Regemat 3D生物打印机助力皮肤相关的生物墨水开发

环亚生物

2024/08/14 13:51

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近些年，生物3D打印技术广泛应用于皮肤组织修复工程，即利用如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、果胶、透明质酸和细胞外基质（extracellular matrix ，ECM）等各种不同的生物墨水，开发和人体皮肤具有类似甚至相同机械特性、组织结构和细胞活性的人造皮肤，将其用于创伤修复、药物开发和基础研究等。然而，现有生物墨水所构建的人造皮肤无法满足实际应用要求。

葡萄牙波尔图大学卫生和创新研究所的科研团队于2024年在《Biomimetics》杂志发表了文章《Bioinspired and Photo-Clickable Thiol-Ene Bioinks for the Extrusion Bioprinting of Mechanically Tunable 3D Skin Models》。在该文中，作者利用果胶、多肽、甲基丙烯酸、CaCl2、人成纤维细胞作为生物墨水材料，构建了一种新型皮肤细胞模型，并测试机械性能、组织相容性等指标，为开发更理想的人造皮肤提供了新的研究依据。

实验流程

1.以果胶作为主要成分构建生物墨水

果胶是一种具有优异组织相容性的天然多糖，添加不同比例的甲基丙烯酸酯后形成甲基丙烯酸果胶（pectin methacrylate，PECMA）。PECMA可以与特定肽序列中的半胱氨酸残基在光照的情况下发生硫醇-烯反应光交联；另一方面和CaCl2中的钙离子结合，实现离子交联，对墨水流变性能进行调节，达到与天然真皮类似的机械性能。（图1 a和b）

2.将制备好的PECMA和人的真皮成纤维细胞混合为待打印的生物墨水，通过西班牙Regemat 3D公司的Bio V1 3D生物打印机，按预先设定程序打印成特定结构，并在紫外光下交联40秒，形成稳定的共价结合网络，实现与皮肤类似的机械性能与生物活性。培养7天后，将人角质形成细胞（HaCaT细胞）接种在该皮肤模型上，建立双层皮肤结构（图1 c）。

图 1.生物墨水设计和3D皮肤模型打印流程示意图。（a）使用甲基丙烯酸酯对果胶进行化学改性，产生甲基丙烯酸果胶（PECMA），甲基丙烯酸酯用于光交联，羧基用于与钙结合

（b）通过聚合物主链中的甲基丙烯酸酯和肽序列中的半胱氨酸（突出显示为绿色）之间的硫醇-烯反应，实现水凝胶生物功能化（c）第一步，由PECMA聚合物和定制的肽序列制备一种光交联生物墨水，并通过添加氯化钙进行离子交联来调节其流变性，然后混合和均质化以获得物理交联的生物墨水；第二步，在生物墨水中加入真皮成纤维细胞并用Regemat 3D生物打印机打印成预设的真皮模型，并进行体外培养7天；第三步，将HaCaT细胞接种到真皮模型上，体外培养7天；第四步，体外培养7天，待后续检测

实验结果

1．用紫外光照射40秒（光交联）后，添加了肽交联剂的墨水具有814.0±129.1Pa的弹性模量；而未添加肽交联剂的墨水没有建立足够密度的共价键，导致培养基中水凝胶结构的完整性迅速丧失。然而，如果将光照时间延长到60秒，即使没有肽交联剂，也可以形成稳定的水凝胶结构。该结果说明，在肽交联剂存在的情况下，二级水凝胶交联主要通过阶梯生长机制进行，反应速率和形成水凝胶结构的效率更快。

2．在不同硬度的水凝胶中，成纤维细胞的生长状态有显著差异。在低硬度水凝胶中，细胞扩散和细胞间接触的能力明显高于中等硬度和高硬度的水凝胶。说明水凝胶的硬度，影响成纤维细胞在模拟真皮模型中生长以及形成类似真皮结构的过程。

3．将HaCaT细胞接种在真皮模型并培养28天后，评估关键标记物的位点特异性表达，免疫组化结果显示：该皮肤模型呈现出预想的双层结构，上层为表皮（角质形成细胞），下层为真皮（真皮成纤维细胞）。这种结构与天然皮肤类似，未来可以考虑用于替代天然皮肤（图2）。

图2 生物打印 3D 皮肤模型（a）具有圆形和方形形状的双层皮肤模型图示，以及培养28天后它们的结构完整性（比例尺顶部：2.5毫米;比例尺下：5毫米）。（b）皮肤模型的免疫染色图示（Epidermis表皮层：细胞角蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）;真皮层Dermis：波形蛋白（红色）和细胞核（蓝色）;比例尺：100μm））。