雌激素受体ERα的降解是治疗乳腺癌的一种有效策略。然而，耐药性问题限制了其效用，因此有必要开发下一代ERα靶向治疗方法。双特异性降解物（PROTAC）由于可同时结合靶蛋白（POI）和E3连接酶，高效催化靶蛋白的泛素化降解，近年来已成为一项很有前途的药物开发新策略。靶标结合配体的设计是PROTAC开发十分重要的环节。DNA编码化合物文库（DECL）筛选可能是鉴定此类新型配体的最佳选择。在此背景下，美国X-Chem公司在Journal of Medical Chemistry发表了题为Bispecific Estrogen Receptor α Degraders Incorporating Novel Binders Identified Using DNA-Encoded Chemical Library Screening的文章。作者报告了一种新的ERα结合物和拮抗剂筛选流程：通过靶向ERα WT（野生型）和3个功能获得(GOF)突变体，基于DECL技术筛选了约1200亿个DNA编码分子，实现以最少的优化发现一系列新的ERα双特异性降解物（PROTACs）。1DNA编码化合物文库的亲和筛选作者首先对1200亿的DNA化合物文库进行亲和筛选。将44种不同的DNA编码化合物文库组合，分别与无目标物、ERα WT配体结合域LBD（浓度7.7 μM-24 nM）、ERα WT（7.7 μM，含雌二醇15 μM）以及每种ERα突变体D538G、S463P和Y537S（均为7.7 μM）进行孵育。经一系列捕获、洗涤、洗脱、富集后进行测序。在所有44个文库中，共计产生5.28亿个单端reads，每个文库每种选择条件下的平均reads为120万个。2选择输出数据及Hit ID将各个序列reads翻译成对应的构建单元，随后计算各选择条件下、每个库中所有构建单元组合的的富集概况以及各个构建单元组合共同富集的程度。如图2a,b显示，作者找到两个独立的构建单元对（双合成子），用作系列建立的起点化合物或hits。其在7.7和1.6μM ERα条件下均显著富集、与雌二醇竞争，且对Y537S和S463P突变体也有显著富集，可见其在配体结合位点结合。图2.（a,b）两个代表性构建单元结构及其富集示意图（c）两个最具效力的off-DNA化合物结构及其荧光偏振结合位移测定3Hit验证及其SAR研究未验证输出选择，进行代表性off-DNA化合物的合成，并通过体外生物化学FP（荧光偏振）、对ER+细胞系MCF7在拮抗和激动模式下的增殖测定，以及在MCF7细胞中对PROTACs进行In-cell Western的ERα降解测定（Sapphire激光扫描成像系统，Azure Biosystems），鉴定出上述两个构建单元对的两个最具效力的代表性off-DNA化合物（1和2），如图2c所示。在DECL筛选数据和分子对接的指导下，作者设计、制备并评估了体外小分子的结构活性关系（SAR），将其中具有显著强效拮抗作用，且未观察到细胞激动作用的化合物7作为双特异性PROTAC的一部分进一步改造。4ERα强效结合PROTAC的结合物开发作者利用已知的ERα结合剂巴多昔芬，探索不同E3配体和连接体长度对ERα结合降解的影响。基于化合物7，1,3-偶极环加成制备了7种基于沙利度胺的化合物，结合实验中均为有效，其中11-14具有亚微摩尔细胞降解 (表2)。更进一步，基于VHL配体，设计制备了具有三个连接长度的PROTACs阵列。表2. 利用巴多昔芬或化合物7组成部分作为POI配体的PROTACsa原始分析. b48 h. c24 h. d6 h. e16 h.5ERα抑制降解的作用机制及动力学研究对于其中最有效的两个VHL变体(18和21)的PROTACs，在MCF7细胞中进行In-cell Western降解试验（Sapphire激光扫描成像系统，Azure Biosystems），结果显示在24 h时，两种化合物的ERα水平呈剂量依赖性降低，21的降解能力强于18（补充图S2)。MCF7细胞活力测定显示，激动剂作用可忽略不计，而两种化合物都显示出强大的拮抗活性。图S2. PROTACs在MCF7细胞中抑制并降解Erα。In-cell western 实验（Sapphire激光扫描成像仪拍摄）中的化合物18和21剂量反应曲线为评估PROTAC介导的ERα降解动力学，作者在时程实验后进行Western Blot（Sapphire激光扫描成像系统，Azure Biosystems）。结果显示， PROTAC的降解剂18效果早在2小时就可看到强烈的、近乎完全的降解(图4a)，显著优于富维司汀（4小时后出现降解，无完全降解）。E3结合剂VHL-298竞争实验(图4c) ，以及阴性对照（18的VHL脯氨醇差向异构体23）实验均证明，蛋白酶介导的ERα降解需要vhl参与(图4c) 。图4. 富维司汀及PROTACs 18、21在MCF7细胞中抑制和降解ERα。在另一种ER阳性细胞系T47D中Western Blot（Sapphire激光扫描成像系统，Azure Biosystems），测试ERα PROTACs 18和21。结果与MCF7细胞系相似，在T47D细胞中观察到明显的ERα降解 (图5a)。作者随后用剂量递增的ERα PROTACs 18和21处理各类乳腺癌细胞系7天。结果显示所有ER+细胞系均存在活力缺陷，而ER阴性MBA-MB 231和永生化的乳腺细胞系MCF10A未见有活力影响（图5b）。证实了这一新型ERα PROTACs系列的在靶（on target）效应。图5. (a) 18和21在MCF7和T47D细胞系的ERα降解（b）ERα PROTACs在各类乳腺癌细胞系中的在靶作用6体外ADME和PK总体而言，基于VHL的酰胺和苯氧基化合物17-22是ER+细胞系中ERα的有效降解剂。选择连接链较短的化合物17、18、20和21进一步研究（表3）。在体内，VHL苯氧基化合物20和21的静脉注射清除率远低于VHL酰胺17和18，且前者分布体积也远低于后者，故20、21的暴露量高于17、18。口服给药18和21时观察到的暴露量最小，但仍表现出强大的降解活性和显著的血浆暴露，且在皮下给药时具有不同的PK特征，因此值得在体内评估ERα的降解情况。表3. 雄性CD1小鼠中选定化合物的体外清除率和体内药代动力学（PK）7体内疗效研究化合物21皮下注射10 mg/kg也具有显著的肿瘤生长抑制效果，TGI= 84.3%，p Sapphire激光扫描成像系统，Azure Biosystems），所有治疗组的ERα水平均有所降低（图6e）。这些结果清楚地表明，化合物21是在体内外抑制和降解ERα的优秀工具化合物。图6. 体内疗效和PK/PD研究表明MCF7异种移植模型有效。(a) 18、21与富维司汀的抗肿瘤活性对比。(b)所有化合物耐受性良好，体重无变化。(c, d) 末次给药3 h 后18和21的终末血浆PK和肿瘤PK (e) Western blot（Sapphire激光扫描系统拍摄）显示18、21及富维司汀治疗后的ERα水平降低。8总结DNA编码化合物文库（DECL）作为设计PROTACs的筛选平台具有显著优势。基于此，本文设计、优化、制备了一组有效的Erα双特异性降解物，是进一步开发基于ERα的PROTACs乳腺癌治疗药物的价值工具。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jmedchem.1c00127关注我们，解锁更多Western Blot新技能，放飞科研无限想象！

