ELISA试剂盒三条基本原理讲述ELISA试剂盒的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。ELISA试剂盒本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此法在各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

ELISA试剂盒优质的文章在帮助用户在做选择每一篇ELISA试剂盒文章都有自己的写作目的，都希望通过文字能够为用户带来一些我们产品或者服务的参考价值，当然通过文章我们作者的目的也非常明确，就是能够希望通过文章向读者传递我们所推荐的服务或者其他想法，其实真正的目的就是在帮助用户选择最为适合自己的产品。 ELISA试剂盒内容的构建一定要建立在当下的时间点上，对于新闻特点就有过一定的学习，主要表现在内容的时效性方面，尤其在当下互联网发展迅速的时代，内容要更加注重时效性。内容写作不是单纯的思路阐述而是一种交谈的过程，优质的内容我们要考虑到受众和我们的客户，要注重互动和对方感受的传达。 众所周知，ELISA试剂盒网站优化过程中文案写作是要认真思索的问题，文案是优化的基础尤其是当下，搜索引擎算法日益升级，对于内容质量度的要求也是水涨船高，在这种竞争激烈的情形下，作为站长我们应该从哪些细节去进行优质文章的撰写呢? ELISA试剂盒站长应该从哪些细节问题出发呢?关键在于引导，比如我们可以提出问题、题册问题之后如何解决问题解决问题的思路有哪些方面?在众多的解决问题的方法中你认为合理的方法有哪些?让用户感受在正跟你进行对话。而从感性的角度来看需要从生活当中去感觉。

ELISA试剂盒与您分享细胞培养的三不要ELISA试剂盒技术骨干有三个小经验和大家分享一下：A 不要烧瓶口大多数人都喜欢在酒精灯的火焰上关瓶子，觉得这样可以避免污染。不知道大家是不是有培养基怎么越用越发紫的困惑？知道为什么吗？烧瓶口烧的。培养基一般都是用碳酸/碳酸氢跟作缓冲体系。瓶口在火焰上的时候，炽热的空气进入瓶内。塞紧塞子放入冰箱后，空气变冷，压力骤降，培养基中的碳酸就会转化成二氧化碳，释放出来。培养基中的碳酸少了，当然会变碱。如果不烧瓶口的话，你会发现培养液变碱的速度会大大减慢。（当然多多少少还是会有一点越用越碱，因为室温还是比冰箱内的温度高）其实烧瓶口防止污染纯粹是心理安慰。不妨试一下把手指在火上晃几下，你会发现根本就不会烧疼。如果有细菌的话，这么晃两下也烧不死多少。要想烧死全部细菌，除非把瓶口和塞子烧红。我在国内从来就不烧瓶口。来美国以后发现这里更彻底，超净台内根本就不点酒精灯。 B 不要频繁看细胞对于初学者而言，养细胞就像养孩子一样，有空就要去看看。细胞越是养不好，就越是经常去看。实际上看细胞对细胞的生长没有任何好处，特别是对原代细胞或是免疫磁珠分选后，密度特别低的细胞。培养基中的生长因子是非常有限的。细胞好不容易自分泌一点儿促生长的因子在其周围，形成有利于生长的局部环境。你跑去看细胞，培养瓶这么一晃，把因子都给晃散了。经常可以看到新手一天到晚都在看细胞，细胞老是长不好。老手细胞一扔好几天不管，细胞疯长。 C 不要怕消化在传代的时候，ELISA试剂盒初学者往往生怕细胞消化过度，早早地终止消化。细胞没下来就使劲吹灯，吹得满瓶子都是气泡。在我看来，用力吹打对细胞的损伤比消化更大。我师兄在做血管平滑肌原代的时候，37度消化过夜，细胞也没事。我一般是等细胞完全变圆后才中止消化。细胞轻轻一晃就能下来。还有，动作要轻柔，尽量不要产生气泡。气泡在破裂时的机械应力相当大，对细胞的伤害也是很大的。

ELISA试剂盒技能的可操作性强ELISA试剂盒在通常的概念里，不需杂乱设备，甚至彻底手艺加样、洗板和肉眼判读成果，便可完结该技能的操作。随着大家对质量操控认识的加强，尽也许做到最低极限的削减体系误差，以及削减劳动强度等观念的不断改进，处理ELISA试剂盒技能中加样、温育、洗板及判读成果过程的体系误差疑问及高效率运作疑问致使了自动化概念的形成。ELISA技能的加样、温育、洗板及判读成果过程的科学地、有机地、体系地联系，尽也许地削减各环节的人为因素的影响，便变成自动化ELISA技能的理论基ELISA试剂盒血浆中除尚富含纤维蛋白原和抗凝剂外,别的成份均平等于血清.制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清天然凝结,缩短后即可获得.除特殊情况外,在医学查验中均以血清作为检查标本.在ELISA试剂盒中血浆和血清可平等使用.血清标本可按惯例办法收集,应留意防止溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA试剂盒测定中,溶血标本也许会添加非特异性显色.ELISA试剂盒如有细菌污染,菌体中也许富含内源性HRP,也会发作假阳性反应.如在冰箱中保留过久,其间的可发作聚合,在间接法ELISA试剂盒中可使本底加深.通常说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超越一星期测定的需低温冰存.冻住血清融解后,蛋白质部分浓缩,散布不均,应充沛混匀宜轻缓,防止气泡,可上下颠倒混和。

做好这些确保ELSIA实验结果更准确下面将操作中各个环节常出现问题解决办法总结如下：试剂要选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。标本收集与保存：避免使用肉眼可见的溶血标本、高脂标本和混浊标本；2-8℃下，标本可放置24-48小时，长期保存需放置-20℃下，请避免反复冻融。ELISA试剂盒以灵敏度较高、特异性较好的特点在科研上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。    具体请参照：       一、洗涤液：用前配制，有的试剂盒会标明，配好的4度下一般可以放一个月，如果没有标明，尽量用新鲜的，不要多配制；二、显色液（有A液和B液的），用前15分钟配制；  三、标准品：有的试剂盒中标准品是已经配制好的，4度保存，有的是要现配制的，按照说明书操作； 四、浓缩生物素结合的二抗和HRP：如果需要配制，试剂盒没注明配好可以保存多久的话，尽量现配现用（用前15分钟配制）；原则是试剂盒上没有指出配制物的储藏方式的话，应该现配现用；不要怕麻烦；还有小瓶的管子开盖前要离心，以免盖子上粘连以后总量不够；五、ELISA试剂盒加 样：室温温育的试剂，特别是温育时间比较短的实验操作的试剂，加样对数据的影响比较大，特别要注意加样问题。  我们总结出不好的操作原因有以下几种：不会正确使用加样器； 血清或血浆标本分离不好即进行加样；手工操作中，加样板过多造成加样後放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。

