关于名义荧光染色和注意事项介绍

　　免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
　　
　　免疫荧光染色
　　
　　(1）冰冻切片用0.01moULPBST（或PBS）漂洗或冲洗3次，每次5min。
　　
　　(2)3%H2O2孵育10min，再用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次5min。
　　
　　(3)5％一8％的正常动物血清（山羊或马血清）孵育30-60min。
　　
　　(4）洗掉血清，滴加一抗（0.01mol/LPBS配制），4℃过夜。
　　
　　(5）吸出一抗，0.01mol/LPBS冲洗3次，每次5min，加入荧光标记的二抗（0.01mol/LPBS配制），4℃过夜。
　　
　　(6）吸出二抗，0.01mol/LPBS冲洗3次，每次10min。
　　
　　(7）封片剂封片，荧光显微镜观察照相。典型的实验结果见图20.2B。
　　
　　注意事项：
　　
　　(1)由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相，目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。
　　
　　(2)常用的荧光素有以下几种，绿色荧光：FITC、AlexaFluor488和GFP；红色荧光：TRITC、Cy3、AlexaFluor568&594和MitoTrackerRed；蓝色荧光：Hoechst、DAPI；黄色荧光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。
　　
　　(3）不同的荧光素激发的波长不同，因此，选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490nm，绿光的激发波长为546nm左右。
　　
　　(4)荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热。关闭30min后方可再开启。
　　
　　(5）免疫荧光的组织要求很高，载玻片及盖玻片要干净无杂质。进行荧光染色时，需注意染液的pH、浓度和染色温度，还要避免对荧光有熄灭作用的物质的接触。组织和细胞也有自发荧光，如红细胞中的血红蛋白呈红色荧光，维生素A呈绿色自发性荧光等。