随着生命科学研究的深入发展，精准、高通量且通用的技术方法在细胞反应及生物过程研究中的需求愈加强烈。传统的Western blot需要细胞裂解和破坏细胞环境，而活细胞成像通常缺乏免疫检测的分子特异性。In-Cell Western（ICW）结合免疫荧光染色和Western blot技术优势，可直接定量评估细胞内和周围细胞环境中的蛋白质表达和修饰，保留关键的生理背景。为确保ICW实验数据的可靠性，全细胞染色和高级成像至关重要。全细胞染色为数据准确性和归一化奠定了基础，确保反映单个细胞的真实变化，而非细胞密度的差异。为捕捉微妙、动态的细胞反应及细微差别，高性能、高分辨的激光扫描成像系统不可或缺。Sapphire FL激光扫描成像系统专为卓越生物成像而生。多重荧光检测显著提高实验效率，成像通道间无信号串扰，保障数据的可靠性。结合高质量、经验证的试剂，能有效区分特定信号，甚至可捕获蛋白质表达中最细微的变化。— 案例：HeLa细胞的STAT3/pSTAT3测定 —材料与方法· 细胞培养将HeLa细胞连续稀释后，以115μL /孔的体积接种于96孔无菌细胞培养板中。培养皿孵育过夜，随后用IFN-α处理4-12列的细胞15分钟。PBS清洗后，方可进行ICW实验。· In-Cell Western100%甲醇-20°C固定细胞20分钟后，使用AzureCyto™渗透液孵育5分钟。随后用AzureCyto封闭液室温振荡封闭1小时。根据表1对细胞进行STAT3和/或pSTAT3检测。将一抗与AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C过夜，进行全细胞染色。PBS洗涤后，将AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室温孵育30分钟。PBS冲洗后可进行成像。表1.孔板列的处理及检测参照表· 多通道荧光成像使用Sapphire FL  532nm、685nm和784nm标准光学模块进行成像，分辨率为10µm，焦距设置为+3.00mm。· 蛋白归一化为解释孔间的细胞数量及蛋白含量差异，将每孔的目的蛋白信号归一化为该孔的全细胞染色信号值。找出稀释系列中强度最高的全细胞信号值，将其他每孔的信号值除以该最大值，得出每孔的归一化因子。再将每孔的目的蛋白信号除以相应的归一化因子，得到归一化信号值。实验结果pSTAT3在IFN-α作用下表达量增加，有力地证明了结合全细胞染色归一化，ICW可有效捕获强剂量和治疗反应。考虑到孔间的细胞体积差异，全细胞归一化有助于确保数据的可靠性和准确性。值得注意的是，在此ICW实验中，每个扫描通道间信号无串扰，增强了数据的可靠性和完整性。左右滑动，查看更多结果与讨论ICW是深入了解细胞信号和蛋白质动力学的有力工具，在高通量药物和治疗筛选方面具有广泛而重要的应用。结合Sapphire FL此类高灵敏、高性能的先进成像系统，ICW成为一种强大的通用型工具，可捕捉蛋白表达及细胞反应的动态、微妙变化。Sapphire FL具有5-1000μm可调节分辨率，飞克级检测灵敏度，呈献高质量数据。其兼容多种样本，除了凝胶、印迹或载玻片等平面样本，还支持孔板、培养皿和小型模式生物等厚样本类型。除多重荧光成像外，Sapphire FL激光扫描成像系统还可灵活实现近红外荧光、磷屏、化学发光及可见光等多功能成像应用，赋能实验室多样化、更深入的科研需求！关注我们，解锁更多生物成像新技能，放飞科研无限想象！

免疫组织化学(IHC)是一种利用抗原抗体特异性结合，检测和定位组织样本中特定抗原或分子的技术。由于抗原的位置可提供关于其生物作用及组织完整性、发育阶段等信息，因此，IHC具有重要的基础研究价值，是疾病诊断和肿瘤分期的重要工具。传统的IHC实验使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体进行显色检测，一次只能在载玻片上检测到一种抗原。而多重荧光检测技术（如Sapphire FL激光扫描成像系统）的应用，大大增强了载玻片上的信息获取，有效提高了诊断的准确性。同时，Sapphire FL具有5-1000μm可调节的高分辨率，可快速筛选分类，挑选最好的切片进行显微分析，免于对所有切片进行显微镜成像观测的耗时繁琐。此外，Sapphire FL获取的完整载玻片图像，可对显微镜捕获的小切片图像进行补充。— 实验案例：小鼠肺组织切片的IHC成像 —使用Sapphire FL，对小鼠肺组织切片进行多重荧光IHC成像，对切片中的两种抗原进行检测。材料与方法1. 小鼠肺组织的制备将小鼠肺组织的石蜡块切片置于载玻片上，60度烘烤45分钟。组织切片使用二甲苯和乙醇洗涤，进行脱腊、水化。分别使用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和PBS洗涤2次，每次5分钟。2. 抗原修复脱腊及水化完成后，载玻片在Tris-EDTA Tween®缓冲液(pH 9)中，使用电饭锅孵育22分钟。随后等待20分钟，使载玻片回至室温后，在PBS中洗涤两次，每次10分钟。3.免疫检测为检测切片中的血管内皮(VE)钙粘蛋白和平滑肌肌动蛋白(SMA)，采用兔抗VE钙粘蛋白和小鼠抗SMA 为一抗。将组织切片在Power BlockTM 中封闭12分钟。使用含0.5% Triton的PBS缓冲液稀释一抗：兔抗VE钙粘蛋白抗体及小鼠抗SMA抗体的稀释比例分别为1:100和1:200。将载玻片与一抗冷藏孵育过夜。随后使用TBS洗涤两次，每次5分钟，再用TBS- tween®洗涤一次，除去未结合的一抗。使用荧光标记的二抗，AzureSpectra山羊抗兔550 (Azure Biosystems产品#AC2158) 和AzureSpectra山羊抗鼠650 (Azure Biosystems产品#AC2166)对一抗进行检测。使用含0.5% TritonTM的PBS缓冲液对二抗进行1:500稀释。将载玻片置于二抗溶液中室温孵育1小时。随后使用TBS洗涤两次，每次5分钟，再用TBS- tween®洗涤一次，洗去未结合的二抗，并盖上盖玻片进行成像。4. 成像使用532nm和638nm标准光学模块和扩展动态范围(EDR)功能，在Sapphire FL上对切片进行成像。聚焦类型选择Slide，将焦距设置在玻璃成像表面上方+1.00 mm。图像以5μm分辨率拍摄，质量设置为High（高）。结果图1. 小鼠肺组织切片探测血管内皮（VE）-钙粘蛋白（红色，AzureSpectra 550nm二抗）和光滑肌肉肌动蛋白（SMA）（绿色，AzureSpectra 650nm二抗）。使用Sapphire FL激光扫描成像系统在532nm和638nm通道下成像，分辨率5μm。图1显示了Sapphire FL拍摄的多重荧光IHC实验图像。载玻片中的小鼠肺组织切片，使用VE-cadherin和SMA进行探针检测，并使用两种荧光标记的二抗进行检测。VE-cadherin使用Sapphire FL 532nm标准光学模块检测，在图像中显示为红色。SMA使用Sapphire FL 638nm标准光学模块检测，在图像中显示为绿色。在5μm分辨率图像中可很容易地观察到组织形态。在图1中，肺组织区域被放大，局部SMA染色可更详细地可视化。结论使用Sapphire FL可对荧光标记的肿瘤，轻松实现可视化。同时对于未被标记的肿瘤，也可实现高品质的成像检测。Sapphire FL具有集成的麻醉端口，搭配合适的导管和鼻锥，即可实现活体小鼠的麻醉成像；高达4cm的样品仓，支持小鼠、植物、培养皿及其它大型生物样品成像。除荧光成像外，Sapphire FL还可灵活实现近红外荧光、磷屏、化学发光及可见光的多功能成像应用，赋能实验室多样化、更深入的科研需求！点击文末阅读原文，即可下载产品应用指南。关注我们，解锁更多生物成像新技能，放飞科研无限想象！

革兰氏阴性菌中富含脂多糖（LPS）的外膜结构对维持细胞活力至关重要，破坏外膜会增加其抗生素敏感性。外膜组装过程中，LPS需穿过周质空间从内膜运输至细胞表面。此过程依赖于内膜上的脂多糖转运蛋白LptB2FGC，通过水解ATP，将LPS传递给由LptF、LptC、可溶性周质蛋白LptA及整合膜蛋白LptD的周质部分形成的蛋白质桥进行运输。最近发现的大环肽家族被认为可抑制脂多糖转运，且生化实验显示出对不动杆菌的抗性，但仍缺少结构信息以确定这些抗生素抑制LPS转运的分子机制。近日，哈佛大学在Nature杂志发表了题为“A new antibiotic traps lipopolysaccharide in its intermembrane transporter”的文章，解析了LptB2FGC复合物结合大环肽的结构，明确了LPS的转运抑制机制，从而为下一代抗生素的开发和应用绘制了蓝图。1药物与LPS的结合及结构冷冻电镜下，大环肽化合物1与LptB2FG和结合的LPS分子形成广泛的接触（图1c）。作者解析了大肠杆菌异源表达及A. baylyi 菌株表达的LptB2FGC复合物在LPS存在下结合大环肽化合物1的结构（图1d），呈现出高度一致性。图1c、不动杆菌LptB2FG复合物与LPS、化合物1结合的内膜冷冻电镜结构d，转运体腔中不动杆菌LptB2FG与不动杆菌LPS、化合物1结合的冷冻电镜图（白色），与大肠杆菌LPS和1结合不动杆菌LptB2FG的结构叠加。