随着针对PI3K通路的新疗法的批准,PIK3CA突变的检测已成为HR+/HER2- 转移性乳腺癌 (MBC) 治疗管理的关键因素。法国雷恩第一大学尤金马奎斯癌症中心在《Scientific Reports》上发表了一篇文章,该文章采用naica®微滴芯片数字PCR系统开发了多重PIK3CA突变检测技术。该技术可同时检测21种PIK3CA突变,并进行绝对定量,解决了当前对乳腺癌患者的21种PIK3CA致病突变进行快速、高灵敏、有效检测的难题。
亮点
1.在naica®微滴芯片数字PCR平台,使用液体活检技术对21种PIK3CA突变进行定量检测。
2. 通过对大量的肿瘤实体样本和cfDNA样本进行检测验证,获得了83.1%的一致性,确定了此方案的临床有效性。
3.naica®微滴芯片数字PCR系统检测方法的高灵敏度和稳定性,能够快速、经济、有效地对乳腺癌中最常见的PIK3CA致病突变进行绝对定量,覆盖率达90%。
检测方式
利用naica®微滴芯片数字PCR系统(Stilla Technologies),结合Drop-off检测方法,设计了一种可以同时检测21个PIK3CA突变的方法。在阳性分析案例中可精确识别PIK3CA突变。通过分析来自213个 HR+/HER2- MBC样本的血浆循环游离DNA (cfDNA) 以及从89名患者的97个可用匹配肿瘤中提取的DNA,确定了此方案的临床有效性,并在cfDNA分析和相应肿瘤样本分析之间获得了83.1% 的一致性。
该技术采用两种Assay配合三步诊断策略(图1,图2),首先进行PIK3CA突变初步筛选,如果没有PIK3CA突变,则认为标本为阴性。在阳性结果的情况下,进行第二步检测集中于四种最常见的PIK3CA突变,并进行WT-MUT Duplex联合分析确定阳性突变位点。
图1左:PIK3CA突变检测的两种多重检测方法设计图。(a) PIK3CA Assay n°1设计图:使用四对引物(灰色箭头)同时扩增N345K、C420R、 H1047L和H1047R。使用Drop-off方法检测542-546突变。(b) Drop-Off 542-546检测原理: WT序列由HEX标记的Drop-off探针和cy5标记的reference探针检测,产生一簇HEX-Cy5双阳性微滴(2D点图上为黄色簇);而542 - 546密码子上带有突变(MUT,红色叉)的序列则无法与Drop-off探针结合,只和reference探针结合,生成单阳性微滴(2D点图上的红色簇) (c) PIK3CA Assay n°2设计图:使用两对引物同时扩增两个序列,使用FAM探针标记野生型(WT)序列,使用HEX探针标记E542K和E545K突变,使用FAM和Cy5探针标记H1047L突变,使用Cy5探针标记H1047R突变;图一右:三步诊断策略。
图2:使用PIK3CA检测在患者cfDNA样本上鉴定PIK3CA突变示例。(a)四种最常见的PIK3CA 突变(E542K、E545K、H1047L和H1047R)的2D图结果,首先使用PIK3CA Assay n°1检测,各自的MAF为16.86%、4.17%、17.13%和1.97%。并使用PIK3CA Assay n°2确认,各自的MAF分别为17.40%、5.25%、19.55%和1.97%。(b)其他突变(N345K、C420R、Q546K、Q546P和Q546R)的2D图结果,首先使用PIK3CA Assay n°1检测,各自的MAF为4.00%、3.83%、35.02%、1.16%和39.2%,并使用WT-MUT Duplex方法确认,各自的MAF分别为6.99%、6.50%、36.84%、0.71%和43.89%。
结果分析
结果显示,213份血浆中68名患者(32%)至少有一种突变,这与文献中普遍报道的结果一致。有6例患者每个样本有2个突变,共发现74个突变。在本文的检测方法可能检测到的21个突变中,有9个在血浆样本中检测到(图3a、b)。此外,本方法检测的相对频率与COSMIC数据库中列出的频率相当一致,该方法能够快速、经济、有效地对乳腺癌中最常见的PIK3CA致病突变进行绝对定量,覆盖率达90%
图3:213例HR + /HER2−转移性乳腺癌患者血浆中PIK3CA突变检测(a)在213例HR + /HER2−转移性乳腺癌患者中,PIK3CA检测发现9个PIK3CA突变阳性病例数。(b)确定的9个PIK3CA突变的相对频率。(c)突变在血浆中浓度(copies/ml)和MAF(%)分布 (5例以上的突变用箱线图表示,5例以下的突变用点表示,2例以上的突变用中位数线表示)。
原文:https://doi.org/10.1038/s41598-021-96644-6
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naica®六通道微滴芯片数字PCR系统
法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统,源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术,自动化微滴生成和扩增,每个样本孔可实现6荧光通道的检测,智能化识别微滴并进行质控,3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。
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