四环素类抗生素的测定方法主要包括微生物抑制法、charmⅡ微生物受体分析法、酶联免疫法、分光光度法、毛细管电泳色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等。样品经过提取和净化后，四环素类抗生素可通过薄层色谱或液相色谱进行分离，再采用分光光度、荧光或质谱检测系统进行定量测定。微生物法是一种传统的测定四环素类化合物和其他抗生素的分析方法。微生物通常对四环素类抗生素具有固有的敏感性．对某些四环素别敏感，因而世界范罔内仍然在使用微生物抑制法。蜡状芽孢杆菌ATCC 11778是一种经典的用于分析四环索类的微生物，其对金/霉素的灵敏度为0.005 mg/L，对四环素和土/霉素的灵敏度为0．025 mg/L，对二甲胺四环素的灵敏度为0.001～0.002 mg/L。相对于其他分析方法，微生物抑制法操作简便，价格低廉，不需要精密仪器和复杂的样品前处理过程，因而适合大量样品的筛选。微生物抑制法的最大缺点是不能区分具体的四环素种类，因此也难以进行定量检测。间接酶联免疫法可用来检测牛奶中的四环素类抗生素。四环素牛血清白蛋白共轭物用于抗体制备，同源的四环素-酪蛋白共轭物作为包埋试剂，而羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶作为第二抗体。牛奶样品经离心脱脂，采用磷酸盐缓冲液至少以l：30的比例进行稀释后，直接采用酶免疫法进行测定，检测限可达5 ng/g由于该法所采用抗体与金/霉素有强烈的交叉反应活性，因此，该法虽然不是用来检测四环素类的，但对于金/霉素的检测限也低达5 ng/g。刘智宏等建立了牛奶和鸡肉中四环素、土/霉素、金/霉素和多两环素的ELISA检测方法。该方法对牛奶和鸡肉中四环素的检测限为7μg/L(μg/kg)左右。由于存在交叉反应、假阳性率高等原因，免疫法一般作为四环素类物质检测的初筛方法。

生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最/有效的纯化流程。测定——分子量、PI当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。选择——层析方法若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：1. 使用最/通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。2.用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。3. 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。纯化——大量粗品处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAmlINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。纯化——硫酸氨样品硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最/适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。纯水——糖类分子固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。纯化——膜蛋白膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。纯化——单抗、抗原单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质 Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。纯化IgG抗原最/有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。纯化——重组蛋白重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAmlINE便很适合做粗分离。 Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱/甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血/酶或因子Xa切开。蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF纯化。

植物基因组DNA 快速提取（50 次）概述：本方法可用于植物细胞DNA 的快速提取，可提取107 细胞，其质量能够满足各种分子生物学要求。组成：1．溶液A 1.2ml RNase A 10mg/ml。-20℃保存2．溶液B 60ml3．溶液C 180ml4．溶液D 3ml Resin 用时充分混匀5. 溶液E 50ml 洗液(用前加入75ml 无水/酒精,充分混匀)6．溶液F 25ml TE buffer步骤：1. 组织≤0.1g，液氮研磨，加入0.3ml 溶液B，反复混匀，室温5min。2. 加入0.8ml 溶液C，溶液A 20μl，充分混匀，室温放置20min。3. ≥8000rpm 离心3min。4. 取上清，加入50ul 溶液D，室温放置5min，≥8000rpm 离心1min，弃上清。5. 加入800μl 溶液C，混匀，≥8000rpm 离心1min，弃上清。6. 加入1ml 溶液E，混匀，≥8000rpm 离心30-60s，弃上清。7. 重复步骤6。8. ≥12000rpm,离心30-60s，吸干上清，室温敞开盖晾干约5-10min。9. 取溶液F 200-300μl，混匀，40-50℃水浴3-5min。10. ≥12000rpm 离心30-60s，取上清，即为DNA。注：1. 组织若多，可适当加大溶液B 和溶液D 的用量，其它成份不变。2. 混匀一定要温和，否则DNA 大分子将被打断，而部分降解。3. 适用新鲜组织、嫩组织，尽可能去除叶脉、叶柄。4. 液氮研磨一定要保证组织在研磨过程中形如干粉状。5. 用户可依实验需要，适当调整溶液F 加入量，溶液F 越少，DNA 浓度越高，但产量略有损失，若想最大限度提高产量，可重复步骤9、10。两次所得DNA 可合在一处。

目前二代高通量测序已经成为研究肠道菌群结构常用的一种方法，该方法仅仅可以得到样本中微生物的种类和相对丰度，但是无法拿到具体菌株。古朵生物专注微生态研究和应用，不仅具有二代高通量测序平台，而且还建立了肠道菌群需氧/厌氧分离培养平台，为客户提供高效的需氧/厌氧菌的靶向分离培养服务，帮助客户获得特定菌株。古朵培养的样本人或动物的粪便样本土壤、淤泥等环境样本目标菌株特定数量的特定菌株，比如一株或两株菌样本保存和寄送在客户取样之前，微基生物为客户提供厌氧活菌保存液，客户将采集的新鲜样本放入厌氧活菌保存液中，寄回到微基生物。检测流程1 首先通过二代高通量深度测序技术，检测样本中微生物的种类及其相对丰度。2 确定样本中是否存在客户感兴趣的目标菌株。如果存在，进行下一步实验。3 在确定目标菌株的相对丰度后，通过查阅文献和资料，确定目标菌株的培养条件和培养基。4 利用特定菌的培养基和培养条件，对目的菌株进行培养，同时利用96孔板进行大规模的分离、纯化等反复操作，找到目的菌株。5 对最终纯化好的目的菌株进行菌种鉴定，从基因水平上再次确认目标菌株。检测流程示意图

