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技巧|ELISA高背景的分析
技巧|elisa高背景的分析
elisa实验过程中常常出现让人难以琢磨的结果。其中阴性对照出现高背景的情况也时有发生，这样导致结果不那么可性。出现高背景的原因可能如下。
1、抗体、抗体的浓度不合适
抗体质量不好，特异性不高可能会与封闭液（bsa）产生交叉反应，这点我遇到过，后来用0.8%的明胶代替，本底就很好了。
抗体亲和力不好，也会如此，由于加大了抗体的使用量，必然造成了非特异性增加的可能。
2、封闭液成分、封闭液的浓度、封闭时间
封闭液，如bsa可能与抗体发生交叉反应，导致背景偏高。
封闭液的浓度偏低，封闭时间过短，导致封闭不彻底，抗体与酶标板孔结合，也可能导致背景偏高。
3、孵育时间、孵育温度
孵育时间过长 、温度过高，也可能会导致非特异性结合增加，从而造成本底增高。
4、洗板液成分、洗板的时间
一般用pbs洗板就可以了，但有时候可以在洗板液中加入一些表面活性剂，如tween-20.
洗板的时间不足，会导致抗体残留，引起阴性对照显色。如果是机洗，可以改为手洗少量尝试，增加洗板时间。机洗一般没有手洗去除干净。
5、显色时间
由于系统优化不好，导致样品显色较弱，而延长了显色时间，这样一来导致阴性对照也有部分显色。此时，应该优化检测系统，调整包被物、检测抗体、底物等的浓度，缩短显色时间，显色一般不超过15min。
6、样品
样品中含有干扰物质。此时可以优化系统，调整其他检测抗体的比例，而增加样品的稀释度、增加洗脱步骤等。
7、elisa板的选择
聚苯乙烯制备的elisa板经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为elisa固相载体的一种，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
如下图，是分别使用两种不同厂家的elisa做的同一种实验，背景完全不一样。
此外，配制时间过久的cb包被液，也会使样品和阴性对照的od值稍微偏高，可能是由于放置太久，导致cb液的ph变化所致。
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