超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST-1法） 微量法

超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST-1 法）说明书

微量法

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：使用前先离心再吹打混匀，根据样本数量取试剂二，用灭菌水稀释 10 倍后使用。

2、 试剂五：临用前将试剂四加入试剂五中，并震荡溶解。4℃保存 3 个月。

产品说明：

SOD（EC 1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成 H₂O₂和 O₂。SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是 H₂O₂主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O₂-)，O₂-可与 WST-1 反应生成水溶性黄色甲臜，后者在 450nm 处有吸收峰；SOD 可清除 O₂-，从而抑制了甲臜的形成；反应液黄色越深，说明 SOD 活性愈低，反之活性越高。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、电子天平、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）=500-1000:1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液）超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）样本：直接检测，若有浑浊可离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 测定前将试剂一、三和五 37℃水浴 5min 以上。

3. 加样表（按顺序在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂）

充分混匀，37℃水浴 30min 后，450nm 处测定各管吸光值 A。分别记为 A 测定、A 对照、A1 空白、A2 空白，，计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 空白=A1 空白-A2 空白。（空白管 1 和空白管 2 各只需做 1~2 管；每个样本有一个对照管）

三、SOD 活性计算

1、抑制百分率的计算

抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%

尽量使样本的抑制百分率在 30-70%范围内，越靠近 50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于 30%或大于 70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样本；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高加样表中的样本量，但需相应减少测定管和对照管中蒸馏水的体积。

2、SOD 酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为 50%时，反应体系中的 SOD 酶活力定义为一个酶活力单位。

3、SOD 酶活性计算：

（1）血清（浆）SOD 活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷V 样×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F

（2）组织、细菌或培养细胞 SOD 活力计算：

a.按样本蛋白浓度计算

SOD 活性（U/mg prot）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷(V 样×Cpr)×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

b.按样本质量计算

SOD 活性（U/g 质量）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷(W×V 样÷V 样总)×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

c.按细菌或细胞数量计算

SOD 活力（U/10⁴ cell）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷(500×V 样÷V 样总)×F

=0.022×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：加入反应体系中的样本体积，0.018mL；V 样总：加入提取液体积 1mL；Cpr：蛋白样本浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 样本和试剂二使用时在冰上放置。

2、 样本较多时，可按表格配制工作液（包含试剂一、二、三），试剂五必须最后加入。

实验实例：

1、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清稀释 100 倍，按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.323-0.079=0.244，ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.507-0.077=0.430，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%=43.26%，按样本质量计算酶活得：

SOD 活性（U/g 质量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =8470.5 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！