COVID-19大流行中断了对艾滋病病毒感染者的常规护理,严重影响了对艾滋病病毒感染者的诊断和治疗。如果感染SARS-CoV-2, 艾滋病病毒感染者的发病率和死亡率会增加。据报道,近日在南非发现新冠新型变异毒株Omicron可能由艾滋患者体内进化而来。因此密切监测HIV血浆病毒载量(VL)并筛查SARS-COV-2感染就显得尤为迫切。近日,来自华盛顿大学的Gaurav K Gulati和Nuttada Panpradist等科学家在medRxiv平台上提交文章《Inexpensive workflow for simultaneous monitoring of HIV viral load and detection of SARS-CoV-2 infection》的预印本。
通过开发一种新的工作流程,同时定量艾滋病毒载量和检测SARS-CoV-2。文中使用naica®微滴芯片数字PCR系统对RNA浓度进行精准定量,用于新方案的评估。
文章中作者基于Boom方法开发了一种内部RNA提取方法,从血浆、鼻腔分泌物(NS)或二者混合物中进行RNA提取,对HIV长末端重复序列(LTR) 、SARS-CoV-2核衣壳基因区域(N1、N2)和人类核糖核酸酶 P(RP)进行RT-qPCR分析,估计血浆病毒载量并对HIV/SARS-CoV-2状态进行分类(HIV为病毒学失败或抑制,SARS-CoV-2为阳性、假定阳性、阴性或不确定)。
首先,作者将包含HIV LTR检测扩增区域或N1/N2检测的DNA片段作为RNA生成的起始DNA构建体。使用 T7 RNA聚合酶将DNA构建体转化为RNA。为了对体外转录的RNA浓度进行精准定量,作者使用naica®微滴芯片数字PCR系统对RNA浓度进行绝对定量(图1)。从图中可以看出通过检测OD值并不能对RNA浓度进行精准定量,因此最终利用数字PCR的结果对RNA的浓度进行了校正。
图1:数字PCR量化体外转录的RNA标准浓度
随后将合成的不同浓度的HIV RNA与血浆样本进行混合构成人造血浆样本,合成的不同浓度的SARS-CoV-2 RNA与NS进行混合构成人造NS样本,分别采用内部提取方法和标准提取方法对血浆样本中HIV、NS样本中SARS-CoV-2和血浆和NS混合样本中HIV和SARS-CoV-2进行灵敏度检测。同时采用133个临床样本,其中40个血浆样本(30个HIV血清阳性),67个NS样本(31个SARS-CoV-2阳性)和26个血浆和NS混合样本(26个HIV阳性,10个SARS-CoV-2阳性)进行评价(图2)。
结果表明:内部提取对HIV的检测限为200拷贝/mL,对SARS-CoV-2的检测限为100拷贝/mL。对于血浆样本,两种方法测量的HIV病毒载量水平呈正相关(人造样本的R2:0.98, 临床样本R2: 0.81)。在对NS样本使用内部提取方法时,排除不确定结果,与标准提取方法相比,95%的一致性(25个阳性,6个假定阳性和31个阴性)。对于血浆和NS混合样本,两种方法测量的HIV病毒载量水平呈正相关(人造样本的R2:0.98, 临床样本R2: 0.71)。SARS-CoV-2检测结果显示阳性和阴性分类是100%一致性。
图2:使用两种不同提取方法从血浆和NS混合样本中共同提取的RNA中获得的HIV LTR 和SARS-CoV-2 Cq值的比较.(a)比较标准与内部提取方法性能的实验设计方案。(b)来自内部提取方法的SARS-CoV-2 LTR、N1、N2和人 RP (阴性样本的对照)测定的Cq值。(c)基于两种提取方法的结果对样本进行分类。通过两种方法提取的样本中测得的(d)LTR、(e)N1和(f)N2的散点图。
综上所述,作者开发的内部提取方法可以从单独的血浆或血浆和NS混合样本提取RNA来确定艾滋病病毒感染者是否存在SARS-CoV-2感染,从而有可能简化HIV管理和SARS-CoV-2检测。将这两种病毒的检测结合起来可以有效的减少COVID-19对艾滋病毒治疗的影响。
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原文:https://doi.org/10.1101/2021.08.18.21256786
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