Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio 超高效液相色谱

流动相体系简单，于液相系统更加友好。 15种防晒剂实现了完全分离，尤其改善了在 传统HPLC方法上分离度不够的苯基苯并咪 唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸三种防晒剂 的分离。 Empower 3色谱管理软件，具有完美的法 规依从性，能够快速得到分离度的定量的标 准曲线。

流动相体系简单，于液相系统更加友好。 15种防晒剂实现了完全分离，尤其改善了在 传统HPLC方法上分离度不够的苯基苯并咪 唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸三种防晒剂 的分离。 Empower 3色谱管理软件，具有完美的法 规依从性，能够快速得到分离度的定量的标 准曲线。

流动相体系简单，于液相系统更加友好。 15种防晒剂实现了完全分离，尤其改善了在 传统HPLC方法上分离度不够的苯基苯并咪 唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸三种防晒剂 的分离。 Empower 3色谱管理软件，具有完美的法 规依从性，能够快速得到分离度的定量的标 准曲线。

流动相体系简单，于液相系统更加友好。 15种防晒剂实现了完全分离，尤其改善了在 传统HPLC方法上分离度不够的苯基苯并咪 唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸三种防晒剂 的分离。 Empower 3色谱管理软件，具有完美的法 规依从性，能够快速得到分离度的定量的标 准曲线。

流动相体系简单，于液相系统更加友好。 15种防晒剂实现了完全分离，尤其改善了在 传统HPLC方法上分离度不够的苯基苯并咪 唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸三种防晒剂 的分离。 Empower 3色谱管理软件，具有完美的法 规依从性，能够快速得到分离度的定量的标 准曲线。

流动相体系简单，于液相系统更加友好。 15种防晒剂实现了完全分离，尤其改善了在 传统HPLC方法上分离度不够的苯基苯并咪 唑磺酸、二苯酮、对氨基苯甲酸三种防晒剂 的分离。 Empower 3色谱管理软件，具有完美的法 规依从性，能够快速得到分离度的定量的标 准曲线。

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法1。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的， 是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法2。相较于将单体(约150 KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主 要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小 (流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一 步增加。 虽然使用粒径为亚2 µm的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6 mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因SEC粒径为3 µm及以上，可以选择7.8 mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

由于能够有效治疗各种疾病，生物治疗药物已经成为一个快速增长的市场，而生物制药分析需要经济有效并能高效提供稳定结果的分析仪器。要解决成本、效率和稳定性挑战，一种有效的方法是在整个产品生命周期中运用创新技术。作为生物药物开发和生产过程不可缺少的组成部分，液相色谱(LC)平台有望通过技术现代化成为制药质控体系的一部分，用于提高整个制药工艺流程的生产效率。为此，超高效液相色谱(UPLC)仪器已被应用于生物药物开发和生产的各个环节，大幅提高了分析性能、生产效率并降低了成本。随着制药公司为了加速产品上市而不断对LC系统提出更高要求，稳定性更高、停机时间更短的仪器将更具优势。 ACQUITY UPLC PLUS系列专为改善UPLC技术的易操作性而设计，同时可保持与传统ACQUITY UPLC平台(如H-Class和I-Class系统)相当的分析性能。如图1所示，沃特世在现有ACQUITY UPLC系统系列产品的基础之上，对溶剂管理器和样品管理器进行了多项改进。脱气机硬件和固件的改进可以提高分离的重现性，同时最大程度延长系统正常运行时间，而采用全新设计的溶剂管理器则能够改善热敏样品的完整性。此外，进样针外表面经过专门处理，扩展了针的兼容性，使其不仅能与更多种样品瓶盖和孔板盖配合使用，还显著改善了残留性能。这些系统改进是专门设计的，目的是让ACQUITY UPLC PLUS系列保持与它们将要替代的ACQUITY UPLC系列相同的系统延迟体积和扩散特性，从而确保两个平台具有相同的分离性能。综上所述，ACQUITY UPLC PLUS系列产品极大改善了用户体验，能够最大限度延长系统正常运行时间，让分析人员安心无忧，同时确保运行已有方法时可获得与原系统相当的性能。

