Molecular Devices 如何优化Paradigm多功能酶标仪进行荧光偏振检测试

如何优化SpectraMax Paradigm多功能微孔板检测仪进行Transcreener荧光偏振检测试验
 
简介
这篇文章主要描述了当使用Molecular Devices公司推出的SpectraMax® Paradigm® 微孔板检测仪检测Bellbrook 实验室的Transcreener荧光偏振系列试剂盒时，如何对仪器参数进行优化，以满足其验证要求。
 

• Transcreener ADP2 FP (3010)

• Transcreener AMP/GMP (3006)

• Transcreener UDP FP (3007)

• Transcreener GDP FP (3009)

 
Transcreener高通量筛选试验是基于对体系内数千种不同细胞酶在催化底物时获得ADP后，检测其ADP含量的一种通用性，高通量生化检测平台。这些酶中的大部分能催化细胞信号通路中的共价反应，是药物筛选的高价值靶点。Transcreener 荧光偏振试验采用单步、免疫竞争法，直接检测标记有远红外荧光示踪分子的核苷酸偏振值，其所有试验的检测试剂均由远红外荧光示踪分子与高特异性的单克隆或多克隆抗体结合而成，原理是在靶标酶催化底物后，所产生的核苷二磷酸或者单核苷酸竞争性的取代了抗体连接的远红外荧光示踪分子，其远红外荧光示踪分子的旋转自由度增高，导致荧光偏振现象的减弱（如图1），使用远红外荧光示踪分子可以有效降低荧光化合物和光散射的干扰，Transcreener 荧光偏振试验均采用一步添加，混匀既读的方式，特别适合高通量筛选。
 
Transcreener 荧光偏振试验原理（图一）

SpectraMax Paradigm多功能微孔板检测仪采用灵活的卡盒式设计，可以针对不同试验实验类型选择最适合的检测卡盒以获得最佳检测结果，仪器所具有双光电倍增二极管（PMT）能够同时工作，用以检测荧光偏振信号值，做到在不降低检测灵敏度的同时提高其检测速度。仪器不但可以支持1536孔板且能够与MD公司推出的StakMax®堆板机进行整合，大大增加了检测的速度和通量。针对Transcreener荧光偏振试验的特点对仪器进行优化设置后，SpectraMax Paradigm多功能微孔板检测仪的表现完全超过了试验本身对仪器性能的要求。
 
验证标准
为了发挥Transcreener高通量筛选检测试验的优势，其中关键性因素是如何对微孔板检测仪进行参数上的设置和优化，无论是针对那种类型的检测试验，正确的参数设置和优化都会增加其检测的灵敏度。为了找到适合Transcreener高通量筛选试验的最佳参数设置，我们做出24条重复的模拟10uM ATP/ADP酶的反应过程的标准曲线。起始浓度为10uM ATP，其中ADP含量的增加与ATP含量的减少是成一定的比例关系，维持总腺嘌呤核苷酸浓度在10uM左右。通过改变不同的检测时间(Integration time)来满足其试验Z值>0.5的要求，验证一台仪器是否能够满足Transcreener荧光偏振试验的要求，在10uM ATP的转化率为10%的情况其Z值>0.7且ΔmP > 120。
 
材料

• ATP/ADP混合物-4 mM MgCl₂、2 mM EGTA、50 mM HEPES、pH 7.5、1% DMSO

0.01% Brij-35和ATP/ADP（腺嘌呤浓度为10uM）

• ADP检测混合物-1x终止&检测缓冲液B、4 nM ADP Alexa633示踪分子和14.8 ug/ml ADP²抗体

• 单示踪分子-1x终止液&检测缓冲液B和4 nM ADP Alexa633示踪分子

• 空白缓冲液-1x终止液&检测缓冲液B和14.8 ug/ml ADP²抗体

 
详细的检测步骤，包括准备制作标曲、请参照Transcreener技术手册(http://www.bellbrooklabs.com/transcreener_hts_assays.html)
 
方法
试验准备
步骤一：将10ul的ATP/ADP化合物分别加入384孔板的每行中
步骤二：在这些行中加入10ul ADP混匀
步骤三：加入10ul的10 μM ATP/0 μM ADP化合物于384孔板的行P中
步骤四：在P1-P12行中的每孔中加入10ul的单示踪分子
步骤五：在P13-P24行中的每孔中加入10ul的空白缓冲液
仪器设置

 
SpectraMax Paradigm微孔板检测仪由SoftMax® Pro 软件控制，可以在其软件模板库中选择此试验类型的模版文件并更改其具体的参数设置。
 
步骤一：打开SoftMax Pro操作软件，点击‘Protocol Manager’选项，在其‘Protocol Library’即模版库中选择预先设置好的模版，在‘Paradigm Protocol’文件夹下选择‘FP Rhodamine’模版
步骤二：点击软件左侧导航树的‘Plate01’后，再点击右侧的‘Settings’即设置按键（齿轮状图标），出现设置对话框
步骤三：选择Alexa Fluor633 荧光偏振卡盒
步骤四：检测模式选择‘FP’即荧光偏振模式，检测类型选择‘Endpoint’即终点法
步骤五：卡盒已固定其检测波长，无需再设置
步骤六：点击‘Plate Type’后选择‘384 wells’微孔板类型，然后选择‘384 Well
Corning low vol/rndbtm’
步骤七：点击‘Read Area’选择微孔板检测区域（孔）
步骤八：点击‘PMT and Optics’选择‘Off – Stop and Go’或‘Performance – On the fly’读取速度模式
步骤九：如果选择Stop and Go模式时，在‘integration time’ 处输入20ms或者更高数值，延长时间可以获得更好的结果，但是会延长检测时间
步骤十：如果已知最佳检测高度，直接输入即可，当采用新试验或者新微孔板时，应该重新进行高度优化设置，高度优化前的原始值为1mm，进行优化后，新的高度值会取代原始值
步骤十一：点击‘More Settings’，选择以行或者列的方式来确定检测顺序
步骤十二：选择‘Show Pre-Read Optimization Options’
步骤十三：点击‘OK’键后关闭设置对话框
步骤十四：点击‘Read’按键，屏幕中央会出现一个优化选择对话框，针对新试验需重新进行微孔板优化和检测高度的优化
 
结果
样品荧光偏振标准曲线
反应过程中，伴随着ADP含量的增加，其与ATP比例发生变化，与抗ADP抗体结合的示踪分子减少，导致了反应体系中荧光偏振信号值降低，SpectraMax Paradigm针对此试验中所给出的15个数据点进行检测后，得出数值后自动拟合生成标准曲线。
  
试验验证参数（图2）


 
A：模拟10uM ATP转化至ADP时标准曲线的Z值和Δ mP值；B：当微孔板检测仪设置为100ms检测时间，放大标准曲线视图，ADP浓度范围在0-3uM之间时显示出验证Z值的最少数据点（红色虚线）和验证Δ mP值的最少数据点(水平黑色虚线)，也显示出10%ATP转化验证点（垂直黑色虚线）
 

结论
此篇应用文验证了Molecular Devices推出的SpectraMax Paradigm多功能微孔板检测仪能够满足Transcreener荧光偏振检测试验对仪器性能的要求，我们对仪器参数进行设置和优化后，可以在1分钟以内获得相应值（Z值>0.7和Δ mP > 120），当延长检测时间时，其结果远超过最低验证最低要求，当使用‘on-the-fly’飞行检测模式时，仍能满足试验需求且检测时间小于1分钟。
 
致谢
Molecular Devices公司对Bellbrook实验室的Meera Kumar女士的大力协作表示衷心的感谢