度相关；其中，茶氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和 AMP 与鲜味呈正相关，而黄烷-3-醇、聚酯型儿茶素、原花青素 B3 和可可碱与苦味和涩味呈正相关。结果表明，代谢组学技术是一种有效的发现茶叶中特征代谢物的手段，这些特征代谢物有望作为潜在标记物用来区分不同品质的白茶，以应对人为掺假和标签错贴的现象。

本应用介绍了一种代谢组学方法，用于分析白茶中的非挥发性化合物，从而寻找白茶陈化的可能化学标记物。研究采用 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱仪与Agilent 6540/6545 Q-TOF LC/MS 进行原始数据的采集，然后对数据进行提取和统计分析。本应用采用安捷伦的 MPP 软件作为主要的化学计量学软件进行数据统计分析。结果表明，随着陈化时间的延长，白茶中的某些化合物发生了显著变化，初步鉴定得到 125 种此类差异化合物。在这些初步鉴定得到的化合物中，有 7 种是储存过程中产生的新化合物，被鉴定为 8-C N-乙基-2-吡咯烷酮取代的黄烷-3-醇 (EPSF)。EPSF 的含量随着储存时间的延长而增高，其前体物质茶氨酸和黄烷-3-醇的含量则随之减小，表明 EPSF 可能为长期储存白茶中的标记化合物。

脂质组学属于新兴研究领域，其核心工作是生物系统中各种脂类物质的表征和定量分析。质谱法是否能够成功检测和鉴定出给定样品中的数千种潜在脂质，将直接取决于脂质液相色谱分离的策略。 肝脏、脑、心脏组织提取物是脂质组学研究中常见的生物样品。为证明色谱对脂质组学分析的影响，本应用简报以肝脏组织提取物为例，总结了使用反相 (RP) 和正相 (NP) 色谱分离不同类型脂质的优势。 本研究工作采用 Agilent UHPLC 1290 系统（包括二元泵、多孔板自动进样器和柱温箱）进行。液相色谱通过安捷伦喷射流接口与 Agilent 6540 Q-TOF 联用。采用反相和正相色谱两种方法分离组织提取物。

啤酒是一种成分非常复杂的酒精饮料，以水、大麦芽或小麦芽为主要原料，并添加啤酒花酿造而成。啤酒花中的 a-酸在麦汁煮沸的过程中形成异-a-酸，异-a-酸是啤酒典型苦味的主要来源。本应用简报展示了使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案对不同类型的啤酒进行全二维液相色谱分析。分别在第一维碱性与第二维酸性 pH 值条件下使用 C18 色谱柱获得了良好的正交性。通过与标准物质进行对比分析及质谱检测，鉴定出啤酒中的苦味化合物。非靶向多样品分析（指纹图谱分析）能够对所分析的不同啤酒类型进行分类。

食品掺假和标签虚假行为可能会给消费者带来潜在健康风险并造成信任危机，对于高档葡萄酒产品而言尤其如此。目前的分析方法和防伪标签技术不足以确定这类产品的身份信息和原产地。本应用简报介绍了一种基于 Liang 等人的研究开发的追踪葡萄酒产品原产地的代谢组学分析方法。参比赤霞珠葡萄酒来自五家酒庄（两家为美国酒庄，三家为中国酒庄），并使用安捷伦 UHPLC-Q-TOF/MS 平台在准确的 TOF/MS 扫描模式下进行了初步分析。所得原始数据通过分子特征查找提取方法进行了数据挖掘。将结果导入 Agilent Mass Profiler Professional (MPP) 化学计量学软件，以在各组之间查找特征化合物。所得差异化合物的主成分分析和聚类分析显示了该系统区分两组美国葡萄酒与中国产葡萄酒的能力。基于这些数据的偏最小二乘差异分析 (PLSDA) 模型能够高度准确地预测葡萄酒组别。通过使用针对葡萄酒的自定义多酚类化合物数据库和谱库以及其他可用的安捷伦 PCDL，我们对 23 种化合物进行了初步鉴定，其中大多数为葡萄中的内源性代谢物，表明在不同原产地的葡萄酒中，葡萄代谢物是区别葡萄酒主要特征的决定因素。本研究证明采用 UHPLC-Q-TOF/MS 结合化学计量学分析的代谢物组学分析方法是追踪葡萄酒原产地的有用方法。

本应用介绍了一种新型固相萃取 (SPE) 方法，该方法使用 Agilent Bond Elut LipidExtraction 1 mL 小柱进行人血浆脂质组学样品前处理。蛋白质沉淀后，将血浆样品匀浆上样至萃取柱进行重力洗脱。使用 90:10 乙腈/水清洗，然后用 1:1 氯仿/甲醇洗脱脂质。在 Agilent 6545 LC/Q-TOF 上运行萃取样品，并用 Agilent MassHunterLipid Annotator 软件进行脂质分析。在人血浆样品中共检测并鉴定出 595 种脂类化合物，其中使用正离子模式方法的有 13 类 347 种，使用负离子模式方法的有 9 类248 种。方法具有优异的重现性，在不同测试中，3 次以上平行测量的 RSD 小于10%。与传统液液萃取 (LLE) 方法相比，Bond Elut Lipid Extraction SPE 方法节省了时间和精力，降低了溶剂用量，减少了样品转移步骤，提高了重现性和自动化的可行性。

生物类黄酮槲皮素在食品中以一系列糖苷形式存在，而这些糖苷的组成具有物种及栽培品种特异性。在人体内，槲皮素经过广泛的II 相生物转化，最终形成一系列代谢物的复杂混合物，其中每种代谢物的生物活性取决于生物转化过程中所形成偶联物的类型和位置。本文应用Agilent 1290 UHPLC 联合Agilent 6530 精确质量Q-TOF LC/MS，对食用添加微粒化苹果皮(AP) 或洋葱粉(OP) 的苹果酱后人血浆中的各槲皮素代谢物进行鉴定并测定相对含量，AP 及OP 标准化后相当于100 mg 总槲皮素糖苷。然后利用包含II 相生物转化反应中槲皮素相关产物的定制安捷伦个人化合物数据库和谱库(PCDL) 以及 Agilent MassHunter 定性分析软件对代谢物进行鉴定。最后通过Q-TOF MS/MS 碎片数据和Agilent MassHunter 分子结构关联(MSC) 软件确认所鉴定代谢物的结构。

This Application Note describes the seamless integration of a high sensitivity Agilent LC/Q-TOF instrument with software tools (Mass MetaSite software) for the identifi cation of drug metabolites. Mass MetaSite can predict metabolic transformations, estimate the primary site of metabolism, and assign the structures of metabolites from accurate mass MS/MS data. The workfl ow is demonstrated by predicting and identifying primary metabolites from rat hepatocyte incubation of warfarin for 24 hours.