人体表面和体内都生活着大量的微生物，包括真菌、细菌、古细菌和病毒，其总量甚至超过了人体自身细胞的数量。血液作为人体最为重要的一个组织，起到了输送氧气和营养物质、传导热量以及防止微生物感染的作用。人类的血液由54.3%的血浆、45%的红细胞、0.7%的白细胞和数量不定的血小板组成。过去曾普遍认为在健康人的血液中是不存在微生物的，只有在患有菌血症等疾病的病人血液中才有可能检测出微生物。但是近年来有越来越多的研究表明，在健康人的血液中也存在微生物，并且这些微生物与人体维持着微妙的共生关系。随着高通量测序技术逐渐成熟，对于人体微生物的了解也越发深入，且研究方向主要都集中在肠道微生物上，其次是口腔、眼睛、皮肤、肺、尿道等微生物分布较多的部位。血液作为一个曾一度被认为是无菌的组织，相关的研究则要落后不少。由于血液的组成成分比较复杂，因此在采样过程中需要根据具体的实验需求制定不同的取样方法，比较常见的方法为取全血样本进行实验，或是取血液中不同的组分进行实验。一、全血取样若研究对象为全血中的微生物，且不需要考虑样本中细胞的活性，可以直接将样本放在-80℃冰箱中保存，如果没有-80℃冰箱，可以短期冻存在-20℃冰箱，也可以在取样后加入抗凝剂EDTA或肝素等，或是直接使用含有抗凝剂的血液采集管，将样本与抗凝剂与充分混匀后放在冰箱中冻存。抗凝剂可以有效地阻止血小板聚集，防止发生凝血，保证细胞的形态在较长的一段时间内不会发生变化。若还需要考虑样本中微生物的活性，或是要对微生物进行培养的话，则必须使用抗凝剂防止样本凝固，并将样本存放在室温或是4℃冰箱中。此类样本存放的时间不宜过长，建议尽快进行后续的实验。二、血液中不同组分的取样若研究对象为血液中的血浆、白细胞或红细胞中的微生物，并且不考虑样本中细胞的活性，则建议在取样后尽快加入抗凝剂并将样本离心，此时样本会分为三层，如下图1所示。最上层的淡黄色透明液体为血浆，其中含有水、血浆球蛋白、血清蛋白、无机盐等物质。中间一层白色的薄层为白细胞和血小板，其中主要含有中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞等白细胞以及血小板。最下层主要为红细胞，整体呈暗红色，且为不透明的固体状。按照实验需求取出不同的组分，并尽快将样本冻存在-80℃冰箱中，如果没有-80℃冰箱，可以短期冻存在-20℃冰箱，以便进行后续的实验操作。若还需要考虑血液样本中微生物的活性，或是要对微生物进行培养，则建议在血液中加入抗凝剂后将样本置于室温或是4℃冰箱中，待需要进行实验的时候再离心并取出需要的组分。此类样本的存放时间不宜过长，建议尽快进行后续的实验。

菌体浓度是指单位体积培养液中菌体的含量。常用的菌体浓度的测定方法（细菌计数方法）主要有以下几种：1. 直接计数法这是一种非常简单的检测方法，我们可以利用计数板或计数仪直接得出细菌数目。1.1细菌计数板首先制备细菌悬液，取一定体积的样品细菌悬液置于细菌计数板的计数池内，用显微镜观察计数。根据计数室刻度内的细菌数，计算样品中的含菌数。特点：所需设备简单，测定结果较准确，可迅速得到结果，而且在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征。不能区分是否为细菌，不能区分活细菌和死细菌。单位：个/mL计算方法：（1）25×16的计数板：每毫升细菌数量=（100小格内的细胞数/100）×400×1000×稀释倍数（2）16×25的计数板：每毫升细菌数量=（80小格内的细胞数/80）×400×1000×稀释倍数1.2 电子计数器计数法电子计数器也属于直接计数法，其工作原理类似于血细胞分析仪，测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细菌，当一个细菌通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。计数单位：个/mL特点：该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。2. 活菌计数法常用的有平板菌落计数法（cfu法），其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。取一定容量的细菌悬液，制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每mL原始样品中所含活细菌的总数。特点：此法灵敏度高，是临床微生物检验工作中最常用的活菌计数法。前两种方法会将活与死的细菌全部算入，但是此方法只计算活的细菌。计数单位：cfu/mL（cfu是菌落形成单位，是指由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，是计算细菌或霉菌数量的单位。cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌菌落总数。菌落形成单位的计数方式与前两种计数方式不同，前两种方法会将活与死的细菌全部算入，但是该方法计算活的细菌）。3. 比浊法比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，这是一种光散射测量技术。常用的方法有：3.1 麦氏比浊法McFarland发明了一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管，具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的0.5ml氯化钡（1.17%）加入99.5ml硫酸(1%），所得溶液浊度即为0.5麦氏单位。0.5麦氏浓度菌液是临床微生物药敏实验常用浓度，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.5×108细菌数/mL）。麦氏比浊管可以自己配制，也可购买商品化标准麦氏比浊管，将制备的菌悬液与标准麦氏比浊管比较，与多少麦氏浊度的浊度相同即为多少麦氏浓度的菌液。特点：该方法实际上为目视比浊法，使用肉眼观察浊度，误差较大。单位：mcf（即麦氏浊度单位）。3.2麦氏比浊仪是一种采用麦氏比浊法的自动化分析仪器，以其灵敏、准确、快捷的优点逐渐取代人工法成为细菌浊度测定的主要工具。麦氏比浊仪测量细菌溶液样品并直接显示麦氏单位浊度值，根据国际通用麦氏单位浊度值与细菌数的关系即可换算出细菌浓度。特点：简单快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。单位：mcf（即麦氏浊度单位）。3.3光电比浊法当光束通过悬浊液时, 由于被散射或吸收而降低其透过量，细菌悬浊液的浓度在一定范围内与光密度成正比，与透光度成反比，这就是光电比浊法的依据。常用的有分光光度计法。特点：此方法简单快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样本，不能用此方法。单位：OD值（光密度）。4. 测定重量法此法分为是干重法和湿重法。此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。特点：此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的常用方法。单位：mg/mL5、测定细胞总氮量或总碳量氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。特点：此法适于细胞浓度较高的样品。6、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）ccu是颜色改变单位，以微生物在培养基中的代谢活力为指标，根据培养基颜色的改变来计数微生物数量的单位。以解脲脲原体为例：1、取12只无菌试管，每一管装1.8mL解脲脲原体培养基。2、在第一管加入0.2mL待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2mL加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管。3、37℃培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/mL，即106CCU/mL。特点：这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数；而由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，所以需要用特殊的计数方法，即CCU法。单位：ccu/mL

　　免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。　　　　免疫荧光染色　　　　(1）冰冻切片用0.01moULPBST（或PBS）漂洗或冲洗3次，每次5min。　　　　(2)3%H2O2孵育10min，再用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次5min。　　　　(3)5％一8％的正常动物血清（山羊或马血清）孵育30-60min。　　　　(4）洗掉血清，滴加一抗（0.01mol/LPBS配制），4℃过夜。　　　　(5）吸出一抗，0.01mol/LPBS冲洗3次，每次5min，加入荧光标记的二抗（0.01mol/LPBS配制），4℃过夜。　　　　(6）吸出二抗，0.01mol/LPBS冲洗3次，每次10min。　　　　(7）封片剂封片，荧光显微镜观察照相。典型的实验结果见图20.2B。　　　　注意事项：　　　　(1)由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相，目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。　　　　(2)常用的荧光素有以下几种，绿色荧光：FITC、AlexaFluor488和GFP；红色荧光：TRITC、Cy3、AlexaFluor568&594和MitoTrackerRed；蓝色荧光：Hoechst、DAPI；黄色荧光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。　　　　(3）不同的荧光素激发的波长不同，因此，选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490nm，绿光的激发波长为546nm左右。　　　　(4)荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热。关闭30min后方可再开启。　　　　(5）免疫荧光的组织要求很高，载玻片及盖玻片要干净无杂质。进行荧光染色时，需注意染液的pH、浓度和染色温度，还要避免对荧光有熄灭作用的物质的接触。组织和细胞也有自发荧光，如红细胞中的血红蛋白呈红色荧光，维生素A呈绿色自发性荧光等。