大环肽化合物的结合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)组成(图2)。这些关键残基的突变会不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同时，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系统成像），监测LPS从LptB2FGC复合物释放向LPtA的转运。结果显示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC复合物释放LPS（图2c），但无法抑制两种突变体复合物（E249K及I317N）释放LPS（图2d）。证实了大环肽-LptFG接触对抑制不动杆菌菌株生长的重要性。图2. 转运体中化合物1与LPS结合的中间态。a，LptF与LPS及化合物1的三元复合体结构图， c,d, 化合物1可抑制野生型LptB2FGC向LptA转运LPS(c)，但对LptB2FE249KGC或LptB2FI317NGC 无效(d)（Azure多功能分子成像系统拍摄）。e，转运体腔中LptB2FG结合LPS（白色）与LptB2FG-LPS-1结构的叠加图。2药物捕获LPS及影响因素作者另外使用冷冻电镜解析了LptB2FG-LPS的结构，结果显示其整体构象和接触几乎与LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）时相同(图2e)。表明该状态可作为抗生素开发的药物作用构象。此外，LptF Arg30和Arg55对不动杆菌中复合物的功能至关重要，可能有助于在运输过程中定位LPS。作者随后构建了LPS的LpxM缺失突变体，探究不动杆菌LPS的结构改变对化合物1抑制效力的影响。Western Blot实验显示（Azure多功能分子成像系统成像），当化合物1浓度达到抑制野生型LPS运输所需浓度的20倍时，从大肠杆菌ΔlpxM分离的LPS的运输是可能的(图3b)。不动杆菌ΔLpxM LPS对化合物1的易感性比野生型低30倍 ，与此结果一致。由于ΔLpxM菌株毒力较低，因此lpxM缺失可能不会导致体内大环肽的易感性降低。图3. 化合物1对野生型及ΔLpxM菌株的LPS转运抑制情况。ΔLpxM菌株中分离的LPS使LptB2FGC对1具有抗性。3LptC螺旋与药物的结合竞争LptC螺旋是协调LPS运输与ATP水解的重要因素。LptB2FG-LPS-1结构显示，LPS转运过程中，化合物1与LptC TM螺旋具有结合竞争。这解释了化合物3的杀菌效力相当，但其抑制LptB2FGC复合物释放LPS的有效性大不如1和2的原因。冷冻电镜显示，化合物1和2含有相对较大的取代基，可比化合物3更有效地与LptC TM螺旋竞争。由此推断，LptC TM螺旋缺失时，化合物1、2、3均应抑制LPS的释放。作者随后在体外构建转运实验，通过Western Blot实验（Azure多功能分子成像系统成像）进行验证。与预测一致，化合物3在体外不抑制LptB2FGC向LptA的转运，但1-3在抑制LptB2FG-ΔTM-C对LPS的转运方面具有同等效力(图4d)。          图4d, 化合物3在体外不抑制LptB2FGC向LptA的转运，但1、2和3在体外抑制LptB2FG-ΔTM-C对LPS的转运。e, 化合物 1以LPS依赖的方式增加LptB2FG、LptB2FGC和LptB2FG-ΔTM-C的ATP酶活性。f, SPA测量显示化合物2在LPS存在而LptC不存在的情况下与Lpt结合。4药物将ATP酶活性与LPS转运分离LptB2FG转运体中的LPS装载可刺激ATP酶活性。由于大环肽在转运体中捕获LPS，因此将化合物1-3添加到LptB2FG和LptB2FGΔTM-LptC复合物中时，均导致ATP酶活大幅增加(图4e) 。可见，化合物与LptB2FG的结合是大环肽发挥活性的关键。临近闪烁分析(SPA)验证了上述结论，且再次验证了1-3均有相当的杀菌效力，以及大环肽靶与LptC TM螺旋竞争结合的作用机制。5总结与讨论总的来说，本研究揭示了大环肽家族的脂质转运抑制机制，揭示了Lpt转运体的可药物构象，并为这类抗生素扩展到其他革兰氏阴性病原体的应用提供了基础。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06799-7创新驱动性能，Azure多功能分子成像系统广泛兼具普通凝胶、化学发光、RGB和激光NIR荧光成像等功能应用。更灵活具有多种型号，可按需选择，后续可扩展升级。独创配备的双近红外激光光源，可获取高信号、低背景的高灵敏度信号，成就非凡生物成像体验！关注我们，解锁更多Western Blot新技能，放飞科研无限想象！

肺纤维化疾病由于缺乏可靠的生物标志物进行风险分层和治疗监测，给疾病的精确管理带来挑战。近年来发现，单核细胞来源的巨噬细胞(MDMφ)的积累是促进肺纤维化的关键因素。因此，跟踪MDMφ积累的体内动力学可望用于肺炎纤维化的评估。近日，匹兹堡大学在Science Advances杂志（IF：13.6）发表了题为“Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1”的文章，研究了cmklr1靶向的PET在小鼠纤维化肺损伤模型中监测MDMφ积累动力学的潜力，并确定了其作为纤维化肺疾病内分型和预后生物标志物的临床相关性。1肺纤维化中的巨噬细胞图景为研究CMKLR1在IPF肺免疫细胞中的作用，作者对两个具有>300,000个免疫细胞的全肺单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集进行探索分析。按不同表型，巨噬细胞被分为包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬细胞，以及3组非肺泡巨噬细胞：SPP1- m φ组、FOLR2-Mφ组及罕见的OLFML3-Mφ群体。2CMKLR1表达标志新生MDMφ的富集两个数据集中，CMKLR1表达在巨噬细胞群体中最常被检测到(图1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫细胞类型中具有最高的检测频率及CMKLR1表达，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。与更严重的下肺叶相比，IPF上肺叶中促纤维化SPP1+巨噬细胞更少。但CMKLR1+巨噬细胞数量在上、下肺叶中同样具有显著升高（IPF上肺叶：8.4%，下肺叶：8.9%；对照组上肺叶：2.3%，下肺叶：0.8%），相比于终末期SPP1+促纤维化巨噬细胞的升高，可作为更可靠的早期生物标志物。广义加性模型(GAMs)显示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ轨迹中，CMKLR1的表达随着单核细胞特征的下降而上升，当促纤维化基因表达开始时达到峰值，后随着促纤维化特征的上升逐渐下降（图1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纤维化中富集的标志，可随着巨噬细胞适应纤维化微环境并逐渐下降。图1. 人类肺部疾病和健康的scRNA-seq分析。(B)按细胞类型标记的细胞UMAP。(C-D) 细胞类型、数据集及疾病间标准化的基因表达UMAP和热图。(I- J) 基因表达的广义加性模型(GAM)拟合为上述每条轨迹的扩散伪时间函数。3MDMφ驱动CMKLR1靶向肽的摄取博莱霉素气管给药后的1、2和4周分别大致对应于肺炎高峰期、持续肺炎的早期ECM重构及炎症消退伴纤维化。为便于流式细胞实验，作者用荧光修饰肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示踪剂[64Cu]NODAGA-CG34的类似物。结果显示，基线期的主要免疫细胞群体为组织驻留的肺泡巨噬细胞，MDMφ忽略不计。1周后， MDMφ显著积累，而肺泡巨噬细胞数量稳定。第2周，MDMφ数量与1周时相似，但后者数量大幅增加，且MDMφ表现出与其愈加相似的表型分化（图2A）。4周后均回落至基线水平。