Elisa代测样本运输指导样本收集1、血液样本的收集：全血根据收集的条件，分成不抗凝和抗凝两种。同时，不抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血清；抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血浆。① 不抗凝收集血清:将收集好的全血,静置1～2小时，直接低速离心分离出血清待用或保存。  ② 抗凝收集血浆: 收集抗凝全血，轻轻颠倒充分抗凝后，可直接低速离心分离血浆(也可静置半小时左右再低速离心分离血浆)待用或保存。根据不同抗凝剂的性能特征，选择合适的抗凝剂。实验室常用的抗凝剂有肝素的各种盐、EDTA及枸橼酸钠。生化实验一般建议用肝素抗凝。选择抗凝的注意点：① 每一份样本所加的抗凝剂的量要一致，同时所取的全血的量也要尽量一致；② 收集抗凝全血后一定要轻轻颠倒，充分抗凝，防止部分血液未接触到抗凝剂而导致凝固;   ③ 抗凝全血收集的血浆相对较多（1ml抗凝全血能分离出0.4～0.5ml血浆）；                      ④ 抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去掉浑浊后用于测定。2、组织样本的收集:① 样本采集：取组织块（一般每种组织需0.2g以上）在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入冻存管或离心管中。② 样本保存：动物组织样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间如不反复冻融，-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。制备好的匀浆液建议不要冻存,最好当天进行测定,如放置时间过长相关酶活会有所下降,部分指标4℃可存放3～5天(如SOD要存放2～3天,MDA可存放3～5,总蛋白测定可存5～7天等) ○ 样本的运输、转存① 血液及组织样本收集齐后深低温冻存，将冻存的标本，放置在装有5-10公斤干冰的泡沫盒中密封保存运输。（干冰保证-40℃的温度，防止样本的反复冻融，5-10公斤的干冰可以保证5-7天的温度）② 新鲜细胞可用充氮法。2-3天内送达；收集的细胞及裂解细胞冷冻液氮或干冰运输。③ 细菌等样品冰袋低温运输。④ 免疫组化石蜡包埋样品可加好固定液低温运输，或者包埋成蜡块后常温运输；免疫组化的冰冻样本液氮或干冰运输。⑤ PCR相关实验使用收集细胞，可直接在细胞中加TRIzol充分裂解后用冰袋低温运输。⑥ 客户所提供的试剂及试剂盒根据试剂本身保存要求运输。 注意事项① 本市可上门取样；外地客户请参照上述条件运输，快递送达；② 干冰、液氮、冰袋等低温材料要充足，保证在运达目的地之前没有消耗完。

技术解答为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？很多老师做血清实验，血清是经过储存放在冰箱中保存的，对于为什么会出现沉淀，我司技术给出以下解答：GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。正确的血清储存标准：胎牛血清因为其产品的特性，在储存的时候需要多加注意，错误的操作会使胎牛血清失去活性，在实际应用的时候应注意一下几点：在解冻和储存的时候应该将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。长时间储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，推荐在-20℃以下储存血清，并避免反复冻融。我们建议血清应保存在-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

ELISA试剂盒的长处ELISA试剂盒长处主要表现：特异性高：进行了广泛的非特异性排查，避免了因为穿插反应和搅扰致使的实验数据误差。 精 度 高：经过加标回收率和线性稀释实验，确保样本值的准确性，精确度高于同类产品。重复性好：lot-to-lot检查确保最小的批间差异。 牢靠性强：经优化的试剂盒组分可有用的阻挠假阳性和假阴性实验结果。 规范曲线：在确保精准数据的前提下供给较宽的检查规模，以满意需要。 报价低廉：原装进口RD试剂，国内分装装备，大大减少了客户因为报价高而有必要采购国产试剂盒的顾忌。

ELISA试剂盒操作程序总结elisa试剂盒免费代测注意事项1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差3． 建议所有标准品、样本都做双份检测。4． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.5． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。6． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。7． 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。操作程序1． 分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育60分钟。2． 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。3． 每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.4． 取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。5． 测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。6． 根据elisa试剂盒免费代测标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。elisa试剂盒免费代测洗板方法手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中标本要求1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

qPCR 常见问题及分析通常来讲，real-time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80～150 bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断 PCR 产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。今天给大家汇总一下 qPCR 常见问题。文章底部还有更多详细内容。1无 Ct 值出现检测荧光信号的步骤有误：一般 SG 法采用 72℃ 延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性。模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2Ct 值出现过晚（Ct>38）扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR 产物太长： 一般采用 80～150 bp 的产物长度。3标准曲线线性关系不佳加样存在误差：使得标准品不呈梯度。标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高。4负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有 PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。6扩增曲线异常，比如 S 型曲线参比染料设定不正确：MasterMix 不加参比染料时，选 NONE。模板的浓度太高或者降解。荧光染料的降解。7定量 PCR 仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量 PCR 仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量 PCR 的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR 仪主机的电源，最后关闭电脑。9什么是 CT 值比较法？数据怎么处理？CT 值与起始 DNA 浓度的对数成反比：如果：不同管之间的 PCR 反应效率相同。这些 PCR 的反应效率接近 100%。可以从上面的公式推出相对含量（X01/X02） = 2 -ΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后 0、24、48 小时 IL-2 基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的测定结果都是 CT 值，而没有通过标准曲线测定总 RNA 的 pg 数。10定量 PCR 基因表达的实验数据应该如何处理？总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的 ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映 PCR 进程。ROX 校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同时定量一个内对照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。计算相对于基准样品（Calibrator）的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0 小时和 6 小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6 小时/0 小时、患病/正常。11怎样判断定量 pcr 仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行 ROI 的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。吹打数次。将废液吸入废液杯中。重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。确认反应孔中的残留液体蒸发完。12内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的 PCR 效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的 PCR 效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