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IF ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。多重免疫组化（mIHC）：主要的技术原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该技术可与高性能染料Alexa Fluor、传统荧光染料和比色检测系统相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大。

一、标本的制作免疫荧光技术在实际应用上主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。免疫荧光直接法可清楚地观察抗原并用于定位标记观察。间接法是在检测样品上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于750例食品样品的检测，结果表明与常规培养法的符合率基本一致。在食品卫生检疫中，荧光标记抗体检测标本的制作应力求保持抗原的完整性，并在洗涤和固定过程中不发生溶解或变性。此外，为了便于抗原和抗体接触形成抗原-抗体复合物，以及有利于观察和记录，要求制作的标本尽量薄，对标本中干扰抗原-抗体反应的物质应充分洗涤除去，以免影响标本的观察以及结果的判定。荧光标记抗体检测标本的制作方法为：①涂片：先将载玻片通过火焰3次，冷却后，挑取被检材料涂布成直径约1cm的圆形涂片，如材料太浓，也可将生理盐水加入被检材料中，混匀后均匀涂片。涂好后，晾干或以电风扇吹干备用；②固定：不同的抗原采用不同的固定剂，一般常用的固定剂为95%～100%乙醇和丙酮，固定的条件温度为37℃、时间为3～15min，某些病毒最好以丙酮在-40～20℃下，固定30min，固定后应随即用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。固定的目的是防止标本从玻片上脱落，以及去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。二、荧光抗体染色方法1、直接法直接法是指用特异荧光抗体直接滴加于待检的标本上，由荧光标记的抗体与抗原发生特异结合（图1-1）。标本中如有相应的抗原存在，即与荧光抗体特异性结合，在镜下可见有荧光的抗原复合物。此法的优点是操作简单、特异性高。其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。                       图1-1　直接法示意图2、间接法间接法是根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体（简称标记抗抗体）的方法（图2-2）。间接法的检测过程分为两步：第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中在37℃下保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体；第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。由于结合在抗原-抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。此外，它只需制备一种荧光抗体就可以检出多种抗原，能用于检测多种动物的多种抗原-抗体系统，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查。此方法的缺点是易产生非特异性荧光，影响结果判断。 图2-2　间接法示意图三、荧光显微镜检查标本经荧光抗体染色后，需要在荧光显微镜下观察。荧光显微镜是免疫荧光化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。在荧光显微镜检查时，首先要选择好的光源或滤光片，滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。激发滤光片的作用是提供合适的激发光。根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过；紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过；紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过；最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板激发。荧光显微镜检查的注意事项：①应在暗室中进行检查，进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出的强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本；②防止紫外光对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；③检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯的发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外光照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h；④荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源，天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源；⑤标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；⑥荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”——无或可见微弱荧光，“+”——仅能见明确可见的荧光，“++”——可见有明亮的荧光，“+++”——可见耀眼的荧光。四、免疫荧光技术在食品检验中的应用食品免疫检测技术是食品分析检测领域的新热点，在残余药物、残余农药、有害微生物等的检测方面取得了显著进展。免疫检测技术是基于抗原-抗体反应的原理对待测物进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、简便等优点。下文将以红细胞抗体混合荧光抗体染色法对食品中沙门氏菌的检测为例，说明免疫荧光抗体在食品检验中的应用。1、原理将抗体球蛋白稀释成2mg/mL，和2%绵羊红细胞1∶1混合（混合后血球成1%），再加依文斯兰2滴（0.1%）。这样的悬液里和血球表面带有沙门氏菌的抗体，加上增菌液，在湿的环境下使抗原和抗体结合，其余的杂质和非特异的物质不与抗体结合，不易固定在玻片上，易被水冲击。因此，有特异性的抗原就能滞留在玻璃片上。红细胞经过鞣化处理后有一定的吸附作用，能将抗体（包括荧光标记的抗体）吸附在血球上，使血球呈黄绿色（如在荧光血清中加依文斯兰可使血球呈红色），这样在玻璃片上呈现出清晰的背景，镜检时见到血球后可鉴定特异性细菌的存在。因为此法有吸附抗体的作用，所以抗原也不易漏去，这是荧光抗体的优点。2、方法（1）取10%戊二醛血球悬液0.3mL于10mL刻度离心管中用2mL生理盐水洗两次（2500r/min，5min）。将沉淀血球配成2%血球悬液，以1∶20000鞣酸生理盐水1∶1混合，置37℃水浴中15min鞣化。（2）将提纯的伽马球蛋白稀释成2mg/mL，和以上血球1∶1混合。此时血球为1%球蛋白，为1mg/mL。（3）将以上悬液涂于玻片上（每片8点），在酒精灯上用火焰干燥固定后，加被检的增菌液于涂片点上，37℃湿盒中30min。（4）冲洗玻片后加沙门氏菌荧光抗血清，37℃，30min在湿盒染色。（5）洗片：用间接法洗较好，待干后镜检。3、结果判定亮度菌量判定亮度菌量判定#++++++++++#++++++++#+±+++±++++++++++-+++++++++-++++±亮度：#　表示菌形清晰，亮环显著，发闪亮黄绿色荧光。+++　表示菌形清晰，亮环显著，亮度较强。++　表示菌形成形，有亮环，亮度较差。+　表示菌体可有些形态，亮环清楚，荧光微弱。-　表示无荧光。菌量：#　表示视野中菌体密布。+++　表示视野中菌体较密。++　表示视野中菌体稀散。+　表示视野中仅见个别菌体或在数个视野中仅见个别少数菌体。-表示无典型菌体。判定：+　表示阳性。±　表示可疑，再做第二次染色如仍可疑做常规。-　表示阴性。

免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。2、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。3、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。4、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。5、选择正确的二抗如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。6、使用合适的细胞密度选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。7、多重染色对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。8、降低背景高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween。9、封片作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品。10、数据分析观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。（5）常用试剂的配制和使用。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。

PBS是磷酸缓冲盐溶液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na ₂HPO ₄ 、KH₂PO ₄ 、NaCl和KCl。PBS缓冲液不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。由于Na₂HPO ₄ 和KH₂PO ₄ 它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。如有需要PBS还可以补加1 mmol/L CaCl₂和0.5 mmol/L MgCl₂，以提供双价阳离子。pbs缓冲液的配制方法含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS－T)配制方法为：称取磷酸/二氢钾(KH2PO4)，磷酸/氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯/化钠(NaCl)，氯/化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。PBS:Phosphate Buffered SalinePBS 1L配方pH7.4：磷酸/二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸/氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯/化钠(NaCl)：8g，氯/化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1Lpbs缓冲液的作用PBS是磷酸缓冲盐溶液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首/选。PBS也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高，就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分，维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性。