在此期间，肺单核细胞数量相对稳定。    图2. 流式细胞术鉴定驱动CMKLR1靶向肽摄取的细胞。(A)肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞和MDMφ的鉴定。(B)单核细胞和巨噬细胞亚群绝对数量的动力学。(D)单核细胞和巨噬细胞群体对6CF- CG34特异性摄取的定量检测。(E)给药后摄取6CF- CG34的细胞亚群占比。相应地，最初2周的MDMφ对6CF-CG34的摄取很高，第4周趋于减少（图2C、D）。间质巨噬细胞仅在给药后1周有短暂增加，2周后又恢复至基线水平。而肺泡巨噬细胞和单核细胞在此期间均无显著的6CF-CG34特异性摄取。NK细胞尽管具有显著摄取，但博来霉素诱导损伤后，其丰度及CMKLR1表达均未变化。此外，在损伤后1周和2周，6CF-CG34的总摄取显著增加，且主要由MDMφ的积累驱动（78%和86%）。4周后降至基线水平，显示了MDMφ丰度及其CMKLR1表达水平的降低。[64Cu]NODAGA-CG34 PET及体外γ计数均得到与上述的一致结果。4CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺区PET为验证[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺组织空间图的准确性，作者随后对肺部进行磷屏成像（Sapphire激光扫描系统拍摄），并对CMKLR1和巨噬细胞标志物F4/80进行免疫荧光染色(图5)。体内PET检测的示踪剂摄取与相应的离体磷屏成像之间存在强大的共定位(图5A、B)，证实了示踪剂摄取的无创空间定位的准确性。[64Cu]NODAGA-CG34摄取高的区域与表达CMKLR1的F4/80+巨噬细胞丰富的炎症区域相对应(图5C、D)。可见，[64Cu]NODAGA-CG34 PET可定量监测博莱霉素诱导的纤维化肺损伤各阶段MDMφ募集的空间定位。图5. 博莱霉素处理小鼠1周后， CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺区[64Cu]NODAGA-CG34摄取共定位图像(A) PET/CT(B)体外放射自显影（磷屏成像，Sapphire激光扫描成像系统拍摄）(C)苏木精和伊红染色和(D)免疫染色组织5PET准确预测肺纤维化程度进一步纵向研究显示，第1周肺中[64Cu]NODAGA-CG34高摄取的区域与第4周CT检测到的严重纤维化的区域相对应，且摄取量与纤维化程度（羟脯氨酸含量及肺衰减量）相关。而第1周的CT实变与纤维化程度仅为弱相关或不相关。可见，肺损伤早期[64Cu]NODAGA-CG34的摄取可准确预测纤维化严重程度和分布，有效补充CT获得的解剖学信息。图6. [64Cu]NODAGA-CG34 PET对早期肺纤维化的预测。肺部[64Cu]NODAGA-CG34摄取与第四周羟脯氨酸含量(C)及肺衰减 (D)相关。第1周的CT实变与第4周羟脯氨酸弱相关(E)，与肺衰减无显著相关(F)。6CMKLR1有助识别IPF炎性内型对三个地点的IPF患者纵向队列二次分析显示，与对照组相比，IPF患者支气管肺泡灌洗（BAL）细胞中的CMKLR1表达更高，且呈现明显的异质性。转录组分析显示，CMKLR1高表达患者中，趋化因子/趋化因子受体（如CCL2、CCL7）、细胞因子/细胞因子受体（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎症相关基因表达上调（图7B），或可助于识别IFP不同炎症内型。CMKLR1表达具有作为预后生物标志物的潜力，与年龄、性别、研究地点和GAP（性别-年龄生理学）指数无关。CMKLR1表达越高，预后逐渐恶化。此外，在不同水平GAP指数的患者分层中，CMKLR1表达均显示与生存率的相关性。ROC分析显示，CMKLR1在短期至中期随访期间的预测能力优于GAP评分，可望提供现有临床工具外更丰富的风险分层信息。图7. CMKLR1高表达可识别炎症性和预后不良的IPF内型。(D)基于CMKLR1表达的Kaplan-Meier生存曲线。(E、F) GAP评分分层后的Kaplan-Meier生存曲线表明，CMKLR1高表达预示着较差的生存。(G、H) CMKLR1表达及GAP评分预测BAL术后死亡率的ROC曲线。7CMKLR1在各类纤维化肺病中的表达作者利用现有的生物库进一步探索分析，发现IPF、结节病、硬皮病、类风湿关节炎和煤矿工人尘肺患者肺中存在表达CMKLR1的白细胞，提供了CMKLR1在各种纤维化肺疾病中表达的组织学证据。但由于移除的肺通常代表终末期的疾病特征，仍需进一步研究来阐明CMKLR1在这些疾病中的特异性表达，及其用于疾病内分型和风险分层的潜在用途。8总结与讨论本研究建立了CMKLR1作为纤维化肺病中富集MDMφ的生物标志物，证明了CMKLR1靶向PET无创监测MDMφ积累和纤维化程度预测的准确性，并显示出其对IPF分子内分型的应用前景。原文链接：https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817关注我们，解锁更多分子成像新技能，放飞科研无限想象！

神经元使用不同的蛋白质组合建立突触接触，从而定义突触的特异性、功能和可塑性潜力，为学习和记忆的形成提供了分子基础。越来越多的证据显示，突触在结构和功能上有很大的多样性。然而，突触蛋白质组的多样性在很大程度上仍未可知。近日，德国马克斯-普朗克研究所在Cell上发表了题为The proteomic landscape of synaptic diversity across brain regions and cell types的文章。作者从7个转基因小鼠系、5个不同脑区中分离出18种不同突触类型的蛋白质组，发现了1800种独特的突触类型丰富的蛋白质。作者鉴定了共享的突触蛋白模块及蛋白质组学热点，并提供了突触蛋白质组学与细胞或电路水平结合的研究框架。1蛋白质组量化的流程开发作者使用荧光激活的突触体分选（FASS）制备纯化突触体，并耦合质谱仪进行定量 (图1A),开发了一套简化的工作流程，用于量化不同脑区、不同细胞类型突触的蛋白质组区域。将Gad2-cre（皮层抑制性）及Camk2acre（皮层兴奋性）品系与SypTOM品系杂交（图1A），主成分分析(PCA)显示与未分选的突触体的具有显著差异(图1C、1D、S1H和S1I)。定量显示，其富集程度最高的蛋白质几乎完全代表着现有的皮层兴奋性/抑制性突触标记蛋白(图1D和1E)。Camk2a::SypTOM中富集程度最高的20个蛋白中，有19个已在SynGO数据库有注释。证明此工作流程可从少量纯化的突触体中识别突触蛋白。图1. 突触多样性、蛋白质组学的检测流程及验证实验(A)蛋白组量化的工作流程图(B) FASS等高线图。(C) Camk2a+与Gad2+突触体蛋白组的PCA分析。(D) Camk2a+及Gad2+突触体与对照突触体前体的蛋白富集差异散点图。(E) Camk2a+ (石灰绿色)与Gad2+突触体(玫瑰色)显著富集蛋白比对的火山图2流程应用及数据查询工具作者随后将上述流程应用于来自5个不同脑区、4种Cre小鼠模型的15种不同主要突触亚型的蛋白质组学多样性研究。结果显示，不同脑区Camk2a::SypTOM及Gad2::SypTOM突触体的特异性有差别。但在突触体丰度、突触囊泡的大小或存在、突触线粒体或脑区之间的突触后结构方面无差异。PCA分析显示，与脑区相比，细胞类型对突触蛋白质组的影响更大。作者共鉴定了15个突触蛋白质组超10,000种蛋白组，其中80%为syngo已注释蛋白，富集蛋白组>1,800种，并创建了一个交互式网络工具 (The Synaptic Diversity Hub, https://syndive.org/)，可供查询探索 。3胞吞/胞吐作用蛋白的富集特性在几乎所有突触类型中，突触囊泡泡atp酶(vATPases)以及介导突触囊泡内吞作用的蛋白质显著富集(定义为共享蛋白)。在所有脑区，Gad2:: sytom与Camk2a:: sytom富集蛋白很少重叠(约1%)。某些蛋白家族如Rab、Vamp、Stx或Syt家族成员在兴奋性（Camk2a）或抑制性（Gad2）突触上表现出不同的富集特征。随后对这些蛋白质的一个子集进行免疫印迹实验，采用Sapphire激光扫描成像系统进行拍摄（Azure Biosystems）。