Agilent 6545XT Q-TOF 液质联用系统

本文展示了一套用于同时鉴定和定量分析 mAb 的化学诱导脱酰胺基化和氧化的完整工作流程，包括使用 AssayMAP Bravo 平台进行自动化样品前处理，使用 1290 Infinity II 液相色谱仪进行液相色谱分离，使用 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 进行数据采集，以及使用MassHunter BioConfirm 软件进行数据分析。MassHunter BioConfirm 10.0 软件能够：1)自动进行数据批处理2)使用统计得分和 FDR 进行肽段谱图匹配 3)将结果表通过链接导航链接到质谱图和色谱图 4)进行 PTM 定量分析。上述功能组合提升了蛋白类生物治疗药物开发和生产过程中肽谱分析和 PTM 定量分析工作流程的效率。

本研究利用安捷伦1290 Infinity 液相色谱/6540 精确质量数Q-TOF 液质联用系统测定分析水样中磺胺类抗生素和合成代谢类固醇的高分辨率和高质量精度。首次在四极杆-飞行时间质谱仪上，用高分辨（> 20000 FWHM）进行了符合欧盟关于禁用药物的鉴定点要求的分析。

利用Agilent 6540 Q-TOF LC/MS 和Agilent Mass Profiler Professional 软件(MPP) 灵敏地表征城市污水中复杂的化学成分。通过MPP 多变量统计分析软件包对Q-TOF 高分辨质谱数据进行处理，揭示了在污水处理过程中有机化学品分布类型的变化。利用这项技术能够测定循环水臭氧化过程中哪些有机污染物会减少、反弹和形成。MPP 的热图提供了分布图，可用来评估水质的细微变化并鉴别特定水源或处理过程中特有的新兴污染物。

为满足对环境中新兴污染物的检测和鉴定需求，要求采用一种全新的环境筛查方法，该 方法采用精确质量数 LC/MS 进行分析并通过统计软件包进行严格的数据分析。该方法 使用配备 Agilent MassHunter Profiler 软件的 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS 系 统研究从水处理厂上游与下游采集的河水样品。如果污染物存在于下游而不存在于上游， 则表明发生了污染。从下游水样数据中提取出这些污染物的数据，并将其提交至精确质 量数据库和谱库中以进行鉴定。最终在下游样品中检出了 890 种化合物，并对其中的 21 种实现了成功鉴定。

使用安捷伦四极杆飞行时间质谱仪和软件工具能够鉴定和表征水源中浓度低至万亿分之 一(ppt) 级别的100 多种药物及其代谢物，包括那些使用其他方法很难区分开的同重化合 物以及同分异构体。

A combination of UHPLC followed by LC/Q-TOF-MS was used to detect suites of polyethylene glycol compounds (PEGs) that occur in flowback water samples from hydraulic fracturing. The Kendrick Mass Defect was applied to differentiate the various adducts within a suite of PEGs. A database of the accurate masses along with their retention times by UHPLC has been designed to enable rapid and accurate analysis of either groundwater or flowback samples from hydraulic fracturing. Forty PEGs and their various adducts and multiply-charged ions can be identified in less than 2 minutes of computer time.

在本研究中，使用 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱并以甲酸作为流动相改性剂来分析合成肽及其杂质。采用的方法可以在 LC/UV 和 LC/MS 之间轻松转移。

生物仿制药的开发和生产需要与创新生物治疗产品进行可比性研究。本应用介绍了使用 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 系统对单克隆抗体 (mAb) 生物制剂进行肽谱分析，以评估利妥昔单抗的创新药物与两种生物仿制药之间的相似性和差异性。胰蛋白酶酶解后的 mAb 序列覆盖率 > 97%。液相色谱/质谱联用系统 (LC/MS)肽分离谱图显示了创新药物和生物仿制药 mAb 之间的肽丰度差异，揭示了脱酰胺基化和氧化等不同程度的翻译后修饰 (PTM)。

本应用分析了两种利妥昔单抗生物仿制药的完整质量数、亚基质量数和糖基化，并将它们与创新药物分子进行了比较。我们使用四种不同的工作流程进行分析：(i) 完整 mAb，(ii) 还原态亚基，(iii) IdeS 酶解的亚基，以及 (iv) 游离多聚糖。在这些工作流程中，样品前处理时间各不相同，有的无需样品前处理（完整 mAb），有的需要大约三个小时（游离多聚糖）。包含更多样品前处理步骤的工作流程的优势通常在于对低丰度多聚糖组分具有更高的灵敏度，从而提高了相应技术的分析能力。结果表明，由 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统和 Agilent 6545XT Q-TOF 组成的安捷伦高分辨率 LC/MS 非常适合执行这些分析。此外，利用 AssayMAP Bravo 自动完成游离多聚糖工作流程中的样品前处理，从而减少人为错误并缩短样品前处理时间。标记多聚糖可在小样品量中以高浓度洗脱，无需冗长的干燥步骤。

在您由生物药物发现转向生物药物开发之时，您希望尽可能少出意外。扩大生产不应使风险也相应升高。安捷伦提供的测量工具可让您对于了解生物分子在整个开发过程中的确切状态满怀信心。我们的解决方案提供稳定可靠的分析方法，能确保对生物药物的透彻表征以及向质量控制的顺利转移。