1）无孔聚合物颗粒，可最大程度降低分析物 谱带展宽，改善mAb分离度 2）采用最佳的磺酸基配体和亲水表面填料，获得 卓越的回收率、峰形和分离度 3）采用3 µm粒径，柱压较低，适用于UPLC™、 UHPLC或HPLC系统

综上所述，BioResolve RP色谱柱可协助色谱工作者提高分析通量和改善分离度，还有助于他们探索温度更低、MS兼容性更好的色谱条件。

本研究使用新型反相色谱柱来解决这些问题，以期改善抗体偶联药物的表征分析。在此之前，已有研究表明,抗体偶联药物因含有疏水性极强的Fd'亚基(负载数为3)而更加难以进行有效分析。

本文将介绍新上市的生物兼容性UHPLC平台如何为改进产品生命周期管理提供支持，展示该系统在这方面的优势。

本研究开发了一种能够高效分离完整抗体的反相分离方法，该方法充分利用了BioResolve RP色谱柱专为这类应用而设计的各项特性。BioResolve RP色谱柱中填充有经过优化的硅基实心核颗粒，这些颗粒被具有450 Å孔径的创新多苯键合相多孔涂层包裹，有效提高了完整抗体分离的效率和选择性。与目前业内先进的多孔和非多孔色谱柱相比，这种色谱柱在分离度、峰宽、峰形和残留方面的性能均有所提升。文中所示的数据表明，与传统的RP色谱柱相比，BioResolve RP色谱柱所得的峰宽窄20%，残留降低50%，对完整抗体的分离能力大幅提升，是抗体表征和分析的理想工具。

BioResolve RP色谱拥有具体应用所需的特性，有助于改善抗体亚基分离。本研究证明，该色谱柱可用于传统的RPLC-MS方法，提高亚基分析能力。更强的色谱分离能力和经过彻底优化的载样量使得分析人员能够清楚地掌握样品异质性，进而更深入地研究mAb结构及功能。

本文将重点介绍两个独特的LC/MS系统应用方案：完整蛋白质谱分析和肽图分析，用于人源化单克隆抗体（mAb）的确证，检测单抗的细微变化。每一个应用方案都包括整体的工作流程的介绍。 此工作流程具有如下特点：将沃特世的系统方案无缝地整合在一起，包括能够同时提升分离度、灵敏度和分析速度的超高效液相色谱（UPLC®），专用色谱柱，提供灵敏且精确质量的MS，MSE和MS/MS检测的Xevo QTof MS系统和行业领先的生物制药信息学软件。将上述方案在此工作流程中联合使用可极大地提高实验室效率。

Auto•Blend™ Plus技术助力IEX方法开发和稳定性测试。 离子交换色谱(IEX)被广泛用于蛋白质生物治疗药物电荷异构体分析。该技术能够区分带有不同表面电荷的异构体(包括等电点(pI)相同的物质)，还能收集馏分用于进一步分析，因此对生物制药行业来说实用性极强。优化每种蛋白治疗药物的IEX方法时，都需要考量各种参数。智能的方法设置可显著缩短方法开发和稳定性测试所需的时间。 Waters™ Auto•Blend Plus技术可通过混合浓缩溶剂液制备特定pH的流动相，同时控制盐的浓度，优化分离效果。沃特世的四元溶剂输送系统(即ACQUITY ™ UPLC™ H-Class、ACQUITY UPLC H-Class Bio、ACQUITY Arc™和ACQUITY Arc Bio)均采用该技术混合流动相。如图1所示，只需四瓶溶剂(浓缩的酸、碱、盐和水)，系统就能根据pH或盐浓度提供所需的梯度。 本应用纪要展示了Auto•Blend Plus技术对IEX方法开发和稳定性测试的益处。

对具有广泛化学多样性的低浓度化合物进行提取和浓缩。使用单一的LC-MS/MS方法分离和检测PPCP。在亚万亿分之一范围内进行PPCP的定量分析。