如何选择合适的荧光蛋白在我们的实验中，经常会用到荧光蛋白，但是如何选择合适荧光蛋白，得到完美的实验结果？相信这个问题一直困扰着大家，鉴于此，小编从不同的角度去考虑如何选择荧光蛋白，希望可以给大家在选择荧光蛋白方面提供一些帮助。tubes of various fluorescent proteins displayed in a box with uv light shining on them.单体性质将荧光蛋白与目标蛋白进行融合表达，直接地追踪目标蛋白或是定位目标蛋白，这就要求荧光蛋白是单体，不能影响目标蛋白的功能和定位。因此，我们将荧光蛋白的单体性质放在第一位。目前体外检测荧光蛋白单体性质的方法有分子筛、沉降平衡，可以通过荧光蛋白分子筛的峰图是否狭窄，单一粗略的判断其是否为单体，沉降平衡能够更加准确的确认其聚合性质。我们使用荧光蛋白几乎都是在细胞内或组织内，因此我们更加关心在生理条件下，荧光蛋白的聚合性质。科学家巧妙地将荧光蛋白与细胞色素 p450 进行融合表达，让荧光蛋白定位在内质网的胞质面，荧光蛋白的聚合性质会使邻近的荧光蛋白聚合在一起，形成聚集体，在激光共聚焦显微镜下能够看到细胞核的周围有很大的点状结构。小编已经用此种方法检测了多个荧光蛋白。the structure of meos2小编发现绿色荧光蛋白中，单体性质比较好的是 memerald，该蛋白很少形成大的点状结构，并且目前还没有称该蛋白会影响定位的报道。此外 memerald 是一个非常稳定的绿色荧光蛋白，因此可以用于线性的结构光照明超分辨荧光显微成像。我们还发现红色荧光蛋白中没有一个单体性质特别好，相比较来说，mapple 的单体性质最好，但是在使用该蛋白的过程中，发现 mappple 会影响某些蛋白的定位，因此在使用红色荧光蛋白时，要谨记红色荧光蛋白可能会影响目标蛋白的定位。pk 值每个荧光蛋白都有其最合适的 ph 值，即在一定的 ph 值下，荧光强度最高。有的荧光蛋白适合在酸性环境下使用，相反有的适合在碱性环境下使用，因此在选择荧光蛋白时需要考虑荧光蛋白的 pk 值。change in relative fluorescence intensity （rfu） with ph for egfp（grey triangles） and bflogfpa1 （black squares）在细胞内，大多数细胞器内及细胞质的 ph 值都在 7.0 左右，然而溶酶体内的 ph 值就比较低，因此常规的荧光蛋白并不适合用于标记溶酶体内的蛋白。mcherry 的 pk 值比较低，适合在酸性的环境下使用，可以用于标记溶酶体内的蛋白，但是该荧光蛋白有一定的二聚性质，可能会影响目标蛋白的定位，在使用该荧光蛋白时要综合考虑单体性质和 pk 值。在选择荧光蛋白时，要考虑目标蛋白定位环境的 ph 值，再考虑使用相应 pk 值的荧光蛋白。同时也可以考虑利用荧光蛋白的 pk 值的特性，帮助我们解决问题。成熟时间荧光蛋白在发光之前需要经历转录、翻译、折叠等步骤，其中折叠过程占据了大部分时间，我们将此过程称之为成熟时间。在标记短寿命的目标蛋白时，如果荧光蛋白的成熟时间太长，可能会出现在目标蛋白开始降解时，荧光蛋白还没有发光，导致无法追踪及定位目标蛋白。因此在选择荧光蛋白时，需要考虑其成熟时间。小编在实验时发现，memerald、dendra2 的成熟时间比较快，在用 lipo2000 转染试剂盒转染 u2os 细胞时，转染后四个小时就能够用荧光显微镜观察到了荧光信号，egfp 没有信号。但是在用 p450 方法检测时，dendra2 会形成很大的聚集，表明该荧光蛋白的单体性质不好，有可能影响目标蛋白的定位和功能，在使用该蛋白的过程中应该注意这个特性。为了能够更早地观察某些短寿命荧光蛋白的生理特性和定位情况，科学家正在发展成熟时间更快的荧光蛋白，并且用于超分辨成像。光稳定性荧光蛋白在发光的同时会被漂白，逐渐失去发光能力，因此要想获得更多的信息，就需要荧光的光稳定性好。在普通的荧光成像中，对荧光蛋白的光稳定性要求并不是很高，比如激光共聚焦显微镜成像时，荧光信号的稳定性只需要能保证采集的完整的一张图即可。在超分辨荧光成像中，对荧光蛋白的光稳定性要求比较高。线性结构光照明显微镜要求荧光蛋白始终处于亮的状态，需要通过结构光采集多幅图进行重构；非线性结构光显微镜则要求荧光蛋白在黑亮之间进行多次切换，这就要求荧光蛋白能进行反复的光调控，并且依旧维持着高的亮度；与非线性结构光显微镜一样，可逆饱和光线性荧光转移显微镜也要求荧光蛋白能够在黑亮之间进行反复的光调控。优化密码子大多数荧光蛋白是来自于海洋生物，因此密码子偏好性与所要标记蛋白的物种有较大的差异，这种密码子偏好性差异可能会导致荧光蛋白在哺乳动物细胞或组织中的表达量极低，以至于看不到荧光信号。幸运的是大多数荧光蛋白的密码子已经经过优化，适合在哺乳动物细胞中进行融合表达。但是当需要使用荧光蛋白在其他种属细胞内表达时，应考虑一下密码子偏好性。小编在进行线虫荧光成像时，就遇到过此类问题，没有优化密码子时，荧光蛋白的表达量比较弱，在荧光蛋白经过密码密码子优化，并且在 dna 序列之间插入线虫的内含子后，荧光蛋白的表达量得到了较大的提高。在比较少见的物种进行荧光成像时，需要把密码子优化这个特性考虑在内。n 端或 c 端在选择了相应的荧光蛋白后，我们需要确定把目标蛋白放在荧光蛋白的 n 端或是 c 端。n 端与 c 端的区别在于目的蛋白，有的目的蛋白对这个要求不高，但某些目的蛋白就要求在特定的位置进行融合表达。荧光蛋白与目的蛋白融合表达可能会影响目的蛋白的折叠，这取决于目的蛋白折叠过程中，荧光蛋白所在的那一端有没有参与蛋白质的折叠。例如，如果目的蛋白的 c 端会被折叠入目的蛋白的内侧，那么我们把荧光蛋白标记在目的蛋白的 c 端，将获得不到荧光信号；有些目的蛋白在后翻译的过程会切掉一段，如果荧光蛋白处于被切的一端，那么就不能获得准确的目的蛋白的定位信息。如果标记的目的蛋白是一个新的蛋白，我们建议分别进行 n 端和 c 端融合表达，以此来确定哪一个是最好的选择。除此之外，还可以用免疫荧光来确认目的蛋白定位是否与荧光蛋白融合表达的一致。综合以上的介绍，在我们选择荧光蛋白时，首要考虑的是荧光蛋白的聚合性质，即是否会影响目的蛋白的功能及定位，其次是荧光蛋白的 pk 值是否与目的蛋白所处的环境的 ph 值相匹配，然后是荧光蛋白的成熟时间以及目的蛋白的寿命，综合两者决定荧光蛋白是否合适，最后考虑荧光蛋白的光稳定性、密码子偏好性是否合适，最后考虑目的蛋白放的位置，荧光蛋白是否会影响目的蛋白的功能及定位。此外，在进行荧光成像时，需要考虑显微镜所选的滤光片是否与相应的荧光蛋白质配套，显微镜的各种参数是否合适。值得提醒的是，激发光的强度不能太高，否则会导致荧光信号的漂白。