生物素，是一个分子量只有244.31Da的小分子，经活化后可与蛋白、抗体等生物大分子结合，不仅可以很好地保持大分子的生物活性，而且与亲和素结合使用时具有多级放大作用，使其广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。那么如何使用生物素标记抗体或蛋白呢？下面古朵给大家分享一下。工具/原料1.10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器2. 恒温箱（37℃）3. 离心机（离心力可达到12,000×g）4. 生物素标记试剂盒（Cata.No:EBLK0002, Elabscience)实验前准备1.仔细阅读使用说明书。2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中）。4.溶解NH2-Reactive Biotin：加入30ulDMF至NH2-ReactiveBiotin瓶中，静置10min，待其充分溶解，此时生物素的浓度为10mM。操作步骤：（本操作步骤按照1mg的量进行标记）1.取1mg待标记抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的Labeling Buffer，使抗体的终浓度为2mg/ml，12,000 x g离心10min。（注：①Filtration tube的最大体积为0.5ml②待标记抗体浓度低时，可先超滤离心一次）2. 加入13.3ul NH2-Reactive Biotin 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。12,000 x g离心10min。3. 加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀，12,000 x g离心10min。4. 操作3重复一次。5. 加0.2ml Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000 x g离心10min。6. 收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体。

干细胞治疗也被称为再生医学，是指利用干细胞及其衍生物来促进受损、病变或功能丧失的组织进行修复。如今，许多白血病等患者已经受益于干细胞治疗。未来，骨关节炎、脑瘫、心脏衰竭、多发性硬化症、甚至是听力损失等都有望受益。干细胞治疗处在生命科学的最前沿，将会引起一场新的医学革命。“10至20年后，干细胞将会成为一种基本的治疗技术，帮助人们解决现在无法克服的疾病”，很多患者认为10年至20年太长，希望干细胞能够早日帮助人类克服疾病带来的痛苦。干细胞研究发展势头猛，间充质干细胞成主流如今，全球干细胞治疗市场已经涌现了大量的新研究、新项目以及新疗法，其中大多数疗法处在研发管线中，少数已经获得了监管机构批准上市。目前正在开展的脐带血干细胞、骨髓干细胞、皮肤干细胞、胎盘干细胞治疗心血管疾病和糖尿病等疾病的研究将为市场的发展打开一扇新的大门。统计发现，间充质干细胞的临床试验涉及上百种疾病。神经系统、心血管和骨科疾病是三类主要的研究领域，占比都在15%以上，总和超过一半。另外，糖尿病、肝脏、肺脏、胃肠道、皮肤和GVHD的比例都在5%左右，是间充质干细胞临床应用的重要研究方向。具体而言，脊髓损伤、多发性硬化、中风、肌萎缩侧索硬化症、老年痴呆症、骨关节炎、股骨头坏死、椎间盘退化、心肌梗死、肝硬化、克罗恩病、间质性肺病、系统性红斑狼疮、勃起功能障碍以及卵巢早衰是研究得较为多的疾病。未来这些患者有望更早地受益于间充质干细胞治疗。目前，国/际上已经有间充质干细胞治疗产品获批上市。根据统计，全球已有超过13项干细胞治疗药物上市，其中绝大多数都属于间充质干细胞产品。随着临床试验的开展，未来会有更多的间充质干细胞治疗产品获批上市，受益的患者也将更多。间充质干细胞无血清培养基，您选对了吗？近几年，随着细胞治疗的进展，对细胞体外培养的关注热度也在不断提高，作为药品监管的细胞制品，跟所有的药品一样，其评价标准也是“安全性、有效性”。因此培养间充质干细胞的培养基，就成为了研究、应用MSC细胞的企业、科研机构的核心关注点。市场上有许多“无血清”培养基，价格从1000-4000不等。弄得用户一头雾水，不知所以。事实上，市场上的“无血清”间充质干细胞培养基产品，可分为三类。第一种是“假的无血清”MSC培养基；第二种是“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基；第三种是“真正的无血清”MSC培养基。培养基购买可以选择古朵生物！

菌落总数检测仪主要用于计数培养基培养出来的菌落群，为压力感应式，适用各种计数笔，压力敏感度可调。独特的按钮设计，计数错误时，可将数值往后退。配有可调节的培养皿支架以及非闪烁式圆形灯管，减少眼睛的疲劳。对于菌落总数的计数方法有很多，今天古朵主要介绍几种常见的：1.染色计数法为弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法，借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。2.比例计数法将已知颗粒浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度，这种计数方法比较粗放，并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。3.液体稀释法对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查大或然数表MPN得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。4.平板菌落计数法这是一种常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。5.试剂纸法在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

通常有白色和棕色：棕色试剂瓶用于盛装容易被光分离的试剂或溶液，如碘溶液、硝酸银、高锰酸钾、碘化钾等。试剂瓶有两种，磨口和非磨口：一般来说，非研磨性试剂瓶用于盛装碱液或浓盐溶液等。橡胶塞或软木塞用于防止试剂结晶或溶解玻璃，导致塞子和瓶口粘结在一起，不易打开。研磨瓶含有酸、非强碱性试剂或有机试剂溶液等。对玻璃的侵蚀较小。使用时，原瓶应装上原瓶塞，瓶与瓶塞的数量应一致，便于密封，以免溶液蒸发，改变浓度。当试剂玻璃瓶不使用时，应将其清洗干净，并在瓶口和塞子之间衬一张纸，以防止它们在长期使用后粘在一起。试剂瓶只能用于盛放和储存试剂：它不能用作加热容器，也不能填充淬火和突然加热试剂，也不能用于制备溶液和长期储存浓碱和盐溶液。试剂瓶有一个大嘴和一个小口。大嘴主要用来装固体，小嘴用来装液体。规格范围从30毫升到20000毫升。使用步骤：选择合适的容量瓶。检查容量瓶是否泄漏。用少量蒸馏水填充容量瓶。关闭塞子后，将容量瓶倒置。将塞子旋转180度，盖上盖子。在步骤2-3之后，如果没有液体泄漏，可以使用。溶解：通过计算，得到制备所需物质和浓缩溶液所需的溶质质量，并取出该质量的溶质。用蒸馏水溶解烧杯中的溶质(注意不同溶质溶解时的操作规范)。等待溶液回到室温。等容溶液转移到带玻璃棒的容量瓶中，用蒸馏水清洗烧杯4-5次。洗涤液也需要转移到容量瓶中。向容量瓶中逐渐加水，直到液面距离划线2-3厘米。换成橡胶头滴管，继续滴水，直到凹面液位刚好接触到刻度线。拧紧塞子，适度摇动容量瓶，使溶液混合均匀。将准备好的溶液转移到试剂瓶中，用于储存溶液。

