Cas9辅助靶向测序检测林奇综合征相关基因PMS2的大片段倒位现象

SageHLS+Illumina：Cas9辅助靶向测序检测林奇综合征相关基因PMS2的大片段倒位现象

• 背景知识：

林奇综合征（Lynch Syndrome，LS）是一种常染色体显性遗传疾病，会导致直肠癌或其他部位罹患恶性肿瘤，约3%结直肠癌由LS引起，是最常见的遗传性结直肠癌综合征。

林奇综合症是因为错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM等）的胚系突变所诱发的。已有研究表明7号染色体上错配修复基因PMS2（band p22.1，如图1）的破坏性突变与两种遗传性癌症综合征有关：体质性错配修复缺陷（CMMRD）和林奇综合征（LS）。7号染色体上存在有15个PMS2假基因和覆盖PMS2基因3'部分（外显子9-15区域）的100kb低拷贝数重复序列（LCR，又称节段重复）。同时，反向LCR序列的第二个拷贝位于离着丝粒700kb的位置，与端粒拷贝（包含PMS2CL假基因）具有95%以上的同源性。虽然LCR间的倒位现象会导致PMS2基因活化突变，但因LCR之间相隔很远且序列同源性高，已有NGS测序方法无法对这种复杂的情况实现检测，亟需新的技术或方法对相关基因的大结构变异进行精准研究。

图1.hg38参考基因组中PMS2基因位置图

• HLS-Cas9辅助靶向测序实验方法：
  

利用来自the Ashkenazi trio（HG002、HG003、HG004）的Coriell细胞系样本，研究人员在体外用Cas9核酸内切酶靶向选择切割200kb的基因组DNA片段，并通过HLS-CATCH技术平台进行超长DNA片段回收。回收得到的200kb DNA片段，既横跨整个端粒LCR加上LCR两侧约50kb的独特侧翼序列，又包含整个未重排的PMS2基因，因此能够完成PMS2基因座的短读长测序，同时不会引起着丝粒LCR或PMS2假基因的并发问题。为了测试涉及LCR区域的倒位现象，使用不同的Cas9切割端粒LCR外的相同端粒近端位点，以及在着丝粒LCR内部约50kb的独特序列中的第二切割位点。第二次Cas9切割也将从倒位等位基因中释放出200kb长片段，测序reads与未重排等位基因不同的模式进行拼接，其中第二切割位点和着丝粒LCR边界之间的区域覆盖率很高，该区域距离未重排的PMS2基因的位置约650kb。

HLS-CATCH技术平台，是Sage Science 公司开发的SageHLS超长DNA片段回收仪结合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9辅助靶向染色体片段）技术构成。首先，将核酸装载到Sage HLS预制胶样品孔中进行电泳，完整的染色体DNA被截留在样品孔中；关闭电泳并加入用于切除大部分PMS2区域的Cas9复合物(如图2所示)；最后，消化产物通过仪器自带的脉冲场电泳实现纯化回收。继而qPCR定性定量检测回收产物，随后在Illumina测序仪上进行测序分析，测序分析结果见图3。

图2. HLS-CATCH技术平台

图3.目标片段测序覆盖情况

在基因组分析中，检测长片段的倒位仍然是一个难题，其他方法如Strand-seq（Falconer等人，2012）、超长纳米孔测序（Zhou等人，2020）和荧光标测技术（Lam等人，2012年），都需要专门的DNA提取和处理步骤。本应用中基于HLS-CATCH技术（SageHLS超长DNA片段回收仪结合CATCH（Cas9-assisted targeting of chromosome segments，Cas9辅助靶向染色体片段）），从细胞核（或细胞）中提取HMW DNA到Cas9酶切步骤全程自动化完成。酶切产物的片段大小直接从HLS-CATCH洗脱回收。鉴于短读长Illumina测序成功获取检测目标片段的详细情况，该方法也适用于其他由染色体重排、倒位、易位现象导致的疾病研究等。定制化基因组切割、片段大小筛选和短读长Illumina测序的高覆盖率分析运用，使其成为一种相对简单且具有成本效益的大片段倒位分析方法。

• NOTE：

Detection of large inversions involving the Lynch syndrome genePMS2 using Cas9-assisted targeted sequencing. Chris Boles,Tina Huang, Feng Chen, Sage Science, Inc., Beverly, MA.,Illumina, Inc., Foster City, CA.

美国Sage Science是全球领先的全自动DNA脉冲场电泳回收仪的生产厂家，拥有美国技术专利，各个型号产品可以高效完成不同长度范围的DNA片段的精准回收，广泛用于二代测序、三代测序以及多种分子生物学相关领域。

环亚生物科技有限公司作为美国Sage Science公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将Sage Science的产品线引入国内，一直为国内用户提供专业的全自动核酸片段回收仪的安装测试、应用培训，技术支持与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。环亚生物科技有限公司将一如既往的支持越来越多的Sage Science用户。

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