结果显示，Vamp1, complexin-1/2, Syt2在Camk2a中相较于Gad2显著富集，而Syt12, Stx1a则在Gad2中更显著富集，证实了这些数据(图S4C-S4E)。免疫印迹和质谱分析之间有很好的相关性(Pearson’s r=0.95)。这种多样性表明，这些蛋白质可能以不同的方式调节相同的突触分子过程。图S4.突触蛋白的共享和亚型特异性富集(C)免疫印迹验证（Sapphire 激光扫描成像系统拍摄）。(D)免疫印迹定量直方图。(E)免疫印迹与质谱分析相关图。而在CX和HC中，>95%的CAMs（细胞粘附分子）仅富集于兴奋性或抑制性突触蛋白质组，具有高度的细胞类型特异性。综上，内吞作用和vATPases使用通用的突触蛋白模块，不因神经递质类型而异；而胞吐机制、突触前活跃区等则使用类型特异的蛋白质组。4VGlut1及vGat相关蛋白组研究作者将所有蛋白质模块与突触亚型的特征相关联，揭示了具有两个不同对立簇的蛋白-蛋白相关网络，分别具有与VGlut1或vGat高度相关或负相关的特征，代表不同细胞类型和大脑区域中与兴奋性或抑制性神经递质相关的蛋白质组。作者鉴定出188个和315个与VGlut1或vGat表达显著相关的蛋白，找到位于群落连接节点的核心蛋白(图4D) ，以及可能区分特定突触亚型的中度相关蛋白。另外发现130种与vGat表达以及158种与VGlut1表达显著相关的新突触蛋白。基因集富集分析(GSEA)表明，vGat和VGlut1蛋白群落具有特异的富集途径或生物功能：VGlut1群落中突触后信号通路和树突棘相关蛋白显著富集(图4F) 。vGat群落中，GABA受体复合物的蛋白显著富集。鉴定出皮层和海马体中的22对蛋白质对，在兴奋性和抑制性突触中的富集呈显著负相关 (图4G, 4H) 。并发现一些新蛋白，可能在相同的突触分子过程中，参与调节突触的类型特异性。图4.突触蛋白-蛋白相关网络(D)蛋白质节点与vGat免疫反应(上)及VGlut1免疫反应(下)的相关性(E) 与vGat免疫荧光显著相关模块中的蛋白质。(F) VGlut1和vGat蛋白群落富集通路的脊图。(G)皮层和海马Camk2a+和Gad2+突触蛋白质组中负相关蛋白对的热图。(H)负相关蛋白对的相关图。5帕金森及罕见突触类型的研究应用为研究特异性与共享多巴胺能突触蛋白（其退化与帕金森密切相关），作者鉴定了在纹状体中，多巴胺能突触相比于其他14种突触类型的突触蛋白富集情况。显示多巴胺能突触中缺乏Oxr1可能导致氧化损伤的易感性(例如，在帕金森病期间)。而蛋白激酶Erk1 (Mapk3)通过在多巴胺能突触的特异性富集与帕金森病相关。相对于纹状体Syn1:: sytom突触，Dat:: sytom突触蛋白质组富集了参与多巴胺生物合成、运输和降解的关键蛋白。免疫印迹实验（Sapphire激光扫描成像系统拍摄）验证了这些发现 (图S6B)。此外，共享富集的蛋白包括vATPases、蛋白酶体亚基和内吞蛋白(图5F和S6C)。图S6.多巴胺能蛋白组分析(B)验证Oxr1、Mapk3和Atp6v1g1在Dat+及Syn1+突触的富集或去富集。(C)突触前末端的Dat+和Syn1+突触中富集的选定蛋白。(D)突触体制备的不同组分的SDS-PAGE和免疫印迹。(E)原代大鼠皮质神经元PSME1免疫共沉淀实验的免疫印迹。(F)小鼠纹状体F2/3组分和纯化的20Si蛋白酶体的SDS-PAGE。图B、D、E、F均为Sapphire拍摄。此技术流程同样可用于研究小分支或罕见细胞的突触类型。例如，作者成功的量化了Gad2:: sytom的抑制性突触蛋白质组。又在对皮质GABA能神经元亚类的研究中，分选得到的VIP+、PV+和SST+突触体（分别仅占所有颗粒的0.5%、3%、5%）的纯度均＞80%，且成功检测出其蛋白的富集。进一步分析显示，细胞类型的发育起源对皮质抑制性突触蛋白质组的影响不大。最后，作者发现了共600种与这三种抑制性突触类型的功能差异相关的蛋白质。6总结本研究开发了一套突触蛋白组的分子系统生物学分析框架。预计类似的实验策略可用于突触的多组学分析，研究其他生物分子(如聚糖、脂质或RNA)的突触多样性。未来，突触蛋白组也可与局部转录组整合描述RNA定位和局部翻译在突触蛋白质组多样性中的作用。此外，Cre/ lox系统等方法也将启发在细胞水平的研究。关注我们，解锁更多Western Blot新技能，放飞科研无限想象！Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域30余年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，已发表大量文章，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

近日，SelectScience 公布了2024年科学家选择奖（Scientists' Choice Awards）提名名单。作为全球科学社区领先的独立在线资源，SelectScience自2007年起开始设立科学家选择奖，旨在表彰对全球科学进步影响最大的科技创新。Azure Biosystems喜获年度 “最佳生命科学新产品奖” 提名，公司的重磅革新产品—— Sapphire FL激光扫描成像系统即是获得这一殊荣的11款产品之一（下图为提名名单）。Sapphire FL是一款专为应用灵活性设计的高性能激光扫描成像系统，5-1000μm可调节分辨率，并配备可定制、用户可更换的激光和滤光片模块，可检测几乎任何荧光团，并轻松适应不断变化的成像需求。Sapphire FL是同类产品中唯一一款涵盖从紫外到近红外（NIR）波长范围的生物分子扫描成像系统。除多重荧光成像外，Sapphire FL还可以进行白光、磷屏、凝胶及化学发光成像。Sapphire FL具有广泛兼容的样本类型，从平板样本（如凝胶、印迹或载玻片）到深度达4厘米的样本（包括培养皿、植物和小型模式生物）均可支持。Sapphire FL呈献高质量数据：超宽动态范围（EDR）模式可在强信号不过饱和的前提下， 极大提高弱信号的获取能力，获得更高质量的定量数据。独特专利技术的检测器工艺，实现对常规染料的飞克级检测灵敏度。关注我们，解锁更多生物成像新技能，放飞科研无限想象！Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。目前已发表大量文章，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

真核生物的基因表达需要成熟的mRNA从细胞核选择性转运到细胞质进行翻译。新生成的mRNA被加工和包装成核糖核蛋白复合物(mRNPs)后，通过必需转录输出复合物(TREX)识别输出。然而，mRNP识别和三维组织的机制尚不清楚。近日，维也纳生物中心分子病理学研究所在Nature (IF: 69.504)杂志上发表了名为mRNA recognition and packaging by the human transcription-export complex的研究。研究报道了重组和内源性TREX – mRNA结构，并提出了核mRNA识别和包装的机制。1冷冻电镜分析TREX通过其ALYREF亚基多价作用于mRNA结合的EJC（外显子连接复合体）。为了解其相互作用机制，作者重组了一系列不同RNA长度(15或50个核苷酸) 的ALYREFN-EJC-RNA多聚体复合物。ALYREF截断实验显示，ALYREF (55-182) (残基55-182) 是ALYREF - EJC – RNA有效重构和多聚的必要条件。ALYREF (55-182)-EJC-RNA复合物的多聚合依赖于蛋白-蛋白接触。作者随后纯化分析了此复合物六聚体的冷冻电镜结构。图1b. ALYREF55-182–EJC–RNA复合体冷冻电镜分析（俯视图和侧视图）ALYREF-EJC-RNA复合体结构ALYREF (55-182)-EJC-RNA的每个原聚体提供一个EJC – EJC（图1b左）和三个ALYREF - EJC接口（扩展图2h），通过保守的ALYREF –EJC多价作用（扩展图2i），连接成一个环。为维持这种结构，ALYREF WxHD(界面b) 或RRM结构域(界面c和d) 突变，防止体外ALYREF - EJC - RNA复合物的形成和多聚。