技巧|elisa高背景的分析elisa实验过程中常常出现让人难以琢磨的结果。其中阴性对照出现高背景的情况也时有发生，这样导致结果不那么可性。出现高背景的原因可能如下。 1、抗体、抗体的浓度不合适抗体质量不好，特异性不高可能会与封闭液（bsa）产生交叉反应，这点我遇到过，后来用0.8%的明胶代替，本底就很好了。抗体亲和力不好，也会如此，由于加大了抗体的使用量，必然造成了非特异性增加的可能。 2、封闭液成分、封闭液的浓度、封闭时间封闭液，如bsa可能与抗体发生交叉反应，导致背景偏高。封闭液的浓度偏低，封闭时间过短，导致封闭不彻底，抗体与酶标板孔结合，也可能导致背景偏高。 3、孵育时间、孵育温度孵育时间过长 、温度过高，也可能会导致非特异性结合增加，从而造成本底增高。 4、洗板液成分、洗板的时间一般用pbs洗板就可以了，但有时候可以在洗板液中加入一些表面活性剂，如tween-20.洗板的时间不足，会导致抗体残留，引起阴性对照显色。如果是机洗，可以改为手洗少量尝试，增加洗板时间。机洗一般没有手洗去除干净。 5、显色时间由于系统优化不好，导致样品显色较弱，而延长了显色时间，这样一来导致阴性对照也有部分显色。此时，应该优化检测系统，调整包被物、检测抗体、底物等的浓度，缩短显色时间，显色一般不超过15min。 6、样品样品中含有干扰物质。此时可以优化系统，调整其他检测抗体的比例，而增加样品的稀释度、增加洗脱步骤等。 7、elisa板的选择聚苯乙烯制备的elisa板经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为elisa固相载体的一种，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。如下图，是分别使用两种不同厂家的elisa做的同一种实验，背景完全不一样。 此外，配制时间过久的cb包被液，也会使样品和阴性对照的od值稍微偏高，可能是由于放置太久，导致cb液的ph变化所致。

          癌症ANK免疫疗法 — 出现的特征以及反应ANK疗法，是采用患者本人体内对癌细胞伤害能力压倒性高的NK细胞的疗法，通过培养得到成千上万倍的增加，它与其他实施的免疫细胞疗法完全不同，是目前癌症治疗方法中的一种新型的特殊疗法。ANK疗法的基本型已经完成是从1993年开始的，并且进行了小规模的临床实验，2001年开始了一般诊疗。因为ANK疗法活性高的原因，每次点滴都会出现一时性发热、高烧等显著的免疫副反应，这是在日本实行的免疫细胞疗法当中，ANK疗法出现的特征。ANK疗法与其他免疫疗法相比，ANK疗法需要采用量非常大的被活化了的NK细胞进行回输，回输到体内的高活性的NK细胞，会产生强烈的免疫反应，因此会出现发烧的现象。到底ANK免疫细胞疗法与其他疗法有哪些与众不同的优势呢？先来看看ANK疗法中起关键作用的NK细胞体现了哪些重要作用？NK细胞，是我们体内存在的一种免疫细胞，在癌免疫的上起到主要作用。既能攻击癌细胞，又不伤害正常细胞。NK细胞活性越高，越能够分辨出癌细胞，不伤害正常细胞，具备只以癌细胞为目标进行攻击的能力，但是NK细胞的活性一旦低下就不会攻击癌细胞，这种既简单又直接治疗癌症的细胞疗法就是ANK疗法的根源。因为NK细胞是对全身进行监视的，所以ANK疗法起初是不分癌患部位的，除了对脑肿瘤是例外。因为在脑部存在被称为脑血液门（BBB）的门，NK细胞无法通过这个门。只有在接受γ刀治疗的场合，脑血液门才在一定的时间里被打开，这样ANK疗法才能起到去消灭肿瘤组织的作用。但是在癌患者体内，这些NK细胞的活动被强烈的抑制住。于是采取了另一种方式，取出体内的NK细胞在体外培养，增殖细胞和使细胞活性化，然后回输到体内。这种用点滴回输到体内的NK细胞能够直接攻击癌细胞，而且在体内还能够大量的放出细胞因子，强烈的刺激癌免疫系统，促进其他NK细胞活性化。人体自身的NK细胞，一般基因操作以及不可预测的变化都不会发生，只是恢复和解放NK细胞的本来机能，从原理方面考虑，这种人体本身的细胞才更加的安全可靠。那么采用ANK细胞免疫疗法会出现哪些反应呢？接受ANK疗法的患者，可能会出现食欲增强，睡眠质量改善，干劲出来，皮肤颜色变好，不患感冒等现象，诸如这样的临床症状的改善的患者不在少数。相反，也有患者出现寒冷，发热等非常难受的症状。通过ANK疗法进行点滴NK细胞后，不久会出现发冷现象，但是不出现的场合也很多。虽然可以考虑到采用静脉点滴的NK细胞，在肿瘤附近的血管壁排放到外面去。而人体之所以感到寒冷是因为免疫刺激使血管壁扩张的原因。在这种激烈的场合下，人们就难免会产生难以忍受的颤栗，但是这种现象不久就会好。发热是一种免疫反应，这是回输到体内的NK细胞放出的免疫刺激因子所引起的。培养的NK细胞和体内平均NK细胞的活性差，就会影响细胞因子的排放量，尤其是接受化疗极限治疗的患者。人体的免疫力水平如果非常低，初次或第二次点滴是，就会产生猛烈的发热现象。但是第三次以后，发热程度就会有所减轻。预想到猛烈的发热会发生时，是可以减少初次和第二次回输的细胞量的。ANK疗法虽然以每周两次为基准回输，但是可以根据医生的判断，增加回输的间隔时间，或者把一次回输细胞的量分为两次点滴，抑制免疫副反应。另外ANK疗法对包含ATL的白细胞、B型/C型肝炎等病毒感染患者也可能起到治疗作用，在分离的淋巴球当中，会有大量的癌细胞混在当中。ANK疗法可能是不容易治疗白细胞，但是可以在同混入癌细胞战力的平衡的培养中，使混入癌细胞死亡。

