【应用文章下载】SNP基因分型高通量检测方法新思路Molecular Devices

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2018/05/11 10:48

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SNP基因分型高通量检测方法新思路
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。单核苷酸多态性是基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。近年来，单核苷酸多态性研究备受关注。由于个体间核苷酸序列存在很大差异，SNP的数量几乎是无限的，且每个SNP可能是潜在的有用标记。SNP标记的潜力已在人类基因分型中得到很好的展示。虽然此技术广泛应用于人类和动物基因组分析，但在植物上仍处于起步阶段，目前在水稻、玉米、大豆等作物研究中应用较多。研究表明，作物基因组序列均含有丰富的SNP，对其进行SNP研究，有利于揭示作物生长发育规律，而新的检测技术也促进了以SNP 为核心的高通量基因分型技术的发展，极大地推动了农作物在遗传、种质鉴定和功能基因的克隆与鉴定、分子育种等方面的研究。随着SNP研究的日益增多，相关的检测技术也层出不穷，竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）便是其中之一，可在广泛的基因组DNA 样品中（甚至是一些复杂基因组的DNA 样品），对SNP和特定位点上的插入、缺失进行精准的双等位基因判断，此方法利用2个荧光探针、2个通用淬灭探针，再加多个位点特异探针来检则多个SNP位点，原理上类似Taqman检测，也是基于终端荧光读取判断，每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型，但与Taqman技术不同的是，它不需要每个SNP位点都去合成特异的荧光引物，基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了KASP的试剂成本，比Taqman具有更好的位点适应性，所以在医学、农学检测方面都有非常好的应用。 KASP方法的样品一般可放于多孔板中如96孔板，非常适合在具有荧光检测功能的酶标仪上进行荧光信号的读取，以下便是在SpectraMax i3x和SpectraMax M5e酶标仪中读取KASP样品产生的荧光信号后所绘制的散点图：


上左图：FAM、HEX和两者的混合物的相对荧光强度与ROX进行标准化且标准化值在SoftMax Pro软件中绘制散点图。如图所示，得到了三个不同的集群。上右图：ROX标准化的DNA扩增样品荧光在SoftMax Pro软件中绘制散点图。三个显著的集群被检测出来。FAM纯合子位置靠近X轴，而HEX纯合子则位置靠近Y轴，包含FAM和HEX的杂合样品所形成的的集群在两个纯合子集群之间。无模板对照形成的集群靠近坐标0点位置。所得数据与供应商验证试剂盒基因分型结果高度一致。

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