Nature主刊！揭示一种新型抗生素磷脂糖转运抑制机制

革兰氏阴性菌中富含脂多糖（LPS）的外膜结构对维持细胞活力至关重要，破坏外膜会增加其抗生素敏感性。外膜组装过程中，LPS需穿过周质空间从内膜运输至细胞表面。此过程依赖于内膜上的脂多糖转运蛋白LptB2FGC，通过水解ATP，将LPS传递给由LptF、LptC、可溶性周质蛋白LptA及整合膜蛋白LptD的周质部分形成的蛋白质桥进行运输。最近发现的大环肽家族被认为可抑制脂多糖转运，且生化实验显示出对不动杆菌的抗性，但仍缺少结构信息以确定这些抗生素抑制LPS转运的分子机制。

冷冻电镜下，大环肽化合物1与LptB2FG和结合的LPS分子形成广泛的接触（图1c）。作者解析了大肠杆菌异源表达及A. baylyi 菌株表达的LptB2FGC复合物在LPS存在下结合大环肽化合物1的结构（图1d），呈现出高度一致性。

图1c、不动杆菌LptB2FG复合物与LPS、化合物1结合的内膜冷冻电镜结构d，转运体腔中不动杆菌LptB2FG与不动杆菌LPS、化合物1结合的冷冻电镜图（白色），与大肠杆菌LPS和1结合不动杆菌LptB2FG的结构叠加。

大环肽化合物的结合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)组成(图2)。这些关键残基的突变会不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同时，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系统成像），监测LPS从LptB2FGC复合物释放向LPtA的转运。结果显示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC复合物释放LPS（图2c），但无法抑制两种突变体复合物（E249K及I317N）释放LPS（图2d）。证实了大环肽-LptFG接触对抑制不动杆菌菌株生长的重要性。

图2. 转运体中化合物1与LPS结合的中间态。a，LptF与LPS及化合物1的三元复合体结构图， c,d, 化合物1可抑制野生型LptB2FGC向LptA转运LPS(c)，但对LptB2FE249KGC或LptB2FI317NGC 无效(d)（Azure多功能分子成像系统拍摄）。e，转运体腔中LptB2FG结合LPS（白色）与LptB2FG-LPS-1结构的叠加图。

作者另外使用冷冻电镜解析了LptB2FG-LPS的结构，结果显示其整体构象和接触几乎与LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）时相同(图2e)。表明该状态可作为抗生素开发的药物作用构象。此外，LptF Arg30和Arg55对不动杆菌中复合物的功能至关重要，可能有助于在运输过程中定位LPS。

作者随后构建了LPS的LpxM缺失突变体，探究不动杆菌LPS的结构改变对化合物1抑制效力的影响。Western Blot实验显示（Azure多功能分子成像系统成像），当化合物1浓度达到抑制野生型LPS运输所需浓度的20倍时，从大肠杆菌ΔlpxM分离的LPS的运输是可能的(图3b)。不动杆菌ΔLpxM LPS对化合物1的易感性比野生型低30倍 ，与此结果一致。由于ΔLpxM菌株毒力较低，因此lpxM缺失可能不会导致体内大环肽的易感性降低。

图3. 化合物1对野生型及ΔLpxM菌株的LPS转运抑制情况。ΔLpxM菌株中分离的LPS使LptB2FGC对1具有抗性。

LptC螺旋是协调LPS运输与ATP水解的重要因素。LptB2FG-LPS-1结构显示，LPS转运过程中，化合物1与LptC TM螺旋具有结合竞争。这解释了化合物3的杀菌效力相当，但其抑制LptB2FGC复合物释放LPS的有效性大不如1和2的原因。

冷冻电镜显示，化合物1和2含有相对较大的取代基，可比化合物3更有效地与LptC TM螺旋竞争。由此推断，LptC TM螺旋缺失时，化合物1、2、3均应抑制LPS的释放。作者随后在体外构建转运实验，通过Western Blot实验（Azure多功能分子成像系统成像）进行验证。与预测一致，化合物3在体外不抑制LptB2FGC向LptA的转运，但1-3在抑制LptB2FG-ΔTM-C对LPS的转运方面具有同等效力(图4d)。          

图4d, 化合物3在体外不抑制LptB2FGC向LptA的转运，但1、2和3在体外抑制LptB2FG-ΔTM-C对LPS的转运。e, 化合物 1以LPS依赖的方式增加LptB2FG、LptB2FGC和LptB2FG-ΔTM-C的ATP酶活性。f, SPA测量显示化合物2在LPS存在而LptC不存在的情况下与Lpt结合。

LptB2FG转运体中的LPS装载可刺激ATP酶活性。由于大环肽在转运体中捕获LPS，因此将化合物1-3添加到LptB2FG和LptB2FGΔTM-LptC复合物中时，均导致ATP酶活大幅增加(图4e) 。可见，化合物与LptB2FG的结合是大环肽发挥活性的关键。临近闪烁分析(SPA)验证了上述结论，且再次验证了1-3均有相当的杀菌效力，以及大环肽靶与LptC TM螺旋竞争结合的作用机制。

总的来说，本研究揭示了大环肽家族的脂质转运抑制机制，揭示了Lpt转运体的可药物构象，并为这类抗生素扩展到其他革兰氏阴性病原体的应用提供了基础。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06799-7

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