SPA夹心ELISA实验检测CIC
金黄色葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SPA)可与IC中IgG的Fc段结合。将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上,再以酶标记的SPA与之反应,即可检测样本中有无IC。
1、试剂
(1)5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制;
(2)牛血清白蛋白(BSA)缓冲液:用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA;
(3)HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶(HRP)制成结合物,最适工作浓度以方阵法滴定;
(4)热聚合人IgG:人IgG 10mg/ml,63℃加热20min制成。
2、操作步骤
(1)用PBS稀释SPA成5Ps/ml,包被聚苯乙烯反应板微孔,每孔0.1ml(对照孔不包被),置4℃过夜后洗涤3次备用;
(2)待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀,4℃过夜后1600r/min离心20min,弃上清,沉淀用2.5%PEG洗2次,加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml,混匀,置37℃水浴30min,摇动,使完全溶解;
(3)将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中,置37℃60min,洗3次;各孔加底物溶液(OPD—H202)0.1ml,37℃ 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。置酶标仪492nm测各孔吸光值;
(4)标准曲线制备:取正常人血清0.2ml,加热聚合人IsC(120ug/ml)0.2ml,再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml,置4℃过夜。同时做不加热聚合人耽的正常血清对照,以排除血清中干扰因素。沉淀清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液(加等量0.01mol/LpH7.4PBS)1.6ml溶解并稀释成120、60、30、15、7.5ug/ml,与待测血清同法操作,制成工作标准曲线;
(5)结果判断:从待测血清吸光度值查标准曲线,即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC含量(ug/ml)。以高于正常对照X+2S,即大于28.4ug/ml为阳性。
3、注意事项
(1)热聚合人IgC应分装贮存于-20℃,不宜反复冻融,否则易解聚;
(2)PEG的浓度影响CIC沉淀量,须严格配制。
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