有关物质测定浓度的确定不能按峰面积倍数来定，例如HP1100的数值就要比一般的工作站低1000倍，要面积7、8位数得多大浓度？　　ICH中的要求是杂质峰大于0.1%以上的峰必须能够定量，0.05%以上的峰必须能够检出，也就是说能够定量的峰为N/S>＝10，所以有关物质检测浓度为>=定量限*1000（0.1%的倒数），例如基线噪音为0.03mv时，定量限峰高应为0.3mv，则供试液峰高至少要300mv以上，否则0.1%的杂质无法定量。但也并不是说峰高越高越好。一般的要求浓度越大越好，在仪器条件能达到的情况下尽量提高测试样品的浓度，这样有些本来比较小的杂质峰也会在图谱上体现出来。个人认为在进行完善的方法学研究的前提下，可以要求浓度小一些，因为有的物质的分离度不是太好，如果浓度太大的话可能达不到分离要求。这种情况下可以调低有关物质检查的浓度。这个时候千万注意最小检测限和有关物质限度的大小，不能将有关物质限度定的比检测限还小。但有关物质测定供试液的浓度并不是越大越好，应考虑实际样品在溶剂（流动相）中的溶解度问题，也要考虑柱子的承载问题，如果样品浓度过大，造成柱子超载，那样分离度不好，有关物质测定结果不准确。有关物质测定供试液的浓度选择，在满足上述条件后，一般峰面积应达到7位数为佳（1000000-5000000之间为好）。在这个数据之间，有关物质测定供试液的峰面积的方法学研究的有关项目数据会很好，有关杂质也会很好的检测出来。还有就是在破坏试验中要体现出杂质峰来。以前学习时这么说的：之前有老师说有关物质最佳浓度是在你的系统中恰好出平头峰时的浓度，此时若杂质分离度均符合要求时即可。后来觉得这样做吸收弱的药很难达到这个要求，于是根据所用工作站确定了一个峰面积（我用的TL9000，要求1亿左右，有时通过调节灵敏度来做），另外xianghui_lv 老师所说的“一般峰面积应达到7位数为佳”，也不是所有工作站适用的，以前用过HP的工作站能达到6位也很大了。我现在的一般做法：我们看到的很多标准很多都是用1mg、0.5mg/ml来做有关物质，比这个浓度还大的一般很少见了，所以除非吸收很小的药，我定有关物质浓度都是按照这两个浓度选其一，而含量若也用HPLC则稀释10倍或5倍。另外，无名主任没有详细说明是HPLC or TLC，若是用TLC的话，浓度可就要大的多了，一般都要几十mg以上（溶解度保证前题下）。我觉得有关物质的浓度是因不同的品种而不同的，因为不同的品种它的响应值有很大的差别。另外，现在的检测器的灵敏度都是很 高的，即使浓度小点，有关物质也可以检测出来！所以我个人认为，如果吸收达到500～1000mv，我想都基本可以了！以前的很多老标准，现在再做很多都是出头峰，现在完全没有必要那样做！但是有些品种响应值实在是太低了，吸收度要达到那么高，浓度可能要很高很高。此时考虑所用的溶剂的成问题了，也就是说用一般的溶剂就根本没办法做到让吸收度达到比较高的程度！所以，有关物质的浓度，没有一个很明确的规定！！

HPLC法检测同一个样品有关物质和含量，测定波长是否应一致1.检测含量肯定应选择样品吸收最大的波长，而其它如中间品、辅料、杂质等几乎无干扰的波长。2.检测有关物质时，最佳波长应该是样品有最大吸收，而中间品、其他杂质都有较大吸收处，如果在样品最大吸收波长下，中间品、其他杂质几乎没有吸收，或吸收很小，那选择波长应该是中间品、其他杂质都有最大吸收，而样品吸收较大的波长。3.检测有关物质时，最佳波长应该是样品与中间品、其他杂质都有较大吸收处，这种情况应有一定的文献依据，比较容易通过。我报得一个药品，选择波长有文献依据，并且选择波长应是中间品、其他杂质的最大吸收，而样品吸收较大的波长。按照要求，一个样品应该先检查杂质（如水分、有关物质等），合格后，才能继续检查含量，因此，应该先有有关物质方法，才有含量测定方法。有关物质波长应该选择中间体、杂质（包括专属性试验中的破坏杂质）的最大吸收波长，因此必须要一个PDA检测器。如果一个波长不能兼顾，可选择两个或多个波长。（用PDA检测器，进一针就可得出多个波长图谱）含量测定应选择主成分的最大吸收波长，此时专属性试验如果有PDA检测器的话，可以不用重做，直接把光谱调到此波长，或参照主峰的峰纯度即可。

酶联免疫吸附试验（ELISA）四大操作要点1 标本的采取和保存 可用作elisa测定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。3 加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。4 保温 在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

ELISA测定应该如何正确操作ELISA测定现在通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。一、临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面：（1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。（2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。（3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。（4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。（5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。二、试剂准备在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。三、加血清样本及反应试剂样本在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

细胞培养-常用培养基及基本特性常用培养基及基本特性1、RPMI-1640 MediumRPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。2、Minimum Essential Medium（MEM）也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。5、DMEM/F12DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mMHEPES缓冲液。6、McCoy’s 5AMcCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。7、Iscove’s Modified Dulbecco Medium (IMDM)Guilber 和Iscove将Dulbecco’Medium 改良为 Iscove’s Medium，用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞，LPS刺激的B细胞，骨髓造血细胞，T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。8、M-199 Medium1950年，Morgan成功研制出具有确定化学成分的细胞培养液，即M-199，主要用于鸡胚成纤维细胞培养。此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。M-199可用于培养多种种属来源的细胞，并能培养转染的细胞。9、Leibovitz Medium （L-15）L-15培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养，用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株。此培养液采用磷酸盐缓冲体系，氨基酸组成进一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。10、Ham’s F-10培养基：适应小鼠细胞、人类二倍体的培养。11、Ham’s F-12培养基：可以在加入很少血清的情况下应用，特别适合单细胞培养和克隆化培养，是无血清培养中常用的基础培养液。12、William’s Medium E：用于大鼠肝上皮细胞的长期细胞培养。13、MCDB 131 培养液：用于培养内皮细胞。14、Opti-MEM I Reduced Serum Media：用于培养造血细胞。15、植物血凝素（PHA）：增加细胞转化和DNA合成。

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascularendothelial cells,PMVECs)在急性肺损伤、肺动脉高压等疾病启动或发生时首当其冲,是肺内最早激活的效应细胞[1]。体外培养PMVECs以构建实验模型,对深入研究生理和病理情况下PMVECs的基因、表型、功能变化及其调控机制具有重要意义。虽然国内外已有许多关于PMVECs体外分离培养和鉴定方法的报道,但PMVECs的原代细胞培养难度仍较大,细胞培养成功率较低,重复性差,而成本较高。本研究尝试对大鼠PMVECs组织块培养法的部分细节技术加以改进,并对培养细胞进行相关鉴定,旨在提高大鼠PMVECs体外培养方法的可靠性和重复性。1材料与方法1.1材料1.1.1动物雄性SD大鼠(二级清洁),体质量100～150g,。1.1.2主要试剂和仪器低糖DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco);异硫氰酸荧光素标记植物凝集素(FITC-BSI)

 尊敬的客户朋友; 　　2017年端午佳节在即，沪震实业提前预祝全体沪震家人及广大客户朋友节日快乐!为了便于广大客户顺利办理业务，现根据国务院办公厅通知精神及公司的实际情况，现将“端午节”期间我司放假安排通知如下： 　　一、放假时间： 2017年5月28日至30日放假调休，共3天。5月27日(星期六)上班。如有业务咨询情况，请与我司客服专员联系手机：13916550749 　　二、放假期间我司暂无发货安排，如需备货请提前与我司业务员沟通，由此给您带来的不便敬请原谅! 　　                                                                特此通知                                                          上海沪震实业有限公司　　                                                            2017年5月26日