扩展图2h. ALYREF - EJC接口：ALYREF WxHD(界面b) 及RRM结构域(界面c和d) ；i. ALYREF、EIF4A3和MAGOH中ALYREF - ejc界面残基多序列比对该结构中，一个ALYREF分子桥接三个EJC-RNA复合物。两个EJC分别连接mRNA两端，ALYREF结合后使两个EJC靠近及mRNP压实。此外，ALYREF结合域1、2（RBD1和RBD2）结构域中富含Arg - Gly的保守基元是体外结合RNA所必需的。综上，ALYREF-和EJC介导的mRNP识别和包装可能依赖于多价蛋白和蛋白- mRNA的相互作用。ALYREF 将 mRNP桥接到 THO–UAP56冷冻电镜结果显示(扩展数据图2h)，只有ALYREF WxHD和RRM区域接触EJC-RNA复合物。因此，ALYREF将EJC-RNA复合物与THO - UAP56的桥接，可能是通过其保守的多拷贝UAP56结合基(UBMs)实现。ALYREF-RNA结合活性包含在RBD1和RBD2结构域中。RNA过滤结合亲和力试验表明，RBD1和RBD2可能有助于RNA传递到UAP56，但对其与ALYREF55-182的结合无效。实验采用Sapphire激光扫描成像系统检测RNA的标记荧光信号（488nm，Azure Biosystems），GraphPad Prism函数拟合计算亲和力。核提取物和体外生化数据支持这一模型。数据表明，ALYREF和THO的多价相互作用可能对TREX在mRNPs上的组装以及UAP56向mRNA的有效递送很重要。进一步结构分析显示，只有结合了mRNA的EJC才能形成多价ALYREF-EJC复合物，这表明mRNA前剪接可能先于mRNP包装。2TREX-mRNP结构与接触TREX-mRNP多价模型作者随后对TREX-mRNP进行体外交联及冷冻电镜分析，与其天然配合物对比显示：体外重建的ALYREF - EJC相互作用也发生在天然配合物中。此外，本研究确定了CBC内以及EJC EIF4A3亚基与PSAP复合物亚基PININ之间的交联，可与各种输出适配器协同作用，并导致多价TREX-mRNP组装。TREX–mRNP 冷冻断层扫描密度与冷冻电镜结构非常吻合。TREX复合物包被在mRNP表面TREX复合物仅在mRNP表面结合，其四个UAP56亚基面向mRNP(图4a, b)。但综合分析表明，TREX复合物与mRNP相互独立关联，这可能是TREX适应mRNP形状和大小多样性所必需的。作者预测，2到3个TREX复合物可同时结合到平均含3500个mRNA核苷酸的人类mRNP上。图4a. 降噪后TREX - mRNP冷冻电镜层析图；b. 含有两个TREX复合物的TREX - mRNPs图mRNP形成致密小球mRNPs形成致密的球体，表面的TREX复合物发挥调节作用，内部蛋白（如SRSF家族蛋白）则发挥组织作用。为比较研究TREX - mRNP结构中TREX及mRNP的环境亲和力，作者建立了如下实验：使用CRISPR-Cas9敲入系统，获得GFP-THOC5及GFP-EIF4A3 的K562细胞系（THOC5为TREX亚基；EIF4A3为EJC亚基），将核提取物与携带荧光蛋白 AF647 的抗GFP纳米体孵育。将混合物梯度超离心后，使用Sapphire激光扫描成像系统进行成像（GFP和AF647荧光通道检测），检测纳米体对不同GFP融合蛋白组分的亲和力（重梯度组分为TREX-mRNPs GFP融合蛋白；轻梯度组分为游离的GFP-THOC5及GFP-EIF4A3蛋白）。结果显示(扩展数据图10b,c)，纳米体与GFP-THOC5在所有组分都能很好地结合；相反，纳米体在重梯度组分中与GFP-EIF4A3结合较差。可见，TREX - mRNP结构中TREX的环境亲和力强于mRNP。此外，所有内源性标记的GFP-THOC5或慢病毒过表达的THOC1-GFP核提取物，均可被抗GFP纳米体免疫沉淀，而GFP-EIF4A3的反应效率则很低(扩展数据图10e)。Sapphire激光扫描成像系统检测。这些数据均支持观察到的TREX-mRNP结构。扩展图10a. 探测mRNP复合物中蛋白质可及性的实验示意图；b. 核提取物GFP-THOC5在不同梯度组分中的SDS-PAGE荧光信号；c.核提取物GFP-EIF4A3在不同梯度组分中的SDS-PAGE荧光信号；e. Western blot显示THOC1-GFP (异位过表达; Lenti O/E) ， GFP-THOC5(内源性标记; endo) 及GFPEIF4A3(内源性标记)的消耗速率（图b,c,d,e为Sapphire激光扫描成像系统拍摄）；f. GFP标记的THOC5或EIF4A3在TREX-mRNPs中可及性模型。3mRNA包装和输出模型我们的研究结果提出了一个TREX依赖的核mRNA包装和跨mRNA尺度输出的模型(图5)。图5. mRNA包装模型其中，TREX可能通过四种机制促进mRNA的生物发生：一、TREX的包被在空间上限制mRNP。THO28、41和ALYREF53与UAP56的联合多价结合可能共同刺激UAP56的ATP酶活性，调节随后的mRNP重塑和mRNA输出因子加载(图5) 。二、在TREX-mRNP结构中，THO复合物位于mRNP表面，利于在核输出之前从mRNP中释放。三、核内mRNA转录可避免有害的RNA-DNA相互作用或mRNP成熟过程中RNA-RNA接触。反之，TREX缺陷导致DNA附近松散mRNA的积累，将造成基因组不稳定。四、TREX包被可以解释mRNPs如何免受核mRNA降解机制的影响。成熟的mRNP具有与TREX类似的球状结构，可更有效地通过拥挤的核质和核孔复合物，mRNA输出因子在其中被装载到mRNP表面，使其通过核孔复合物的疏水屏障进行运输。4总结与讨论核mRNP的识别包装依赖于特异性蛋白质-蛋白质和非特异性蛋白质- mRNA的相互作用，这可以解释如何在不区分长度和序列不同的mRNA的情况下鉴定成熟的mRNA。mRNP独特的球状分子结构，对调节核mRNA的表达，维持核浆中mRNA的流动性，并促进mRNA核输出具有重要意义。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05904-0#Sec84创新驱动性能， Azure Biosystems全新推出Sapphire FL，是继革新专利产品Sapphire激光扫描成像系统后的又一力作，实现多通道荧光检测、在线活体成像、突破 fg级检测灵敏度，具有可任意组合、自主更换的激光器及滤光片，开创生物分子成像又一新纪元！Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

真核生物中，Cdc45-MCM-GINS （CMG解旋酶）与DNA聚合酶（Polε）的紧密耦合，是驱动复制起始、维持分叉进程的前提。然而，二者在复制叉上的活动机制在很大程度上尚未可知。近日，香港大学生物科学学院领衔在Nature Communication上发表了题为Synergism between CMG helicase and leading strand DNA polymerase at replication fork的研究文章。通过对酵母前导链复制体的一系列研究，前所未有地阐明了一种CMG解旋酶与Polε的协同工作机制，及其协调DNA解螺旋及合成的动态图景。1酵母前导链复制体的整体结构作者组装了一个前导链复制体复合物，并用低温电镜技术进行研究。结果显示，在此复制体结构中，CMG解旋酶作为核心，将Tof1-Csm3组装到MCM环Mcm6/4/7侧的NTD面，将Ctf4同源三聚体组装到Cdc45和GINS的界面上，而Polε则与MCM环Mcm2/5/3侧的GINS和CTD面结合(补充图2a-e)。从MCM环的NTD层伸出的亲本双链DNA被Tof1-Csm3捕获，并向Mcm6/4/7侧弯曲(补充图2a, c, d, f)。补充图2. 前导链复制体的总体结构（a-c）DNA复制叉上CMG-Polε-Ctf4-Tof1-Csm3复制体的冷冻电镜密度图（侧视图）。（d，e）复制体MCM环的顶部NTD（d）和底部CTD（e）视图。（f） 与（c）相同，但去除Mcm3和Mcm7以突出MCM环内叉DNA的构象。2Polε与CMG MCM环的docking在复制体结构中，Polε通过四个对接位点与CMG相互作用（图1a-d)。