许多实验室都制定了自己的参考标准 - 付出了很多努力，总是带来错误风险。根据ISO指南34和ISO 17025质量标准生产的标准物质始终能够保证最高级别的色谱安全性和可靠性。参考物质作为色谱参考是必不可少的，以确保样品成分的正确识别和分析数据的准确性。在确保测量结果的准确性和可靠性时，它们是不可或缺的 - 为分析带来信心。错误的阅读可能会导致(有时是严重的)错误的决策，这不仅会带来可观的额外工作量，还可能意味着失去信心和经济损失。大量的工作与错误的风险参考标准解决方案仍主要由研究实验室自行生产，但制造本身就意味着大量的工作。开始是所有原材料的采购和正确存储。严格地说，进口检验必须在这里进行，检查原材料的特性和纯度。但是，经验表明，许多实验室依赖制造商的信息，因此从一开始就有可能在其系统中引入不确定性。储存的化学品必须经常监测并检查其稳定性; 如果物质不能按要求的最小量订购，则可能需要处理剧毒物质。最重要的是，多组分标准溶液的生产在实践中准备了相当多的额外支出，并且还增加了错误风险。为了确定最佳的储存条件，必须研究各溶剂中各组分的相容性和彼此之间的相容性。物质在混合物中的代谢通常难以预测，因此必须用经验值来费力和长时间地确定。最后，标准解决方案的每次重复应用都需要与之前的比较测量。就所使用的参考材料的质量而言，考试实验室正在提出更多的要求。这特别适用于ISO 17025认可的实验室。满足这些要求变得越来越复杂和耗时。ISO标准创造信任作为校准，验证和质量控制的一部分，ISO 17025包含对使用参考材料的测试实验室的能力要求。在ISO 17025的更新版本中，计量可追溯性正在发挥越来越重要的作用。测量的溯源性是其准确性和正确的判断测量不确定度的一个重要先决条件。为了确保在任何地方和任何时间的可比性，必须有一个通用的计量参考这正是定义了什么是正确的。它要求追溯到一个由标准化机构或具有公认能力的制造商提供的定义参考。在德国，认证参考材料的开发是柏林联邦材料研究和测试研究所(BAM)的一项任务; 在美国，认证参考材料由美国国家标准与技术研究院(NIST)开发和提供。购买商业制造商提供的认证参考标准解决方案也是可能的。为了建立对使用参考标准的信任，国际标准化组织在20世纪90年代制定了ISO指南34，该指南通过众多指导原则对参考标准的制定进行规范，并接受严格的测试。作为定期认证的一部分，参考标准制造商必须向当局证明其符合全球质量标准。在德国，认证由德国认证机构(DAkkS)授予。在美国，认证中心是美国实验室认可协会(A2LA)。ISO标准最终确保了所需的可追溯性，并赋予实验室对制造商能力的必要信心。根据ISO指南34和ISO 17025质量标准制造的参考标准被称为ISO指南下的认证参考标准。

 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。1.3 平板划线法最/简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。1.4 稀释摇管法用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。2、用液体培养基分离和纯化大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过95%)表现为不生长。3、单细胞(孢子)分离只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类是稀释法的一个重要缺点。在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(或单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。4、选择培养分离没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，特别适用于从自然界中分离、寻找有用的微生物。自然界中，在大多数场合微生物群落是由多种微生物组成的，从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释法几乎是不可能的。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。4.1 利用选择平板进行直接分离根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如要分离高温菌，可在高温条件下进行培养;要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离;有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。4.2 富集培养富集培养法原理和方法非常简单，利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，很容易地分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。5、二元培养物分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是很难做到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。另外，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。在以上介绍的几种方法中，平板分离法普遍用于实验室微生物的分离与纯化。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

ELISA实验已经做完，做出来的数据是否准确，有没有达到自己的预期，这些都是有很多条件决定的，具体有哪些条件呢，今天就让古朵生物为您介绍！首先要选择优质的试剂优质的试剂是良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有差异，国内医学检验一般均用板式点。 本文将叙述板式ELISA各优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。其次 ，样本的选择可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。最后，注意elisa试剂盒的操作步骤在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

大部分elisa检测均以血清为标本。血清标本可按惯例方法收集，应留意防止溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为符号的ELISA测定中，溶血标本可能会添加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会发生假阳性反应。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃。超越一周测定的需-20℃保存。冻住血清融解后，蛋白质局部浓缩，散布不均，应充沛混匀并防止发生气泡。混浊或有沉积的血清标本应先离心或过滤，弄清后再检测。重复冻融会使抗体效价下跌，所以测抗体的血清标本如需保存作屡次检测，宜少量分装冰存。保存血清自收集时就应留意无菌操作，也可参加适当防腐剂。ELISA试剂盒检测血清的详细留意事项：1) 要留意防止呈现严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因而，在以HRP为符号酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很简单在温育过程中吸附于固相，然后与后边参加的HRP底物反应显色。2) 冰冻保存的血清标本须留意防止因停电等形成的重复冻融。标本的重复冻融所发生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子发生损坏效果，然后引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应留意，不要进行剧烈振荡，重复倒置混匀即可。3) 标本在保存中如呈现细菌污染所造成的的混浊或絮状物时，应离心沉积后取上清检测。4) 样本的收集及血清别离中要留意尽量防止细菌污染，一则细菌的成长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白发生分化效果;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作符号的测定方法发生非特异性搅扰。5) 血清标本如是以无菌操作别离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则主张冰冻保存。样本的长期保存，应在-70℃以下。

中文名称:琼脂培养基B英文名称：Agar medium B(Casein soya bean digest agar)供应商：古朵生物产品规格：250g保质期：3年用途:一种通用的营养培养基,用于各种微生物的培养。用法称取本品 45.0g,另取聚山梨酯 80(吐温80)10g,加热搅拌溶解于 1000ml 蒸馏水中,分装,121℃高压灭菌 15 分钟,备用 。琼脂培养基B微生物灵敏度试验:按标签用法制备培养基，接种以下质控菌株，放置30-35℃需氧培养18-24小时。注：回收率计算时，用TSA琼脂做对照培养基。

