全自动DNA片段回收系统助力ddRAD-Seq测序进行大规模种群遗传多样性研究

Pippin系列全自动DNA片段回收系统助力ddRAD-Seq测序进行大规模种群遗传多样性研究

RAD-Seq（Restriction-site Associated DNA Sequence），对全基因组中处于限制性内切酶酶切位点附近的片段进行测序。RAD-Seq是开发单核苷酸多态性（SNPs）的高效方法，可用于遗传连锁图谱的构建、QTL定位、群体遗传分析等。

相比全基因组测序，RAD-Seq具有如下优势：

（1）大幅降低基因组复杂度；

（2）降低建库和测序成本；

（3）不受参考基因组的限制，研究物种范围更广泛；

（4）相同通量情况下，一次测序可检测更多样本，尤其适合群体遗传研究。

ddRAD-Seq是在传统RAD-Seq基础上发展而来的双酶切简化基因组测序技术，与RAD-Seq的主要区别在于，基因组DNA通过一个稀有限制性内切酶与一个常见限制性内切酶相结合进行双酶切，免去打断的步骤直接进行片段筛选后测序。

如图所示，对基因组进行双酶切并辅以酶切产物的片段大小筛选，得到的序列就是两端为不同酶切位点且长度接近的片段，如图中蓝色区域。a、b两处虽然也在不同的酶切位点之间，但因大小不符而被筛除。因此，ddRAD-Seq对DNA文库的筛选更为严格，在通量相同的情况下比单酶切法的测序深度更深，准确度更高，也能检测更多的样本，提高数据的利用率。

因此，构建ddRAD-Seq文库需要对酶切后的基因组DNA进行高精确度的片段筛选，传统的手工切胶难以达到准确度的要求，Sage Science公司的Pippin系统在此方面表现出强大的优势。

• 案例1：应用新方法的双酶切限制性位点DNA测序(ddRAD-Seq)进行更高效的SNP鉴定
  

2023年美国密西西比州立大学基因组学和生物技术研究所的科学家发表了一篇“应用新方法的双酶切限制性位点DNA测序(ddRAD-Seq)进行更高效的SNP鉴定”的方法学文章。新的方案提高了实验效率并减少了ddRAD-Seq的时长，为了证明其实用性，作者比较了新方案的SNP与来自全基因组重测序数据的SNP。结果表明，相比现有方法，改进的ddRAD-Seq方法在识别系统发育和关联遗传研究的单核苷酸多态性分析方面是可靠的，同时降低了成本和时间。

Fig 1. 改进的ddRAD-Seq实验方法流程图。(A)从基因组DNA提取到测序文库构建的过程。(B)构建的文库，经过Sage ELF片段筛选仪进行295—614 bp片段筛选，最后经Illumina Hiseq X Ten测序

在ddRAD-Seq测序文库制备过程中，使用Sage Science公司的Sage ELF高精度DNA片段分选回收仪对295-614bp的DNA片段，进行准确、高效地回收，确保Illumina测序在最佳片段范围内。

同时作者也提出嵌合体的存在会造成序列读取不匹配，为了尽可能减少嵌合体的存在，需要将文库大小控制在364-444 bp之间，推荐使用Sage Science公司的系列片段回收仪Sage ELF 或 Blue Pippin 作为DNA片段精准筛选回收方法。

• 案例2：ddRAD-seq技术用于大规模植物种群遗传多样性分析研究

文章是来自复旦大学的科研团队关于应用ddRAD-seq技术，用于大规模植物种群遗传多样性分析。作者开发了一个通用的计算工具，优化植物RAD-seq设计，并通过实验验证其有效性。优化的RAD-seq方法能够在文库构建过程中去除叶绿体DNA和rRNA基因，同时保持所需的覆盖均匀性和密度。

通过优化选择限制性酶切位点（REs），同时引入精确的DNA片段大小筛选回收技术，显著提高了RAD-seq的效率和准确性。整个建库过程中，在两个步骤上均使用Pippin Prep作为DNA片段大小筛选回收工具（上图左）。经过DNA片段筛选后，每一个测序文库超过90%的被测序片段都落在目标大小范围内（220—420 bp）（上图右）。

• 案例3：Pippin prep全自动DNA片段分选回收仪联合3RAD-seq技术，用于哥伦比亚红足龟的物种保护研究
  

  ‍

期刊：Molecular Ecology（IF5.2）

发表年份：2023年6月7号

物种：龟科——哥伦比亚红足龟

文库类型：基于3种限制性内切酶的简化基因组测序文库即3RAD-Seq文库

文库富集和精准回收：使用 Sage Science公司的Pippin Prep全自动DNA片段分选回收仪对350至450 bp之间的片段大小进行选择，在Illumina NovaSeq SP平台进行了文库测序。

• 案例4： Pippin prep全自动DNA片段分选回收仪联用ddRADseq技术，用于研究关键传粉媒介欧洲熊峰的基因渗入和适应特征
  

期刊：Molecular Ecology（IF 5.2 ）

发表年份：2023年

物种：欧洲熊峰bumblebee specimens (Bombus terrestris)

文库类型：ddRAD 文库，A single quaddRAD library

文库富集和精准回收：利用Sage Science公司的Pippin Prep全自动DNA片段分选回收仪制备quaddRAD文库，片段大小从450-550 bp精确回收，然后使用Illumina HiSeq 2500平台进行测序。

Sage Science公司的Pippin系列全自动DNA片段回收系统对于RAD-seq及ddRAD-seq方法在精确回收目标片段，提高测序效率、减少非目标序列的干扰上有重要帮助，是大规模种群遗传多样性分析、遗传连锁分析、关联映射、生态和进化研究领域的重要工具。可广泛用于生命科学、农、林、牧、渔等多方面研究。

• 文献：
  

1、Zenaida V. M et al. “Innovations in double digest restriction-site associated DNA sequencing (ddRAD-Seq) method for more efficient SNP identification” Analytical Biochemistry 662 (2023) 115001

2、Ning Jiang et al. “A highly robust and optimized sequence based approach for genetic polymorphism discovery and genotyping in large plant populations” Theor Appl Genet (2016) 129:1739–1757

3、Natalia GG, Mario VR, H. Bradley Shaffer,et al. "The importance of cryptic diversity in the conservation of wide-ranging species: The red-footed tortoise Chelonoidis carbonarius in Colombia" Molecular Ecology, 2023;32:4531–4545.

4、Paolo F, Carmelo F, Thomas J., et al. "Limited introgression from non-native commercial strains and signatures of adaptation in the key pollinator Bombus terrestris." Molecular Ecology, Volume32, Issue21 November 2023 Pages 5709-5723

美国Sage Science是全球领先的全自动DNA脉冲场电泳回收仪的生产厂家，拥有美国技术专利，各个型号产品可以高效完成不同长度范围的DNA片段的精准回收，广泛用于二代测序、三代测序以及多种分子生物学相关领域。

环亚生物科技有限公司作为美国Sage Science公司在中国区的独家代理商，自2011年以来将Sage Science的产品线引入国内，一直为国内用户提供专业的全自动核酸片段回收仪的安装测试、应用培训，技术支持与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。环亚生物科技有限公司将一如既往的支持越来越多的Sage Science用户。

▼更多 Pippin系列 产品详情，请联系我们▼

环亚生物科技有限公司

地址：上海市松江区莘砖公路518号9幢502室

电话：021-54583565

邮箱：info@apgbio.com

网址：www.apgbio.com

▼更多精彩内容，请扫码关注我们▼