简单介绍人血清的作用及分保存方法离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体便是血清。人血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长和抑制生长活性是达到生理平衡的。人血清的作用：提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质等，是细胞生长必须的物质。提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起到重要作用。提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。对培养中的细胞起到保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于铁壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用。正常人血清等血清使用时常见问题及解决方法：一、保存血清最好的方法?血清应保存在-5C至-2OC。然而，若存放于4C时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议将无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。[5]二、如何解冻血清才不会使产品质量受损?将血清从冷冻箱取出后，先置于2-8C冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。[5]三、如何避免沉淀物的产生?（1）、解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O。C至4。C至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20。C至37。C)，实验显示非常容易产生沉淀物。（2）、解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生（3）、请勿将血清置于37。C太久。若在37。C放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。（4）、血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。（5）、若必须做血清的热灭活，请遵守56。C，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。[5]血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?　欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。但不建议以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。人血清与人血浆的区别：人血清血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。人血浆相当于结缔组织的细胞间质。是血液的重要组成分，呈淡黄色液体（因含有胆红素）。血浆的化学成分中，水分占90～92％，溶质以血浆蛋白为主。血浆蛋白是多种蛋白质的总称，用盐析法可将其分为白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原三类。血浆蛋白质的功能有：维持血浆胶体渗透压；组成血液缓冲体系，参与维持血液酸碱平衡；运输营养和代谢物质，血浆蛋白质为亲水胶体，许多难溶于水的物质与其结合变为易溶于水的物质；营养功能，血浆蛋白分解产生的氨基酸，可用于合成组织蛋白质或氧化分解供应能量；参与凝血和免疫作用。血浆的无机盐主要以离子状态存在，正负离子总量相等，保持电中性。这些离子在维持血浆晶体渗透压、酸碱平衡、以及神经-肌肉的正常兴奋性等方面起着重要作用。血浆的各种化学成分常在一定范围内不断地变动，其中以葡萄糖、蛋白质、脂肪和激素等的浓度最易受营养状况和机体活动情况的影响，而无机盐浓度的变动范围较小。血浆的理化特性相对恒定是内环境稳态的首要表现。

牛血清的主要成分及作用血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，所以胎牛血清是品质最高的。牛血清的作用：1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。4.在细胞培养试验中是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5.起酸碱度缓冲液作用。6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。注意事项：1. 储存和解冻血清时先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。2、除去血清中的含絮状沉淀， 离心血清（400g，1-2分钟）或者简单的让其沉淀在瓶子底部，将血清小心的转移到另一个无菌瓶里（一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤）。大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。3、一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。储存条件：血清一般储存于－20℃，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后，首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于－20℃，使用前融化。融化时最好现置于4℃。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。

微生物营养和环境条件实验实验材料1、活材料：培养3d的黑曲霉（Aspergillus niger）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、培养24h的大肠杆菌（E. coli）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、培养5d的吸水链霉菌“5102”（Sterptomyces hygroscopicus “5102”）、培养24～48h的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的斜面菌种；其它自选的微生物材料，包括实验室已有的和自己从环境中分离得到的均可。2、培养基：原则上可以参考以下培养基：完全培养基、缺C培养基、缺N培养基、缺P培养基、缺K培养基、缺Zn培养基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（含琼脂10g/L，每管12 mL）、牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基、牛肉膏蛋白胨培养液、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；也可以自己选定其它合适的培养基。3、试剂： 0.2mol/L K2HPO4、0.2mol/L硼酸、0.2mol/L NaOH、0.1mol/L柠檬酸；1g/L HgCl2，200??g/L链霉素，200??g/L青霉素，50g/L石炭酸；或者其它合适的试剂。实验用品接种环、酒精灯、9 mL无菌水、1 mL无菌吸管、无菌水、无菌平皿、玻璃刮铲、灭菌五角星形图案纸（牛皮纸或黑纸）、紫外灯箱、无菌镊子、直径0.6cm的无菌圆形滤纸片；或其它实验用品。实验设计方案的基本要求本实验是在已经做了微生物的一些基本实验和综合实验的基础上进行的，实验设计方案中应简明地阐述实验目的、原理、材料、实验方法、观测结果以及结果分析等内容。（一）拟订实验目的实验目的应该写明：通过何种设计方案，采用哪种方法，说明哪些因素对微生物生长有影响，影响程度如何；从本次实验本人可以获得哪些收获等等。（二）确定实验原理对自己的实验设计方案、方法从理论上说明依据。如微生物生长需要哪些营养物质，包括有机物、矿质营养元素；微生物与氧气的关系；微生物的生长温度范围；微生物生长繁殖需要的酸碱度即pH值环境；紫外线对微生物的作用；化学药剂对微生物的生长抑制或杀死作用等等，应根据试验目的灵活选择。（三）确定实验材料实验材料应根据自己的实验目的来确定，可以是实验室已有的活菌种，也可以是自己从环境中分离得到的微生物材料。（四）设计实验方法实验方法的确定也应该根据实验目的进行。应该包括菌种的选择、配制何种培养基、需要哪些器材和药品、怎样接种、怎样培养、怎样观察结果等等。可供参考的实验方法如下：1、营养元素对黑曲霉生长的影响⑴制备培养基：本实验分组配制培养基，培养基配方见附录1-8。培养基分装试管，每管装量4～5mL，0.1MPa灭菌30min后备用。⑵孢子悬液制备：取无菌水1支，用接种环从黑曲霉斜面菌种管中挑取菌体2～3环，放入水中，充分混匀，备用。⑶接种：每人取完全、缺C、缺N、缺P、缺K和缺Zn培养液各一支，用1 mL无菌吸管按无菌操作法接种黑曲霉孢子悬液0.5 mL。本实验按每4人取一套培养基不接种作为对照。⑷观察：接种后，将培养管置28℃温度下培养5～7d ,观察黑曲霉菌丝及孢子生长情况。★该试验用细菌类微生物作试验菌种能观察到明显的结果吗？为什么？2、氧气对微生物生长的影响⑴菌悬液制备：用接种环按无菌操作法取根瘤菌、巴斯德梭菌、大肠杆菌1～2环分别放入三支无菌水中制成菌悬液。⑵接种：取已熔化并保温在50℃左右的培养基6支，用无菌吸管分别及取菌悬液0.2 mL接种到培养管中，每种试验菌接种2个重复，接种后立即置振荡器上混匀，并冷凝。⑶培养：置培养管于28～30℃下培养3d。⑷结果检查：取出培养管，观察并记录每支培养管的上、中、下各层次中细菌的菌苔大小，菌体集中分布的位置，以了解氧气对几种细菌生长的影响。3、温度对微生物生长的影响⑴接种：取牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基8支，用接种环按无菌操作法分别在斜面上划线接种大肠杆菌与枯草杆菌，勿划破培养基。⑵培养：将已接种的斜面培养基，分别放在4℃、28℃、37℃和45℃四种温度下培养。⑶观察：培养48h、72h后观察生长状况，根据菌苔的大小确定其生长最适温度。4、氢离子浓度对微生物生长的影响⑴培养基制备：分组按下列配方配制不同pH值的培养基，并用pH计校证pH值，然后分装入试管中，每管装量5～6 mL,0.1Mpa灭菌30min备用，见表。⑵接种培养：取供试pH培养基三组用接种环按无菌操作法于试管中分别接入大肠杆菌、吸水链霉菌、黑曲霉。在37℃下培养48h。⑶检查结果：出取培养物，观察并记录实验结果。5、紫外线杀菌试验⑴制平板：取无菌平皿6套，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 不同pH值培养基配制表试管序号K2HPO40.2mol/L(mL)柠檬酸0.1mol/L(mL)NaOH0.2mol/L(mL)硼酸0.2mol/L(mL)牛肉膏蛋白胨培养液（mL）总量（mL）pH值（近似值）1234567890.30.91.11.31.51.9---1.71.10.90.70.50.1---------0.30.71.0------1.71.31.08888888881010101010101010102.84.45.26.06.87.68.49.210.0 按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。⑵菌悬液制备：取试管无菌水2支，以无菌操作法分别取金黄色葡萄球菌和黏质沙雷氏菌各2环，接入无菌水中充分摇匀，制成菌悬液。⑶接种：将已倒入培养基的平皿分成2组，每组3个，一组接金黄色葡萄球菌，一组接沙雷氏菌，用无菌吸管吸取已制好的菌悬液各0.1 mL，分别在接种于二组平板上，用无菌玻璃刮铲布均涂匀，随即用无菌镊子夹取无菌图案纸一张，小心放在接种好的平皿中央。⑷分组：将接种的六个平皿分为三组，每组一个金黄色葡萄球菌，一个黏质沙雷氏菌。⑸紫外线处理：将紫外灯先开灯预热2～3min。再将上述平皿置于紫外灯下，打开皿盖，在30cm距离处照射。一组照1min，1组照5min，1组照10min，小心地取下图案纸，盖上皿盖。用黑布或厚纸遮盖，送入培养室内。★此时能否不进行遮盖处理，直接拿出来培养？⑹培养：将平皿于28～30℃温度下培养48h。⑺观察：两菌在不同的处理条件下的生长状况，即有无生长、生长数量多少、生长的位置等。6、化学药剂对微生物的作用⑴制平板：取无菌平皿3套，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。⑵制备菌悬液：取无菌水3支，用接种环分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌各1～2环接入无菌水中，充分混匀，制成菌悬液。⑶接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液0.1mL接种于平板上，用无菌玻璃刮铲涂匀。注意做好标记。⑷浸药：将灭菌滤纸片浸入供试药剂中。⑸加药剂：用无菌镊子夹取浸药滤纸片，注意把药液沥干，分别平铺于同一含菌平板上，注意药剂之间勿互相沾染并在平皿背面做好标记。⑹培养：将平皿置于28℃下培养48～72h后观察结果。