仪器、耗材 玻璃瓶烧瓶　　实验步骤　　一、过夜培养　　1.  将5 ml预热的液体培养基移入一无菌的16 mm或18 mm管中。　　2.  用接种环挑一个单菌落，浸没于培养液中并轻轻振动接种环，使待接种的细菌分散在培养液中。　　3.  盖好试管，在摇床或转鼓式培养装置上以60 r/min速度，于37°C培养至饱和（1X109~ 2X109 细胞 /ml，>6 h）。　　二、大体积培养　　1.  在一无菌的Erlenmeyer或baffle瓶中，用新鲜预热的培养液按I1: 100的比例稀释过夜培养物，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。如果不摇动培养，所用烧瓶的体积应比培养液体积大20倍以上，以确保足够的通气。　　2.  37°C，剧烈摇动培养（约300 r/min)。　　三、利用计数板监测生长情况　　1.  用一片干净的盖玻片盖住一片干净的计数玻片（或者血球计)。　　2.  小心地将一小滴培养液滴到盖玻片的边缘，这样培养液可扩散人盖玻片下。　　3.  在相差显微镜400倍下观察，并且按一个小方块中所见的每个细菌大约相当于2X107 细胞/ml计算细菌浓度。　　四、利用分光光度计监测生长情况　　因为仪器的差异性，分光光度计应该用一已知浓度的培养液进行校准。　　1.  测OD600。为了获得一个准确的读数，稀释培养液至OD600＜1。　　2.  按每0. 1 OD值大约相当于108 细胞/ml计算细菌浓度。

无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏抗体和重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而降低抗体的结合能力，也加快了抗体球蛋白和重组蛋白的降解速度。抗体和重组蛋白保存得当与否，直接决定了抗体和重组蛋白的活性使用效果，如果保存得当，抗体和重组蛋白活性大部分都可以维持数年。1. 收到抗体和重组蛋白后的操作收到抗体和重组蛋白后（大部分抗体和重组蛋白是溶液态），请务必在 4℃，12000rpm，离心 3 分钟，再打开管盖进行分装、溶解和保存（如果抗体和重组蛋白体积小于 50?l，请延长离心时间至 5 分钟，以保证全部抗体和重组蛋白均离心下来，干粉状态的同样适用）。抗体和重组蛋白使用特制的储存管，只有在 12000rpm 离心 3 分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体和重组蛋白全部离心下来（即使是在 10000rpm 离心也会离心不完全，导致出现抗体和重组蛋白的量不足的现象）。请详细阅读说明书，并按照推荐的保存条件正确保存和使用抗体和重组蛋白。2. 抗体和重组蛋白的长期保存对于 大部分抗体和重组蛋白，比较合适的保存方式是：抗体分装后保存在 -20℃，重组蛋白分装后保存在 -80℃。（1）分装可以-大程度的降低反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体和重组蛋白造成的污染可能性。（2）分装的量以一次实验用完为好，少不能少于 10 ?l 每份。因为分装体积越小，抗体和重组蛋白的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。（3）复融后的分装抗体和重组蛋白如果一次用不完，将剩余母液保存在 4℃，避免再冻起来。（4）抗体和重组蛋白工作液应该当天配制当天用完，4℃ 保存尽量不要超过 1 天。（5）绝-对避免将抗体和重组蛋白保存在自动除霜冰箱中，将抗体和重组蛋白保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。3. 抗体和重组蛋白的短期保存大部分 的抗体和重组蛋白收到后 4℃ 短暂保存 1~2 周，对抗体和重组蛋白活性没有影响。如果抗体和重组蛋白很快会使用（1~2 周内），推荐在 4℃ 保存，这是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害。关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体和重组蛋白。4. 抗体和重组蛋白的运输条件一般的运输过程需要 1~2 周的时间，所以是在低温 4℃ 的条件下来完成的。4℃ 运输主要的目的是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体和重组蛋白是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中一般避免干冰运输。5. 抗体和重组蛋白的稳定性（1）抗体的稳定性是自然界长期进化的结果，抗体是免疫系统中重要的分子之一，其稳定性是自然进化筛选的结果，在众多物种中，抗体分子形成了保守而稳定的结构。（2）抗体的高Tm值，在室温下，甚至短时间温度达到 50~60℃，抗体分子都能维持正确折叠，保持其应有的活性。（3）抗体和重组蛋白的纯度。 采用先进的抗体和重组蛋白纯化技术，确保抗体和重组蛋白产品的高纯度，保障其抗体和重组蛋白产品的稳定性。（4）抗体和重组蛋白的浓度。高浓度的抗体和重组蛋白产品可减少容器表面吸附造成的物质损失，高浓度的抗体和重组蛋白稳定性更好。 大部分抗体和重组蛋白浓度为 1mg/ml，抗体和重组蛋白纯度高，特异性好，效价更高。6. 重组蛋白的特性重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在 -80℃ 条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。（1）原核细胞表达的重组蛋白。 大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白 100?g，用 86?l 的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。（2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。（3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加 8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。

■ 背景介绍：肿瘤微环境（TME，tumor microenvironment）是液体、免疫细胞及包裹肿瘤的血管所组成的混合体，肿瘤细胞与TME之间的相互作用能够帮助决定肿瘤的进展和命运；因此，理解TME的组成和功能对于有效抑制癌症进展至关重要。古朵的多色标记免疫荧光染色试剂盒针对肿瘤微环境研究，开发有包含CD8，CD4，FoxP3指标的多重荧光免疫组化染色试剂盒。该产品为三标四色试剂盒，包含3个抗体和细胞核染料，50片/盒（以100ul/片用量计算）。■ 检测原理：多标记免疫荧光染色是基于抗原、抗体特异性结合的原理，选用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗抗体，对试剂盒中的荧光染料进行活化，将信号共价结合到抗原上。借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色。■ 产品组成：CD4 兔单抗、CD8 兔单抗、FoxP3 兔单抗、单色荧光染料-TSA520、单色荧光染料-TSA570、单色 荧光染料-TSA650、单色荧光染料-DAPI、信号放大反应液、鼠兔通用型 HRP 标记二抗、碱性抗原修复液-粉 末、抗体稀释液/封闭液。■ 检测试剂及设备：1、所需材料：1000W 以上可调功率的微波炉，至少有 5 个以上的档位，移液器、恒温干燥箱、免疫组化笔 （abs929）、修复杯、染色缸、计时器、孵育湿盒、盖玻片、通风橱、洗瓶、荧光显微镜。2、所需试剂：DMSO（abs9184）、灭菌去离子水（abs9259）、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、TBST（abs952） 或 PBST（abs9340），荧光封片剂（abs9236）。3、试剂准备： （1）. TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl （pH 7.5），150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)（2） 碱性抗原修复液：20X 碱性抗原修复液用灭菌去离子水按照 1：19 比例稀释（3）. 抗体稀释液：可做抗体稀释和封闭使用，即用型（4）. 一抗工作液：用抗体稀释液按照下表稀释（5）. 二抗工作液：二抗工作液为即用型鼠兔双抗（6）. TSA 荧光染料染色工作液：TSA 系列单色荧光染料为 100X 母液，使用前用信号放大反应液稀释用 1：100 稀释，配好的工作液 4℃保存，仅限当天使用。（7）. DAPI 工作液：DAPI 使用无菌水按 1:100 稀释制备工作液4、检测设备：荧光显微镜或荧光全片扫描设备，TSA 系列荧光染料适用的激发和发射滤光片应符合下表中的建议。古朵的多标记免疫荧光染色试剂盒，满足您的多指标免疫荧光共定位研究，您也可委托我们进行染色服务哦！

