【飞诺美色谱】ADC药物中的聚集体分析

概述

由于ADC的药物偶联的小分子具有一定的疏水性， 在生产过程或者储存过程中形成聚集体的倾向有所增加。 因此，在放行检测测试和稳定性检测中，都需要精确和 有效的方法来测量聚合和碎片。

体积排阻色谱法（SEC）是用于表征蛋白聚集体的 标准方法，一般使用磷酸盐缓冲液作为洗脱溶剂。但使 用水性流动相对 ADC药物 进行 SEC 分析时，往往得到 的峰形不佳，且聚集体和单体之间的分离度不佳。这可 能是疏水性的小分子毒药和固定相之间的非特异性相互 作用引起的。为解决这个问题，我们会往 SEC 流动相 中添加少量有机改性剂。但有机改性剂也增加破坏聚集 体或者造成色谱柱寿命缩短的风险。因此采用具有高亲 水性键合相和高惰性的柱硬件的SEC柱就显得尤为重要， 因为高惰性的表面会大大减小ADC分子和色谱柱填料和 柱硬件之间的次级相互作用，从而确保色谱峰获得良好 分离且峰形尖锐，且尽可能减少或者避免添加任何有机 改性剂。

Trastuzumab deruxtecan（DS-8201；ENHERTU®) 是由第一三共和阿斯利康合作开发的新型HER2靶向 ADC。Deruxtecan是毒性药物DX-8951 的衍生物 (Dxd) 和连接子马来酰亚胺-GGFG 肽的偶联物。

本应用使用Biozen 的200A孔径的dSEC-2 色谱柱对 DS-8201 进行聚集体分析。分别考察了两种规格（3um， 7.8mm*300mm 和1.8um，4.6mm*150mm）的分离结 果。

关键词

聚集体；DS-8201；SEC；Biozen dSEC-2；BioTi

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Thermo U3000高效液相色谱仪

3.1.2试剂材料

磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾为分析纯， 乙腈为色谱纯，屈臣氏蒸馏水

3.1.3样品

Trastuzumab- deruxtecan购自第一三共，DAR 值为8。用纯水稀释为浓度为1.0 mg/mL;

Deruxtecan购自MCE，浓度为10.34mg/mL，用 50%乙腈逐级稀释至0.01mg/mL。

3.2色谱条件

色谱柱1：Biozen dSEC-2（3um，200A 300*7.8mm）；P/N: 00H-4788-K0；

色谱柱2：Biozen dSEC-2（1.8um，200A 150*4.6mm）；P/N: 00F-4787-E0；

流动相A相：200mM磷酸钾缓冲液+200mM氯 化钾 pH 6.2；

流动相B相：乙腈；

流 速1：0.8 mL/min；

流 速2：0.3 mL/min

柱 温：30 ℃；

波 长：280nm；

进样量：10 μL（柱1）；5μL（柱2）

梯度程序见表2：

3.3结果与讨论

3.3.1 有机改性剂的比例和选择

选择分析抗体类蛋白常用的磷酸盐缓冲液作为 流动相对DS-8201进行聚集体的分离时，发现主峰峰 形总体来说较为正常，略微拖尾，推测因为小分子 药物的疏水性和ADC中存在的异质性分子导致，聚集 体和主峰分离度为2.06。随后，我们逐步加入不同比 例的有机改性剂，发现当乙腈的添加比例达到10%的 时候，聚集体的检出百分比最高，主峰不对称度为 1.28。当进一步增加乙腈的浓度到15%时，主峰拖尾 进一步减小，但峰高，聚集体响应和分离度都略有 降低。当用异丙醇作为有机改性剂，我们发现色谱 柱背压较乙腈有明显的增高，所以将流速适当调低。 具体结果参见表3。

3.3.2 DS-8201、曲妥珠单抗和Deruxtecan的保留时 间对比

因为Deruxtecan上含有肽键，所以在214nm下有 紫外吸收，因此在该波长下可以观察到DS-8201、曲 妥珠单抗的保留时间基本相同，大约在9.6min； 14.0min左右为buffer峰。Deruxtecan在15.1min左右 出峰，可以和DS-8201以及buffer很好的分离。

3.3.3 色谱柱规格和通量的对比

本实验观察了1.8um，4.6*150mm（UPLC高通量） 和3um，7.8*300mm（HPLC）两种不同规格dSEC-2 柱的结果。详见表4。

可以看到使用1.8um粒径的dSEC-2柱时，柱长从 HPLC的300mm缩短为150mm，仍然可达到聚集体和 片段的分离，分析时间从原来的20min一针缩短到 10min一针。可以使分析通量提高一倍。4.6mm小内 径的色谱柱也可以节约样品的，减少上样量，相同 的上样量，小内径色谱柱的色谱峰高为常规7.8mm 内径的2倍。

但是在使用1.8um小粒径SEC的时候有一点需要 提醒的是为了达到柱效的最大化，需要在UPLC仪器 上使用，因为UPCL的管路死体积足够小。而4.6mm 内径的SEC柱对于仪器的柱前体积非常敏感，死体积 可以引起色谱峰展宽，从而掩盖碎片的分离。

结论

在本应用使用了Biozen dSEC-2 200Å 的SEC色谱 柱，对于ADC药物的聚集体进行分析。同时考察了 适合于HPLC和UPLC两种仪器平台的色谱柱，结果表 明都可以对聚集体和碎片进行良好的分离。HPLC SEC是一种抗体类蛋白聚集体检测的稳健方法可以用 于QC放行；而UPLC SEC则可以大大提高实验通量， 特别适合于早期研发阶段样品量大的情况，节约研 发人员的时间。

Biozen dSEC-2的高亲水性改性的硅胶修饰技术 使得和ADC分子的次级作用得到改善，方法开发简单， 使用乙腈作为有机改性剂可以获得较低的背压，对 色谱柱更加友好。另外，dSEC-2特有的孔控制技术 也使得这款色谱柱具有柱床稳定，耐压，批次重现 性好的特点。