在对接位点(DS) 1上，Polε全酶高柔韧性的Dpb2-NTD(残基12-98)稳定地锚定在GINS Psf1(残基161-208)的b结构域上。图1. Polε与CMG解旋酶互作详情图。a–d复制体的冷冻电镜密度图（侧视图）。然而， Polε可能不依赖于Dpb2-NTD而被整合到复制体中。作者构建了一个Dpb2-NTD 敲除的Polε突变体（称为PolεΔ2N）。体外拉下实验（Sapphire激光扫描成像系统检测）显示，尽管亲和力低于野生型，PolεΔ2N仍可与DNA-CMG复合体进行作用（Polε-WT， 图2a，泳道 6-7）。可见MCM环介导了Polε与CMG解旋酶的直接结合，而不依赖于Dpb2-NTD。有趣的是，在没有DNA的情况下，PolεΔ2N与CMG复合体的结合受到严重抑制(图2a，泳道11)；然而Polε-WT则表现出很强的CMG结合亲和力(图2a，泳道10)。此时，Dpb2-NTD与Psf1的相互作用，成为Polε与CMG耦合的必要条件。同时也表明，分叉DNA在调节Polε进入前导链复制体中具有关键作用。图2a. CMG解旋酶体外拉下实验（Sapphire激光扫描成像系统拍摄）3polε- MCM耦合是复制起始的必要条件作者构建了一系列删除MCM结合域的pol2突变体。结果显示，在限制性条件下，同时敲除DS2和DS4（pol2ΔDS2+4）将导致pol2-iAID细胞（可条件性耗尽内源Pol2- aid融合蛋白）无法存活。作者接着进行体外拉下实验（Sapphire激光扫描成像系统，图2a，泳道4-5)。结果显示， Pol2ΔDS2突变体中， PolεΔ2N与DNA-CMG复合体的亲和力显著降低(图2a, 泳道 8)， Pol2ΔDS2+4中几乎完全消失(图2a，泳道9)。在耗尽内源性pol2-aid蛋白后，进行Psf2-Flag免疫沉淀分析。在POL2-WT细胞中，与Psf2-Flag共沉淀的Mcm2和Cdc45仅出现在S期早期；在pol2ΔDS2突变体(图2e, 泳道5-6)中，共沉淀水平降低；在pol2ΔDS2+4突变体(图2e, 泳道7-8)中则被抑制。图2e. Psf2-Flag免疫沉淀实验 （Sapphire激光扫描成像系统拍摄）可见，DS2和DS4对于稳定Polε与MCM环的结合至关重要，稳定的polε- MCM耦合是CMG形成驱动复制起始的必要条件。此外，体外解旋酶实验中（Sapphire激光扫描成像系统检测），无Polε存在时，CMG解旋酶可有效解螺旋分叉的双链DNA (图6b, d)，Polε存在时，只表现出轻微的CMG活性抑制(图6c, d)，表明Polε结合对CMG活性几乎没有影响。体外扩增实验（Sapphire激光扫描成像系统检测）显示，与polε-WT的高水平全长产物相比，PolεΔDS2的复制效率降低，PolεΔDS2+4没有明显的DNA合成(图6g)。不加CMG的对照组中，只有极低水平的DNA合成产物。说明Polε与CMG解旋酶的耦合有助于在前导链的复制延申。图6. b-c. 有无Polε情况下，CMG解旋酶的非变形PAGE分析 d. 复制叉解螺旋效果 f. 纯化的DNA复制相关因子，SDS-PAGE考染显色分析 g. 复制产物的琼脂糖凝胶实验（Sapphire激光扫描成像系统拍摄）综上所述，本研究阐明了复制体的一种内在机制，通过协调CMG和Polε的活动，能够解决复制叉易位过程中的各种障碍、DNA损伤及表观遗传标记。这种解旋酶与DNA聚合酶的周期性耦合机制，或是生物体用于高保真复制基因组的有效策略。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-41506-0关注我们，解锁更多Western Blot新技能，放飞科研无限想象！Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

常规的蛋白质分析实验中，在电泳分离结束后，还需进行蛋白染色、转膜、western blot 等一系列鉴定步骤。In-gel荧光检测技术，突破常规，在电泳分离后即可进行蛋白检测，无需染色和western blot等后续操作。由于免去了凝胶电泳后的一系列操作，不仅大幅缩减了实验时间，有效提升效率并降低试剂耗材等实验成本，同时还能消除转膜、封闭过程中众多因素的影响。In-gel荧光检测的技术原理在于：在凝胶中，蛋白结合复合物的迁移率与未结合的蛋白不同，可被分离开来。使用荧光基团标记其中一种蛋白，样品中该蛋白及其结合复合物的条带均可被检测出来。电泳结束后，使用成像设备（如Azure多功能分子成像系统、Sapphire FL激光扫描成像系统）进行成像检测。目前，In-gel荧光检测在融合蛋白表达、蛋白互作分析、凝胶阻滞实验等方面已具有广泛的应用。— 实验案例：泛素化蛋白互作 —基于In-gel荧光检测方法，对泛素化相关过程进行实验分析。将荧光标记的泛素（Fluorescently labeled ubiquitin，以下简称为FL-Ub）与E1 泛素激活酶（以下简称为E1）和E2 泛素连接酶（以下简称为E2）孵育后进行凝胶电泳分离，并使用Azure 600 多功能分子成像系统进行成像检测。方法荧光标记的FL-Ub与E1、E2 蛋白孵育结合，通过加入非变性SDS缓冲液，分别在0.5、1、2、4、8、16、30、和60min后淬火结合反应。在非变性条件下进行电泳，每个泳道FL-Ub上样量约200ng。电泳结束后，进行In-gel荧光检测：使用Azure 600多功能分子成像系统的 EPI 蓝光光源（472nm激发，513nm采集）进行成像，即可检测FL-Ub及其复合物。结果In-gel荧光检测图像中，可见游离的FL-Ub条带，同时显示，FL-Ub+E1、FL-Ub+E2复合物的量均随反应时间的增加而增加（图 1）。结论In-gel荧光检测，通过荧光标记蛋白，无需染色和Western Blot，即可实现蛋白互作的可视化分析，显著提升了实验效率、有效降低试剂耗材等方面成本。Azure多功能分子成像系统、Sapphire FL激光扫描成像系统为代表的尖端荧光分子成科技，除In-gel荧光检测功能外，其在各类Blots、凝胶、磷屏、微阵列（芯片）、培养皿、活体成像、组织切片等多领域，均具有广泛灵活的应用，将持续为卓越分子成像呈献更多可能！关注我们，解锁更多荧光分子成像新技能，放飞科研无限想象！Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

基于化学发光的western blot 实验技术是目前蛋白质检测的主流方法。此技术的实验原理是样品特异性结合一抗和HRP酶联二抗后，加入化学发光底物，酶催化底物发光。在发光检测环节中，传统方法使用压片（x光片）检测，随着科技的发展，目前主要使用数字化成像系统（如chemiSOLO化学发光成像仪）进行成像检测。化学发光western blot 方法的优势是高达fg 级的检测灵敏度，是确定目的蛋白表达与否的比较常规的定性检测，可用于检测外源蛋白的诱导表达，确认纯化的某种已知蛋白，或进行抗体的验证等。化学发光western blot示意图化学发光western blot实验操作流程较为复杂，需要优化的点也非常多。其中，高背景就是困扰广大科研工作者最常见的问题之一：如整体的高背景将目的蛋白信号淹没；亮点、斑块随机散布在印迹膜上。那么，如何获得目的蛋白低背景、高信号强度（高信噪比）的检测结果呢？答案来了！化学发光western 完美实验的关键技巧：优化蛋白上样量。可进行梯度稀释，确定最佳上样量，也可保证成像仪获取最佳成像数据。选择合适的印迹膜，根据不同实验需求可选择NC膜和PVDF膜。保持洁净，使用前对托盘等设备进行清洗，戴手套处理凝胶，用镊子处理膜等。确认所有的buffer都混合均匀，尤其是封闭液和抗体孵育buffer，若混合不均匀，极易引起高背景，buffer最好过滤后使用。如果背景较高，可使用大剂量的洗涤buffer清洗或者增加洗膜的间隔时间和次数。尝试使用不同的封闭液，某些抗体可能会与封闭液反应引起高背景，某些封闭液可能阻碍抗体和目的蛋白的结合，脱脂牛奶和牛血清白蛋白BSA是最常用的印迹膜封闭液，封闭液可用作一抗的稀释液，减少非特异性条带的出现。可采用点杂交的方法摸索一抗和二抗的最佳稀释比例，能较好的降低背景。不要使用带有叠氮化钠的抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体，因为叠氮化钠会抑制HRP 的活性。使用足够多的底物，确认印迹膜孵育均匀。尝试使用不同底物增加灵敏度和信号持续时间，不同底物适用于不同印迹膜的检测，有的适用低丰度蛋白，有的适合高丰度蛋白；不同底物具有不同反应时间和持续时间，从而影响成像效果。为增加酶活性，化学发光底物使用前需在室温下进行平衡。使用数字成像检测远优于胶片，数字成像的动态范围较宽，不易出现过饱和现象，且具有过饱和提示功能。Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

