Sapphire FL卓越解决方案—助力释放In-Cell Western更多可能

· 细胞培养

将HeLa细胞连续稀释后，以115μL /孔的体积接种于96孔无菌细胞培养板中。培养皿孵育过夜，随后用IFN-α处理4-12列的细胞15分钟。PBS清洗后，方可进行ICW实验。

· In-Cell Western

100%甲醇-20°C固定细胞20分钟后，使用AzureCyto™渗透液孵育5分钟。随后用AzureCyto封闭液室温振荡封闭1小时。根据表1对细胞进行STAT3和/或pSTAT3检测。将一抗与AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C过夜，进行全细胞染色。PBS洗涤后，将AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室温孵育30分钟。PBS冲洗后可进行成像。

表1.孔板列的处理及检测参照表

· 多通道荧光成像

使用Sapphire FL  532nm、685nm和784nm标准光学模块进行成像，分辨率为10µm，焦距设置为+3.00mm。

· 蛋白归一化

为解释孔间的细胞数量及蛋白含量差异，将每孔的目的蛋白信号归一化为该孔的全细胞染色信号值。找出稀释系列中强度最高的全细胞信号值，将其他每孔的信号值除以该最大值，得出每孔的归一化因子。再将每孔的目的蛋白信号除以相应的归一化因子，得到归一化信号值。

pSTAT3在IFN-α作用下表达量增加，有力地证明了结合全细胞染色归一化，ICW可有效捕获强剂量和治疗反应。考虑到孔间的细胞体积差异，全细胞归一化有助于确保数据的可靠性和准确性。值得注意的是，在此ICW实验中，每个扫描通道间信号无串扰，增强了数据的可靠性和完整性。

ICW是深入了解细胞信号和蛋白质动力学的有力工具，在高通量药物和治疗筛选方面具有广泛而重要的应用。结合Sapphire FL此类高灵敏、高性能的先进成像系统，ICW成为一种强大的通用型工具，可捕捉蛋白表达及细胞反应的动态、微妙变化。

Sapphire FL具有5-1000μm可调节分辨率，飞克级检测灵敏度，呈献高质量数据。其兼容多种样本，除了凝胶、印迹或载玻片等平面样本，还支持孔板、培养皿和小型模式生物等厚样本类型。

除多重荧光成像外，Sapphire FL激光扫描成像系统还可灵活实现近红外荧光、磷屏、化学发光及可见光等多功能成像应用，赋能实验室多样化、更深入的科研需求！