文献速递|Blue Pippin全自动DNA脉冲场电泳回收仪用于单分子蛋白组学识别技术开发

【Nature Nanotechnology】Single-molecule mechanical fingerprinting with DNA nanoswitch calipers

借助DNA纳米开关卡尺绘制单分子蛋白组学的机制“指纹”

从微量或痕量样本中鉴定生物分子是生物技术领域的一个长期目标。近些年，测序技术的迅速发展大大促进了DNA分析对基础研究和临床实践的推动。在蛋白质层面，其结构、功能相对复杂及无法实现体外扩增，尽管质谱法和质谱流式细胞技术等方法取得了一定进展，但是单分子蛋白质鉴定仍然面临挑战 。为此，来自哈佛大学威斯研究所（Wyss Institute at Harvard University）、哈佛医学院布拉瓦特尼克研究所（Blavatnik Institute at Harvard Medical School）和波士顿儿童医院（Boston Children 's Hospital）的科研人员，将DNA纳米技术与单分子力谱相结合，构建了一种DNA纳米开关卡尺（DNA Nanoswitch Caliper ，DNC），能够以原子分辨率测量单分子蛋白上的多个坐标。基于光镊技术，可以进行DNA和肽的绝对距离测量，精度可达埃米级。同时使用多重磁镊子，进行混合蛋白样本中相对丰度的量化检测。研究小组通过测量DNA标记残基之间的距离，对合成肽和天然肽进行了单分子指纹分析，并在异质群体中发现了不同蛋白修饰之间的区别。DNA纳米开关卡尺是一种功能强大且易于使用的工具，将在单分子蛋白质组学等领域实现新的应用。

期刊：Nature Nanotechnology

发表年份：2021年

样本：pET-26b (+) 质粒

应用：PCR产物纯化

图1. DNA纳米开关卡尺（DNC）绘制单分子指纹图谱示意图

DNA纳米开关卡尺（DNC）衍生于DNA纳米开关技术，其本质是一条DNA单链。在DNA单链上存在多个分子 “手柄”。当这些手柄中的两个相互结合时，会在DNA单链中形成闭环，且链的总长度缩短。当施加力量将手柄拉开时，DNA单链就会延伸恢复其原来的长度。链在开环和闭环状态下的长度差异反映了环的大小，进而反映了手柄之间的距离（图1）。在此基础上，通过将手柄设计成可以与生物大分子结合的单链，进而将该技术推进至生物大分子检测。手柄可以有效地将分子“夹在”中间，类似游标卡尺，通过测量DNA纳米开关在开环和闭环状态下的总长度差异，有效地测量生物大分子的大小，形成独特的分子指纹。

其中，DNA纳米开关卡尺是通过连接两个修饰的DNA构建体而产生的（图2）。一种DNA构建体由pET-26b（+）质粒的2820bp区域PCR扩增制备，另一种由环状寡核苷酸、5’-地高辛修饰的寡核苷酸（DNC1）和其他链（DNC2和DNC3），进行退火制备。在构建完成后，使用Blue Pippin全自动DNA电泳回收仪进行目标片段（约3kb）的精准回收，获得单一目标DNA纳米开关卡尺（DNC），无杂带，确保后续DNC指纹功能的正常发挥。

图2. DNA纳米开关卡尺（DNC）构建流程图

文中首先在单链DNA（ssDNA）分子上测试了DNC技术，证实DNC的开环和闭环状态之间的距离变化与目标分子的长度直接相关。这些长度变化可以用埃米级精度（比DNA双螺旋的宽度小10倍）来测量，从而能够识别小到一个核苷酸的长度变化。继而将研究重点转移到蛋白质上，通过已知序列的合成肽，发现手柄之间的距离都与肽中氨基酸长度的预期距离相匹配。同时检测一种名称为NOXA BH3的天然线性化肽时，也得到了类似的结果。更进一步研究表明，通过用一个磁镊子系统取代光学珠，能够对多个不同的肽进行平行测量，并确定不同分子的相对浓度。DNC提供了一种强大的方法用于表征纳米级复合物中的距离和几何形状，对蛋白质组学、纳米技术、结构生物学和药物发现等多个领域有很大的应用潜力。

原文

Shrestha, Prakash, et al. "Single-molecule mechanical fingerprinting with DNA nanoswitch calipers." Nature nanotechnology 16.12 (2021): 1362-1370.

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