近日，第十一届慕尼黑上海分析生化展（analytica China ）于国家会展中心（上海）盛大启幕。作为荧光分子成像技术引领者，Azure Biosystems携卓越产品阵容，倾情赴展，重磅亮相！Sapphire FL激光扫描成像系统应用灵活，5个麻醉输出端口，超大样本仓设计，创新实现从分子检测到活体成像的宽广应用。颠覆传统设计理念，基于定制化、用户可自主更换的激光器和滤光片模块，Sapphire FL可轻松满足客户多样化、深入的科研需求。创新黑科技，呈现无损性能：超宽动态范围（EDR）模式， 5μm高精成像，样品多聚焦平面Z轴扫描，成就最佳成像效果。Azure多功能分子成像系统9.1百万像素高清科研级深冷CCD，可提供完美适配期刊要求的高分辨图像。特色的双近红外激光光源，无串色，低背景，更灵敏，对翻译后修饰、共迁移条带检测有绝佳优势。灵活配置，多种型号可选择、可升级。多通道、多模式，多光源配置，具有广泛应用。此外，长景深设计呈现优质数据同时，可兼容小鼠等3D样本。chemiSOLO化学发光成像仪基于创新的超宽动态范围（EDR）模式，轻松实现飞克级高敏成像。独特的浏览器操作界面，无需软件下载，手机、平板、电脑皆可控制。极致精巧，紧凑设计，超省空间。Cielo实时荧光定量PCR仪无光程差，无串扰，无需ROX校准。卓越Peltier温控模块，融合高品质光学科技，实现优异的均一性和重复性。精准分辨1.3倍拷贝数差异，优异的单拷贝基因检测性能。内置触摸屏电脑，简便智能，可远程监控。创新驱动性能，多年来Azure Biosystems始终在分子成像领域深耕不辍、革新砺变。未来，我们将持续以精尖光学科技，加速驱动生命科学发展，赋能科研梦想！活动集锦

3月20日，Azure Biosystems “Sapphire FL激光扫描成像系统新品发布会” 于线上火热召开。会上，众多经销商合作伙伴云集，共同赏鉴此鼎新力作！荧光Western Blot由于可多重检测、可区分分子量相近的蛋白、可精准定量等优势，因而具有更广阔灵活的应用前景。激光扫描成像系统在PMT和APD检测器的加持下，具有出色的量子转化效率及宽广的动态范围，赋能更高的检测灵敏度和强弱信号同时检测的能力，堪称荧光Western Blot的绝配！创新驱动性能，继革新专利产品Sapphire激光扫描成像系统后，Azure Biosystems全新推出Sapphire FL，颠覆传统，实现多通道活体成像、突破 fg级检测灵敏度，具有可任意组合、自主更换的激光器及滤光片，开创生物分子成像又一新纪元！灵活兼容，无限可能4cm高度样品仓，支持较厚样本成像，应用灵活。从各类印迹膜、凝胶、孔板、玻片，到薄层层析、测流免疫层析、琼脂平板、动植物，您所想象，皆可成像。兼容通用的第三方麻醉套装，可同时在线麻醉多只小动物（如小鼠），并实现真正的活体成像。用户可自由组合、自主更换的激光器及滤光片，支持36种标准光学模块组合及多种定制光学模块，不只是全！此外，还具有可灵活升级的化学发光模块，及多种可选的分辨率。Sapphire FL着眼于未来的科研需求，比想象的更远！高阶荧光，卓越性能Sapphire FL具有5-1000μm可选超高分辨率，及从紫外到近红外的超多可选光谱波段。超宽动态范围（EDR）模式下，可获取更宽动态范围，提供最佳定量数据。技术突破，实现了fg级蛋白的精准测定，媲美化学发光灵敏度，可完美替代化学发光Western Blot。Sapphire FL或将引领技术革新浪潮！关注我们，解锁更多Sapphire FL新技能，放飞科研无限想象！Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域30多年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、qPCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

化学发光Western Blot由于其酶促反应的级联放大效应，以及低背景的技术优势，因而具有fg级超高灵敏度，并成为应用十分广泛的蛋白质分析方法。动态范围反应了在不过饱和的情况下，同时显示强信号和弱信号的能力。许多Western Blot实验涉及同一膜上、不同条件下蛋白表达的多个数量级差异，因此，宽广的线性动态范围是精准分析的前提。目前，市面上主流的化学发光成像仪动态范围通常在4-5 log，仍有进一步提升的空间，虽然某些品牌可达6 log，但价格十分昂贵，因而让众多预算有限的实验室望而却步。创新驱动性能，Azure Biosystems洞见市场痛点，全新推出了惊艳想象的化学发光成像仪— chemiSOLO！chemiSOLO在价格亲民同时，更推陈出新，以独创黑科技“EDR模式”（超宽动态范围），呈献非凡性能，诚意十足！chemiSOLO在标准模式下，图像输出为16 bit；而在“EDR模式“加持下，可选择获取18、20、22或 24 bit 图像，以满足客户的不同需求，动态范围最高可达7.2 log！宽广的动态范围可保证一次成像就获取所有信号，即采集弱信号的同时避免强信号饱和，从而实现精准分析。如下图所示，对228pg-66ng的梯度浓度样本进行化学发光成像分析，在普通模式（16 bit）下，低浓度样本弱信号采集时，即已出现4个高梯度样本的过饱和。而在EDR模式（24 bit）下，低浓度样本在更强信号采集时，所有样本均无过饱和现象，完美成像！在拍摄时间方面，随着位深选择的增加，采集时间也相应增加，而在拍摄EDR图像时，软件将显示估计的捕获时间，并允许用户重新选择位深。→应用场景推荐对于有化学发光应用需求、但预算有限的实验室，chemiSOLO堪称“福音”。此外，chemiSOLO也广泛适用于有凝胶成像仪可用、仅需增加化学发光应用的实验室，以及空间有限的实验室。Azure Biosystems关于我们ABOUT USAzure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

2月17日，Azure Biosystems “chemiSOLO化学发光成像仪新品发布会”于线上火热召开，众多经销商合作伙伴齐聚云端，共同鉴证此精彩时刻！此前，化学发光成像市场格局上，价格成本与图片质量的矛盾难以协调：追求高质量的成像结果通常意味着高昂的价格成本，让众多预算有限的新建实验室望而却步。此外，实验室空间宝贵，但通常的化学发光成像系统体积较大。创新驱动性能，Azure Biosystems响应市场需求，鼎力研发出又一革新力作 —chemiSOLO。卓越性能、简便智能、经济小巧，chemiSOLO重塑想象，赋能实验室不一样的非凡体验。01卓越性能强制冷背照式CMOS相机，捕捉高品质高分辨率图像。独特超宽动态范围EDR（Extended Dynamic Range）模式，实现更宽泛的样品成像动态范围。从而获得更高灵敏度和精准度。02简便智能市面上唯一一款无需下载，即可用电脑、平板甚至手机轻松操控的Western化学发光成像仪。直观的软件界面，操作更流畅、简便、智能。03经济小巧更友好的价格，让众多实验室无须高成本预算，即可收获高品质图像的自信。机身重量仅9.1kg, 29.2cm*43.2cm*22.2cm，小巧身材，大大能量。Azure Biosystems关于我们Azure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire系列激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。公司成像设备全球装机＞5000台，用户量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。