常用标准溶液(水溶液)的配制和标定1 标准溶液的标定用优级纯以上的酸、碱或强溶解性的相应盐类等基准物质,用双重蒸馏去离子水溶解于容量瓶中,并定容至所需的贮备溶液,浓度为(mol/L),并按要求选取洁净容器盛装,贴好标签,按规范要求贮存。2 标定物质应选用基准物质的纯试剂作为标定物质,标定前应干燥至恒重,并准确称取。3 标定过程标准溶液在标定过程中,严格执行2人双平行标定,用精确的标定物,对标准溶液进行标定、计算,在误差很小,数据又相当接近的情况下,则取平均值为该标准溶液的浓度。4 标定时间常温下1.000mol/L及以上浓度贮备液,应每2a标定1次；0.5000mol/L浓度贮备液,应每1a标定1次；0.1000mol/L浓度贮备液,应每6个月标定1次；低于0.1000mol/L浓度的应用液,应每3个月标定1次。注意事项自配制的标准溶液作为工作标准溶液的,一般用于日常检验分析,不用于其他具有法律效应的检测结果。除非能够证明其作为测量参考标准的性质不会失效。有机溶液的标准物质在贮存过程中,应避免标准溶液与塑料胶木瓶盖直接接触。对使用量较大的自配的标准贮备原液,必要时与有证的、并在有效期内的标准物质进行比对,避免发生化学变化,以确保自配标准溶液量值的准确性。

英文名称    DPF2    中文名称    双PHD-D4锌指蛋白2抗体    别    名    zinc and double PHD fingers family 2; Apoptosis response zinc finger protein; BAF45D antibody BRG1-associated factor 45D; D4 antibody D4 zinc and double PHD fingers family 2; DPF 2; DPF2; MGC10180; Protein requiem; REQ; REQU_HUMAN; Requiem; Requiem apoptosis response zinc finger; UBI D4; UBID 4; UBID4; Zinc finger protein ubi d4; Zinc finger protein ubi-d4.    供应商     古朵生物    研究领域    细胞生物  信号转导  细胞凋亡  转录调节因子  锌指蛋白  表观遗传学      抗体来源    Rabbit    克隆类型    Polyclonal    交叉反应    Human, Mouse, Rat, Chicken, Cow, Rabbit,     产品应用    WB=1:100-500 ELISA=1:500-1000 IP=1:20-100 IHC-P=1:100-500 IHC-F=1:100-500 IF=1:100-500 双PHD-D4锌指蛋白2抗体（石蜡切片需做抗原修复） not yet tested in other applications.optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.    分 子 量    44kDa    细胞定位    细胞核 细胞浆     性    状    Lyophilized or Liquid    浓    度    1mg/1ml    免 疫 原    KLH conjugated synthetic peptide derived from human DPF2/D4 zinc and double PHD fingers family 2    亚    型    IgG    纯化方法    affinity purified by Protein A    储 存 液    Preservative: 15mM Sodium Azide, Constituents: 1% BSA, 0.01M PBS, pH 7.4    保存条件    Store at -20 °C for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at -20°C. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent of antibody the antibody is stable for at least two weeks at 2-4 °C.    双PHD-D4锌指蛋白2抗体产品介绍    background:May be a transcription factor required for the apoptosis response following survival factor withdrawal from myeloid cells. Might also have a role in the development and maturation of lymphoid cells.Function:May be a transcription factor required for the apoptosis response following survival factor withdrawal from myeloid cells. Might also have a role in the development and maturation of lymphoid cells. Subcellular Location:Nucleus. Cytoplasm. Note=30% nuclear. 70% cytoplasmic.Tissue Specificity:Ubiquitous.Similarity:Belongs to the requiem/DPF family. Contains 1 C2H2-type zinc finger. Contains 2 PHD-type zinc fingers. Database links:UniProtKB/Swiss-Prot: Q92785.2Important Note:This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.    

想要研究蛋白质，首先要得到高度纯化且具有生物活性的目的物质，因此，蛋白样品的制备是重要前提。蛋白提取的质量和效果对后续的研究分析有重要影响。不同种类的样本在制备过程中，存在一些差异，要根据样本特征调整实验方案和操作细节。基本原则样品处理尽量简单，减少蛋白损失；尽量避免蛋白的降解；尽可能提高样品蛋白的溶解度；防止溶液介质中对蛋白质的人为修饰；去除非蛋白杂质。制备过程蛋白质的制备一般要经过以下四个阶段：选择材料和预处理，材料的破碎，提取和纯化，浓缩、干燥和保存。由于蛋白种类繁多，性质差异较大，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。根据性质进行分类，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。制备原理蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、 pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。①温度：多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。②pH：蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的 pH值应选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。③离子强度：稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量 NaCl 等中性盐，一般以 0.15 摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用 0.02-0.05M 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。制备方法破碎的方法有许多种，可归纳为：机械法（超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法和玻璃珠破碎法），化学法（去污剂法、酶裂解法、），物理法（循环冻融法、渗透法、高压法）。这些方法有不同的应用范围，基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解变性，这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。而常用的方法有：超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法、盐析、沉淀法。其中，有机溶剂沉淀法使用较为普遍，常用的有机溶剂有丙酮、苯酚等。冷丙酮沉淀丙酮和苯酚沉淀法注意事项：1.冷丙酮沉淀的时间与温度。常温或升温时，蛋白立体结构展开，丙酮极容易与其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸进行疏水结舍导致蛋白变性，所以我们通常预冷丙酮并且低温操作。2.超声功率和时间，重在观察超声后样品溶性的均匀度。3.一般和三氯乙酸一起使用，效果更好。4.还原烷基化。苯酚提取1.各种试剂的正确及精确配制。（如：煎糖提取液）2.加入饱和酚后要充分震荡和离心。（使蛋白充分与酚、色素H键结合，让其分三层）3.需纯化蛋白。（甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯酚等杂质）注意事项1.在蛋白质制备过程中使组织始终置于冰上，离心机、离心管等仪器设备要提前预冷，以防蛋白质的降解。2. 要加入适量的裂解液，裂解一定要充分，均匀。3. 植物和动物组织样本一般采用研磨或匀浆机破碎处理，细胞和菌体样本一般采用超声破碎，破碎过程中要避免材料的融化。4. 对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存（－80℃），对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。5. 对于样本量需求少的研究，且组织样品本身非常细小，可直接裂解，减少蛋白损失。

