概述
由于ADC的药物偶联的小分子具有一定的疏水性, 在生产过程或者储存过程中形成聚集体的倾向有所增加。 因此,在放行检测测试和稳定性检测中,都需要精确和 有效的方法来测量聚合和碎片。
体积排阻色谱法(SEC)是用于表征蛋白聚集体的 标准方法,一般使用磷酸盐缓冲液作为洗脱溶剂。但使 用水性流动相对 ADC药物 进行 SEC 分析时,往往得到 的峰形不佳,且聚集体和单体之间的分离度不佳。这可 能是疏水性的小分子毒药和固定相之间的非特异性相互 作用引起的。为解决这个问题,我们会往 SEC 流动相 中添加少量有机改性剂。但有机改性剂也增加破坏聚集 体或者造成色谱柱寿命缩短的风险。因此采用具有高亲 水性键合相和高惰性的柱硬件的SEC柱就显得尤为重要, 因为高惰性的表面会大大减小ADC分子和色谱柱填料和 柱硬件之间的次级相互作用,从而确保色谱峰获得良好 分离且峰形尖锐,且尽可能减少或者避免添加任何有机 改性剂。
Trastuzumab deruxtecan(DS-8201;ENHERTU®) 是由第一三共和阿斯利康合作开发的新型HER2靶向 ADC。Deruxtecan是毒性药物DX-8951 的衍生物 (Dxd) 和连接子马来酰亚胺-GGFG 肽的偶联物。
本应用使用Biozen 的200A孔径的dSEC-2 色谱柱对 DS-8201 进行聚集体分析。分别考察了两种规格(3um, 7.8mm*300mm 和1.8um,4.6mm*150mm)的分离结 果。
关键词
聚集体;DS-8201;SEC;Biozen dSEC-2;BioTi
实验部分
3.1仪器、试剂与材料
3.1.1主要仪器设备
Thermo U3000高效液相色谱仪
3.1.2试剂材料
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾为分析纯, 乙腈为色谱纯,屈臣氏蒸馏水
3.1.3样品
Trastuzumab- deruxtecan购自第一三共,DAR 值为8。用纯水稀释为浓度为1.0 mg/mL;
Deruxtecan购自MCE,浓度为10.34mg/mL,用 50%乙腈逐级稀释至0.01mg/mL。
3.2色谱条件
色谱柱1:Biozen dSEC-2(3um,200A 300*7.8mm);P/N: 00H-4788-K0;
色谱柱2:Biozen dSEC-2(1.8um,200A 150*4.6mm);P/N: 00F-4787-E0;
流动相A相:200mM磷酸钾缓冲液+200mM氯 化钾 pH 6.2;
流动相B相:乙腈;
流 速1:0.8 mL/min;
流 速2:0.3 mL/min
柱 温:30 ℃;
波 长:280nm;
进样量:10 μL(柱1);5μL(柱2)
梯度程序见表2:
3.3结果与讨论
3.3.1 有机改性剂的比例和选择
选择分析抗体类蛋白常用的磷酸盐缓冲液作为 流动相对DS-8201进行聚集体的分离时,发现主峰峰 形总体来说较为正常,略微拖尾,推测因为小分子 药物的疏水性和ADC中存在的异质性分子导致,聚集 体和主峰分离度为2.06。随后,我们逐步加入不同比 例的有机改性剂,发现当乙腈的添加比例达到10%的 时候,聚集体的检出百分比最高,主峰不对称度为 1.28。当进一步增加乙腈的浓度到15%时,主峰拖尾 进一步减小,但峰高,聚集体响应和分离度都略有 降低。当用异丙醇作为有机改性剂,我们发现色谱 柱背压较乙腈有明显的增高,所以将流速适当调低。 具体结果参见表3。
3.3.2 DS-8201、曲妥珠单抗和Deruxtecan的保留时 间对比
因为Deruxtecan上含有肽键,所以在214nm下有 紫外吸收,因此在该波长下可以观察到DS-8201、曲 妥珠单抗的保留时间基本相同,大约在9.6min; 14.0min左右为buffer峰。Deruxtecan在15.1min左右 出峰,可以和DS-8201以及buffer很好的分离。
3.3.3 色谱柱规格和通量的对比
本实验观察了1.8um,4.6*150mm(UPLC高通量) 和3um,7.8*300mm(HPLC)两种不同规格dSEC-2 柱的结果。详见表4。
可以看到使用1.8um粒径的dSEC-2柱时,柱长从 HPLC的300mm缩短为150mm,仍然可达到聚集体和 片段的分离,分析时间从原来的20min一针缩短到 10min一针。可以使分析通量提高一倍。4.6mm小内 径的色谱柱也可以节约样品的,减少上样量,相同 的上样量,小内径色谱柱的色谱峰高为常规7.8mm 内径的2倍。
但是在使用1.8um小粒径SEC的时候有一点需要 提醒的是为了达到柱效的最大化,需要在UPLC仪器 上使用,因为UPCL的管路死体积足够小。而4.6mm 内径的SEC柱对于仪器的柱前体积非常敏感,死体积 可以引起色谱峰展宽,从而掩盖碎片的分离。
结论
在本应用使用了Biozen dSEC-2 200Å 的SEC色谱 柱,对于ADC药物的聚集体进行分析。同时考察了 适合于HPLC和UPLC两种仪器平台的色谱柱,结果表 明都可以对聚集体和碎片进行良好的分离。HPLC SEC是一种抗体类蛋白聚集体检测的稳健方法可以用 于QC放行;而UPLC SEC则可以大大提高实验通量, 特别适合于早期研发阶段样品量大的情况,节约研 发人员的时间。
Biozen dSEC-2的高亲水性改性的硅胶修饰技术 使得和ADC分子的次级作用得到改善,方法开发简单, 使用乙腈作为有机改性剂可以获得较低的背压,对 色谱柱更加友好。另外,dSEC-2特有的孔控制技术 也使得这款色谱柱具有柱床稳定,耐压,批次重现 性好的特点。
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