SPA夹心ELISA实验检测CIC金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。1、试剂（1）5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；（2）牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA；（3）HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（HRP）制成结合物，最适工作浓度以方阵法滴定；（4）热聚合人IgG：人IgG 10mg/ml，63℃加热20min制成。2、操作步骤（1）用PBS稀释SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0.1ml（对照孔不包被），置4℃过夜后洗涤3次备用；（2）待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀，4℃过夜后1600r/min离心20min，弃上清，沉淀用2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml，混匀，置37℃水浴30min，摇动，使完全溶解；（3）将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H202）0.1ml，37℃ 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。置酶标仪492nm测各孔吸光值；（4）标准曲线制备：取正常人血清0.2ml，加热聚合人IsC（120ug/ml）0.2ml，再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml，置4℃过夜。同时做不加热聚合人耽的正常血清对照，以排除血清中干扰因素。沉淀清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液（加等量0.01mol/LpH7.4PBS）1.6ml溶解并稀释成120、60、30、15、7.5ug/ml，与待测血清同法操作，制成工作标准曲线；（5）结果判断：从待测血清吸光度值查标准曲线，即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。以高于正常对照X+2S，即大于28.4ug/ml为阳性。3、注意事项（1）热聚合人IgC应分装贮存于-20℃，不宜反复冻融，否则易解聚；（2）PEG的浓度影响CIC沉淀量，须严格配制。

ELISA 中常见问题及解决方法ELISA 试验以灵敏度较高、特异性较好的特点得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我公司将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期提高试验质量。Elisa 试验操作中可能影响结果的原因及其相应的解决办法1 选择试剂 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡至少 30 分钟。2 加样 可能原因：1）血清或血浆标本分离不好即进行加样；2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长 （特别是室内温度较高时）；3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。解决办法：1） 标本为血清：将血液先自然存放 1-2 小时后，再用 3000rmp 离心 15 分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合 5-10 次，放置一段时间后，3000rpm 离心 15 分钟；若在几天内检测，可放在 2-8℃ 冰箱中，若要贮存，则置于-20℃ 的低温冰箱内。2） 加样后及时放入孵箱。3） 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。4） 如果采用 AT 或其他全自动加样，最好选择 FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。5） 标本较多时，请分批操作。3 孵育可能原因：1） 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2） 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。解决办法：1） 贴封片或加盖；2） 按说明步骤严格控制操作时间。4 洗板 可能原因：1） 采用手工洗板， 孔与孔之间液体交叉。2） 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。3） 反应板过多造成洗板等待时间长。解决办法：1） 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；2） 合理安排，或多用几台洗板机。5 显色 可能原因：1） 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；2） 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。解决办法：1） 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用；2） 加样时保持显色剂不外流；3） A、B 液应避免接触金属器械。6 终止 可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。7 读板 如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸；尽可能实现 ELISA 检测标准自动化，有效提高检测质量。在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时做好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。