抗体药物偶联物 (ADC) 是制药公司药物开发途径中快速发展的一类新型生物治疗药物。ADC的制备方法是通过化学方法将具有生物活性的小分子药物与单克隆抗体相连。ADC 通过结合高效细胞毒性药物与靶标特异性抗体将细胞毒性药物直接送达病变组织，同时限制药物在非目标组织中的毒性。 药物/抗体比率 (DAR) 是抗体所连接药物数量的平均值，它是 ADC 的重要属性。由于低载药量会降低效力，而高载药量则会对药代动力学 (PK) 和毒性产生负面影响，因此 DAR 值能够对药效产生影响。目前的偶联化学方法有赖氨酸侧链酰胺化或半胱氨酸链间二硫键还原，载药量通常为 0 ~ 8 个药物分子 (D0 ~ D8)/抗体。

生物药物（如单克隆抗体 (mAb)）的使用正在快速增加。生物药物为生物来源，因此即使经过多个纯化步骤，最终产品中仍然可能残留一些低浓度宿主细胞蛋白质 (HCP)。由于它们可能影响产品安全性和功效，因此根据法规要求必须对药品中的 HCP 浓度进行监测和控制。传统上，酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 是定量分析蛋白质治疗药物中 HCP 的标准方法。然而，ELISA 的特异性和覆盖率不足以鉴定并定量分析各种 HCP。因此，LC/MS 技术成为 HCP 分析的选择之一。在 HCP 的 LC/MS 分析过程中，主要挑战在于低丰度 HCP 肽段与高丰度药品肽段的共洗脱。这要求 LC/MS 系统具有更出色的肽段分离度以及宽动态范围。

基于多属性方法 (MAM) 的 LC/MS 肽谱分析在生物制药分析领域受到了广泛的关注。本应用展示了使用 LC/MS 肽谱分析方法对不同单克隆抗体 (mAb) 的关键质量属性 (CQAs) 进行的表征和定量分析。将肽谱分析结果与传统方法进行了比较，结果表明，肽谱分析与传统方法对赖氨酸截短、氧化、脱酰氨基化、N 端环化和糖基化程度的估算高度相似。

单克隆抗体 (mAb) 型药物代表了发展迅速的一类生物药物，对这类药物需要进行深入表征，以便获得临床试验和后续上市的批准。鉴于单克隆抗体具有分子量大及存在翻译后修饰（糖基化）的特征，精确质量数测定是单克隆抗体分析表征中最具挑战性的步骤。这些特性也使得修饰位置的测定更加复杂。 为了应对抗体质量数测定相关的挑战，人们使用了大量补充方法。可以用 PNGase F 处理抗体去除 N-糖链，后用 IdeS 等蛋白酶酶解获得抗体片段，也可还原单克隆抗体，以生成轻链和重链，随后进行质量数测定。这些技术可以各种组合加以应用。样品前处理可能费时费力，而且重现性不佳。本应用简报展示了如何使用 Agilent AssayMAP Bravo 的自动化功能简化这些方法，减少引入人为误差的可能性，提高重现性，并实现更长的无人值守时间。

单克隆抗体 (mAb) 及其衍生物包含一类非常重要的生物分子，它们具有广泛的应用。由于 mAb 的异质性，必须对此类生物分子进行全面的分析表征。分析包括测定 mAb 及其异构体的完整氨基酸序列，以及糖基化、氧化和脱酰氨基化等翻译后修饰 (PTM) 的表征。 糖基化在许多生物过程中起着重要的作用。它还会对治疗效果、稳定性、药代动力学和免疫原性产生影响。糖链表征通常会涉及到 NMR、HPLC 或质谱 (MS) 等技术。由于糖链在组成和结构方面十分多样，并且很难采用电喷雾电离，因此基于质谱方法的糖链表征具有挑战性。InstantPC 是一种 ProZyme Inc. 推出的新型荧光标签，已开发用于改善 N-糖链分子的 MS 电离效果和检测灵敏度。

本文将评价精确质量四极杆-飞行时间液质联用系统(Q-TOF LC/MS) 和MS/MS 系统在 正负电喷雾离子化(ESI) 模式下对水中三氯蔗糖的鉴定。研究其响应和碎裂途径。Q-TOF LC/MS 系统在ESI 正离子或负离子模式下对三氯蔗糖具有良好的响应。正离子模式下获 得的整体信号强度大约是负离子模式下的两倍。 在正离子模式下，三氯蔗糖以其钠加合物[M+Na]+ 的形式在m/z 419.0038 处检出。通过 精确质量MS/MS 测量提供所获得的钠加合碎片离子（m/z 221.0187 和m/z 238.9848） 的结构信息。在负离子模式下观察到去质子化分子（m/z 395.0073 处的[M−H]−）。通 过MS/MS 碎裂产生一个特征碎片离子(m/z 359.0306)。使用Agilent MassHunter 分 子结构关联(MSC) 软件绘制和研究正负离子MS/MS 分析的碎裂途径。MSC 软件已证 实在辅助碎片离子结构的表征上是一个有效工具。