Orflo快速流式细胞仪助力新型基因编码钙指示剂的研究

钙离子(Ca2+)是机体各项生理活动不可缺少的离子，是细胞内重要且广泛存在的第二信使。监测活细胞内钙水平，对探究生物活动相关的信号机制及规律至关重要。传统的合成钙指示剂，使用方便、可靠性高、动态范围广、光谱化学特性多样。经过优化的基因编码钙指示剂(GECIs)，在许多应用中可与其效果相媲美，尤其是GECIs表达稳定，可有效降低试剂成本，简化分析过程，比合成钙指示剂更有优势。

来自Janssen研发有限责任公司的Nyantsz Wu等人，构建了一个稳定表达GCaMP6s的克隆细胞系，并通过流式细胞仪(flow cytometry)和荧光成像(FLIPR)等技术，对荧光基因编码钙指示剂GCaMP6s与合成钙指示剂fluo-4进行了性能比较，相关研究以“High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator”为题，发表在《Scientific Reports》上。

实验中，采用美国Orflo公司的Moxi GO II流式细胞仪进行流式细胞实验，通过488nm激发激光和525/45nm发射滤光片，配合PMT检测荧光强度，采用Coulter法测定细胞大小，直径小于9微米的细胞被认为是碎片，排除在计数数据之外。

首先，流式细胞实验对GCaMP6s与fluo-4的荧光光谱进行分析，比较fluo-4标记293-F细胞与用pGP-CMV-GCaMP6s转染 24小时的细胞的荧光强度（图1. a-c）

图1. 流式细胞实验对数变换荧光强度直方图. (a)未标记细胞，(b)瞬时表达pGP-CMV-GCaMP6s，(c)标记fu -4的细胞

（用缓冲液(红色)或10μM钙离子通道载体(蓝色)处理细胞）

然后，基于共聚焦显微镜和流式细胞仪，对GCaMP6s与fluo-4分别处理的细胞内钙离子变化进行可视化分析（图2）。

图2. 用GCaMP6s(a-c)和fluo -4(d-f)分别标记的稳定表达GluA 1o -γ4 293-F细胞共聚焦图像和流式细胞术检测结果(c,f)悬浮细胞流式细胞术荧光强度直方图：CP-465022(红色)，谷氨酸+ LY-395153(橙色)，钙离子通道载体(蓝色)

最后，对流式细胞实验结果进行总结（表）。在每次实验中，测量所有直径大于9μm细胞的计数平均值(运行1,800-11,000个细胞)。数据以每次结果的平均值±标准差表示，实验次数用括号表示。细胞处理为CP-465022 (FCP);谷氨酸+LY-395153 (FPAM);钙离子通道载体 (Fiono)。ΔF为(FPAM -FCP)或(Fiono -FCP)。

通过流式细胞实验可以直接比较两种荧光指示剂的荧光强度。FLIPR（高通量实时荧光检测）实验测量大约10,000至20,000个细胞的总荧光强度，可以通过流式细胞仪测量大约10,000个细胞的算术平均值来模拟。研究人员发现，GCaMP6s标记的细胞在总荧光输出上比fluo-4标记的细胞低，但足以在FLIPR实验中提供稳健的反应。

作为一种新型的荧光基因编码的钙指示剂，GCaMP6s具有高亲和力、高表达量，不需要额外的染料加载，降低试剂成本，在细胞内Ca2+浓度变化的监测上显示出与fluo-4相当的动态范围和响应特性。此外，GCaMP6s还可以通过标准的分子生物学技术进行改造，以适应特定的实验需求。文章认为GCaMP6s是一个有前景的新型工具，作为合成钙指示剂的替代品，可以用于各种细胞生物学和药理学研究，尤其是在需要高通量筛选的现代药物发现领域。

在这项研究中，Moxi GO II作为一个实验工具，即开即用，操作简便，对于实现快速、准确的细胞内钙离子水平检测至关重要，对评估GCaMP6s这一遗传编码钙指示剂的性能和应用潜力具有重要意义。

美国Orflo Technologies公司将行业公认的细胞计数金标准——库尔特原理(Coulter Principle)，与荧光流式检测技术相结合，推出的新一代快速流式细胞仪——Moxi GO II，提供超准确的细胞计数、细胞活率检测，以及超高分辨率的细胞粒径测量。库尔特原理对颗粒个体进行逐个三维测量，不但能准确测量颗粒的粒径分布，更能进行粒子绝对数目和浓度的测量。由于检测时不受激光衍射、散射因样本颜色或浓度变化的影响，库尔特原理所测粒径大小更接近真实。

Moxi GO II快速流式细胞仪，采用库尔特原理进行细胞计数和粒径测量，同时采用488nm激光光源，结合两个PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根据需要更换），进行细胞活率、细胞凋亡、转染效率、活性氧簇、线粒体膜电位等常规流式检测。仪器设计小巧轻便，无需预热，开机即用，预设程序，触屏操控，运行后10秒即可给出测试结果，使用后也无需清洁维护。无论是经验丰富的流式专家，还是初试身手的实验小白，Moxi Go II都可以助您轻松完成实验。

美国Orflo Technologies公司是一家非常专业的细胞分析仪器研发和制造企业，拥有多项专利技术，产品以库尔特原理的高精细胞计数仪和超快流式细胞仪为主。

环亚生物，生命科学产品全国性代理商，不断把国外顶级的创新产品引入中国。环亚生物具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。作为Orflo Technologies中国地区独家代理，环亚生物科技有限公司全权负责Orflo Technologies产品在中国地区的推广、销售，为广大用户提供专业的技术咨询和产品服务。

更多资讯请访问文献全文链接：

https://doi.org/10.1038/s41598-019-49070-8

▼更多 Orflo 产品详情，请联系我们▼

环亚生物科技有限公司

地址：上海市松江区莘砖公路518号9幢502室

电话：021-54583565

邮箱：info@apgbio.com

网址：www.apgbio.com

▼更多精彩内容，请扫码关注我们▼