基于抗体标记的病毒快速定量系统病毒既危害人类健康，但也可以作为一种工具（如病毒疫苗）治疗疾病，因此近年来对病毒的研究越来越受到重视。然而，科学家们遇到了不少挑战，其中最主要的就是一直缺乏实时的、在线的分析方法，用于以病毒为直接产物或者病毒为载体的蛋白表达系统的研发和生产中。 现在，我们找到了一种检测病毒的新方法，应用 virotag 检测系统，只需要标记粗制或纯化后的样品，用 virus counter3100 6 min 即可获得高精度的病毒定量结果。 快速追踪生产体系中的病毒滴度的优势在于：*优化生产条件                    *提高产品得率*及时了解生产中的问题，避免损失  virocyt 通过技术创新，在数分钟内直接、特异性地进行病毒定量，远远胜于耗时、低精度的噬斑法、tcid50 等传统方法。利用荧光标记的高亲和力抗体，特异性识别目标病毒的特定抗原表位，既可以提高检测精度，也可以达到混合病毒中目的病毒鉴定的功能。 virus counter 3100 运用快速、免清洗标记程序进行病毒定量，so easy!  virotag workflow:  吸取 5ul virotag 加入到含有 195ul 病毒液的样品管中，混合避光孵育 30 min，上机检测即可！！ 流感病毒检测 三种 flu-a 菌株通过 sdbbuffer 稀释后，使用 virotag invx 染色，最后通过 virocyt 3100 进行分析。结果发现，三种菌株可以保持非常好的线性相关性。  流感病毒 virotag 的特异性检测 流感病毒 virotag(invx) 能特异性识别 flua，但不与腺病毒 3 和 5、杆状病毒等发生交联反应。  流感病毒 virotag 可识别流感病毒 vlp 流感病毒 virotag（invx）同样能识别表达血球凝集素蛋白（ha）的类病毒样颗粒（vlp）。  腺病毒检测 腺病毒 virotag（advx）特异性识别腺病毒，且随着稀释倍数，呈现良好的线性关系。advx 完全不结合流感病毒和慢病毒，在病毒计数仪 3100 上检测结果低于检测下限 5x10e5 vp/ml。   杆状病毒检测 杆状病毒 virotag 能特异性结合杆状病毒，通过病毒计数仪能对杆状病毒精确定量，且不受背景蛋白（3% 胎牛血清蛋白）的干扰。  virotag 可应用于生产的各个环节！  virotag 帮助您最大程度加速生产进程，提高病毒产量！更多信息，请联系我们。 联系电话：400-8816-128 产品信息： virotag invx 试剂盒（catalog no.vt-0004-0001）包括所有需要的试剂和消耗品，可通过 virocyt 3100 检测 200 个样品：        flu a- and flu b-reactive virotag label        sample dilution buffer (sdb)        inter-sample wash (isw)        cleanliness verification fluid (cvf)               performance validation standard (pvs)        startup/shutdown rinse(ssr)        sheath fluid        wash fluid        sample vials & caps  

ELISA引起高背景的原因有哪些？◆ 孵育时间和温度的改变。◆ 不恰当的洗涤。◆ 试剂被污染。◆ 孵育时酶标板被污染。◆ 盖板，容器或者枪头的重复使用。

ELISA是按照实验步骤进行测定的，但是没有任何信号，为什么？◆ 对于使用HRP底物的比色测定，终止液的加入会使底物变色。而说明书推荐的波长就是最适波长。◆ 通过轻拍酶标板的边缘充分混合孔内试剂。加入终止液的时，颜色由蓝变黄（如果是HRP底物）。如果加终止液之前孔内试剂没有混合，则底物颜色变绿。◆ 可能加入试剂的顺序错误。◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶标板。◆ 在连续稀释时确定已经加入标准品。◆ 如果底物系统中有两个成分，则必需混合均匀。◆ 确定酶标仪的使用和操作正确。◆ 确定试剂，标准品，样品都正确配制并按照说明滴加无误。◆ 对于高敏感性试剂盒，确定使用的底物和放大剂都正确稀释。

单克隆抗体大规模制备技术抗体制备技术大体经历3个发展阶段。第一阶段：利用高等脊椎动物制备抗血清即多克隆抗体制备技术；第二阶段：借助小鼠骨髓瘤细胞的发现以及细胞融合技术的发展建立起来的小鼠单抗制备技术；第三个阶段：随着基因测序以及基因文库筛选技术发展起来的重组抗体制备技术。第一阶段的多克隆制备技术通常不具有大规模制备抗体的潜力，而且制备的抗体组成成分复杂，实用性较差。第二阶段的单克隆抗体制备技术实质上是融合细胞株构建和发酵工程的综合应用，将抗体的制备从生物体内移动到发酵罐中，为抗体的大规模制备提供了基础。第三阶段的基因工程抗体，解决了传统单克隆抗体制备技术物种局限性的问题，为抗体大规模应用于医疗领域奠定了基础，同时为抗体大规模制备提供了更为高效和廉价的方式。cloud-clone corp.经过多年的努力，建立并拥有完整的单克隆抗体制备平台（如图所示）。1、建立在杂交瘤细胞基础上的单抗大规模制备平台普通实验通过细胞融合和筛选技术得到杂交瘤细胞，通常会通过制备腹水的方式进一步纯化获取单克隆抗体。但是通过这种方法制备的单抗一方面产量有限无法满足工业生产需要，另一方面还存在制备周期长、不确定因素多、失败率高、不同批次产品稳定性差等多方面的问题。技术专家通过微载体悬浮细胞培养技术、灌流式悬浮培养技术和固定化细胞培养技术，为实验室和工业级客户解决了单抗制备和生产中的一系列难题，使得短周期内获取“克”级的优秀单抗不再是梦。2、建立在重组表达基础上的单抗大规模制备平台传统的单抗制备技术，在很大程度上受制于骨髓瘤细胞在单抗制备中的应用。目前，能通过传统单抗制备技术大规模制备的单抗，还仅限于鼠单抗和兔单抗，对于其他物种单抗的制备却无能为力。技术专家通过噬菌体展示技术、核糖体展示技术、基因测序技术以及已有的抗体基因信息库，精准获取目的抗体的基因信息。借助原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒-昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统以及高密度细胞培养技术，为客户提供最为高效、稳定的重组单抗制备以及抗体改造服务。

微载体培养技术在抗体生产中的应用微载体培养技术是一种细胞大规模培养技术，通过搅拌培养液，使微载体悬浮，促使细胞在微载体表面增殖并成单层分布。微载体是指直径为60-250μm的微球，具有无毒性，密度均一等特点，可用于贴壁依赖性细胞贴附在微球表面单层生长，有效地扩增了细胞贴附面积，有利于大规模细胞的培养，常被用于生产疫苗，基因工程药物等。利用传统的抗体生产方案，如腹腔培养和摇瓶培养，无法满足工业级客户的抗体需求量（克级）。云克隆利用成熟的微载体培养技术和生物反应器系统，通过不断加入新鲜培养基并不断抽走含细胞代谢废物的消耗培养基，使杂交瘤细胞在相对稳定的生长环境内增殖，实现了杂交瘤细胞体外大规模高密度培养，并有效地提高了单位培养液中抗体的浓度，从而得到大批量的稳定的抗体产品，见图1。表1.单克隆抗体制备工艺比较腹腔培养传统细胞培养微载体悬浮培养费  用低高低抗  体效  价不稳定，重复性低稳定，重复性高稳定，重复性高抗  体产  量5-20mg/ml          (腹水:10-20ml)0.1-1mg/ml          (培养液:1l)1mg/ml           (培养液:3.5l)周  期10-15天3天3天动物福利伦理不符合符合符合仪  器————生物反应器系统动物病毒污染风险大无 无对比传统的细胞培养法和腹腔培养法，微载体培养技术优势明显，见表1。通过微载体培养技术的引入以及杂交瘤细胞“种子库”库存积累，云克隆可以源源不断地为工业级客户提供高品质且重复性佳的抗体产品。另外，我司的重组抗体产品也正在研制中，敬请期待！