⒈光合菌群： EM菌液中的光合菌群（好氧性和厌氧性）属于独立营养微生物，它能利用土壤接受太阳热能或以紫外线为能源，将土壤中的硫化氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害物质为无害物质，并以植物根部的分泌物、有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氮等为基质，合成糖类、氨基酸、维生素类、氮素化合物和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。光合菌的代谢物质或者被植物直接吸收，或者成为其它微生物繁殖的养分，光合细菌如果能够增殖，其它的有益微生物也会增殖。⒉乳酸菌群： 乳酸菌（厌氧型） , 它以摄取光合细菌酵母菌产生的糖类等物质为基础，产生乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用，它将未腐熟的有机物质转化成对动植物有效的养分。乳酸菌还能有效抑制连作障碍产生的致病菌增殖。⒊酵母菌群： 酵母菌（好氧型）利用氨基酸、糖类及其它有机物质，通过发酵，产生出促进细胞分裂的活性化物质。酵母菌在 EM 集团军中对于促进其它的有效微生物增殖所需要的基质（食物）的生产提供重要的营养保障。此外，酵母菌生产的单细胞蛋白是动物不可缺少的有效养分。⒋革兰氏阳性放线菌群（好气性）。 它从光合细菌中获取氨基酸、氮素等作为基质，产生出各种抗生物质、 维生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌混合后的净菌作用比放线菌单兵作战的杀伤力要大得多。它对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等具有降解作用，并容易被动植物吸收，增强动植物对各种病害的抵抗力和免疫力。放线菌也会促进固氮菌和 VA 菌根菌增殖。⒌发酵系的丝状菌群（嫌气性）。 以发酵酒精时使用的曲霉菌属为主体，它能和其他微生物共存，尤其对土壤中酯的生成有良好效果。因为酒精生成力强，能防止蛆和其他害虫的发生，并可以消除恶臭。由上可见，各类微生物都各自发挥着重要作用，核心作用是光合细菌和嗜酸性乳杆菌为主导，其合成能力支撑着其他微生物的活动，同时也利用其他微生物产生的物质，形成共生共荣的关系，保证 EM菌液状态稳定，功能齐全 ，发挥出集团军作战的强大能量。 EM菌液的主要功能是造就良性生态。只要施用恰当，它就会与所到之处的良性力量迅速结合，产生抗氧化物质，清除氧化物质，消除腐败，抑制病原菌，形成适于动植物生长的良好环境，同时，它还产生大量易为动植物吸收的有益物质，如氨基酸、有机酸、多醣类、各种维生素、各种生化酶、促生长因子、抗生素和抗病毒物质等，提高动植物的免疫功能，促进健康生长，从而在减轻劳动、降低成本、提高产量、改善品质，提前上市，使人们吃（用）上无污染的高质量产品的前提下，提高全社会的生产水平和生活质量，保护地球环境和人类美好的家园。

对培养的NK细胞不满意，是培养基的问题，还是试剂盒的问题？关于NK细胞培养的问题，不能只认为培养基不好或试剂盒不好，很多客户在培养过程中遇到接种密度的问题、补液程序的问题、血浆问题以及样本的问题，所以影响NK细胞培养效果的因素非常之多，下面远慕生物为大家进行排查。1、血液样本问题首先确认样本的状态，理论上来讲外周血样本应在抽取的6个小时内进行细胞分离，这个时段细胞是处于最好的状态，所以培养前请确认样本是否新鲜，以及血液是否出现溶血现象血液样本保存时间过长，会导致单核细胞无法成功诱导激活。血液如在运送过程中溶血，则可能导致血浆分离出现问题，无法后期培养添加。如用冻存的单个核细胞复苏培养，请确认复苏单个核细胞的活率及状态。2、接种密度问题请确保接种的密度在1.5-2x106cells/m L，过低密度会导致细胞前期增殖缓慢，无法达到补液要求。3、血浆的处理及添加方式（1）血浆必须要56℃灭活30min，除去多余的纤维蛋白，如有可能冷冻后离心，保证细胞培养时添加的血浆不会有纤维蛋白析出粘连正常细胞。（2）如有可能有更多剩余的血浆，可在后期补入，对于有些状态较差的样本会有更好的培养效果。4、补液原则问题NK培养受样本差异性影响会很大，所以没有一个固定的补液程序可以指导各种不同的样本。有的样本激活迅速，生长快速，补液就相对容易，也更好扩增，可有的样本前期就长的较慢，如遇到肿瘤患者晚期年老的病人，更是难上加难，所以针对不同的样本，我们应该有不同的应对原则：（1）首先7天以后的补液原则是补液后细胞密度应在0.5-0.8x106cells/m L，如密度达不到，请延迟一天后再进行补液，否则当你细胞补液密度过低时，好的样本可以长起来，那差的样本就会逐渐凋亡，无法继续培养。（2）对于差的样本，适当增加血浆的添加次数，可以得到更好的效果，比如标准程序需要加3-4次血浆，那么有可能的话你可以加到5次。5、操作原因（1）补液培养基的温度培养基补液前应提前预温，过冷的培养基会导致细胞应激反应，出现絮状物；（2）培养箱环境的剧烈变化培养箱异常，温度及二氧化碳浓度变化较大会导致细胞死亡，出现絮状物；（3）细菌、真菌、支原体污染受到细菌、真菌、支原体污染的细胞生长非常缓慢，甚至不生长；（4）因子试剂盒经过了反复的冻融反复冻融会大大降低因子的活性，激活、诱导、扩增等环节都会出现问题，达不到最优的效果。

原代细胞因它可以模仿人体的新陈代谢逐日成为科研学者青睐的研究工具，但是原代细胞曾是出了名的难培养，需要耗费大量的时间、成本和资源。即使细胞捱过了极其严苛的解离步骤，但污染仍然是一个隐患，有可能让几天的成果化为乌有。此外还存在其他细胞污染、生长缓慢以及数量有限的问题。细胞系因容易培养且产量可观而成为研究首-选。然而，它们并不完-美。细胞系会不断突变。连续传代导致它们的基因型和表型发生变化。有时候，它们已经变得面目全非。一个研究小组曾经发现，HEK293细胞系的腺病毒转化产生的细胞更接近未成熟神经元，而不是人胚肾细胞。于是hTERT、PSC和iPSC来源的永生化细胞应运而生，他们 并不是真正的原代细胞，但是他们却能表达出大部分原代细胞应有的特性例如：强制表达hTERT让原代细胞能维持足够的端粒长度，避免增殖性衰老。hTERT诱导的原代细胞不但具有连续传代的能力，而且没有染色体不稳定性。这种细胞可以扩增，也可以冷冻、保存和解冻，以适应实验的时间安排，但是它只是延缓了细胞的衰老，增加了传代的次数，并不是表示细胞可以像hela一样“长生不老”。PSC和IPSC也是一样的，PSC的真正价值在于能够从一种细胞分化成多种细胞类型。iPSC让研究人员能够采集轻松获取的细胞，并将它们转变为不易获取的细胞，但是预实验和验证实验结果一般建议使用原代细胞，因为没有经任何修饰的细胞才能得到实验最为精确的数据。